R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) ve P30EY014104: Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numaraları altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü tarafından desteklendi. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Ek destek Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu (KMC) ve (KMC için) önleyin Körlük için Research Özel Scholar Ödülü tarafından sağlanmıştır.

Hayvanlar üzerinde deneyler tüm Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği uyarınca ele alındı ​​ve kurallar ve yönetmelikler Massachusetts Eye and Ear Revir Hayvan Bakım Komitesi tarafından belirlenen. deneyden önce gün: Akış Odası için Boru 1. Hazırlık <ol><li> Boyun yan hazırlamak için, 5 cm polietilen boru ardından 6 cm silikon tüp 1 cm PI10 polietilen boru bağlayın. Karotid tarafı için, yaklaşık 1.5 cm uzakta 1 cm polietilen boru ile 6 cm arasında, silikon boru içinde, bir T-boru ilavesi ile boyun tarafına Benzer hazırlanması (Şekil 1A, B). T-tüp yerleştirmek için, gerekirse ince forseps kullanarak silikon tüp genişletmek. </li><li> Basınç dönüştürücü silikon tüp 10 cm bir ucunu sonra karotis s T ucunudiğer ucunu ide T-tüp. Siteler sıkı bağlantı sağlamak ve ücretsiz kaçak. Gerekirse boru, birlikte neresinde üzerinde parafilm küçük bir dikdörtgen parça uygulayın, kaçak (Şekil 1C) önlemek için. </li></ol> 2. Odası Kaplama <ol><li> Endotel yüzey kaplama proteini hazırlanması (yani, P selektin, hücreler arası yapışma molekülü-1 (ICAM-1), vasküler hücre yapışma proteini-1 (VCAM-1)),% 0.1 BSA içinde. Yol gösterici olarak, protein 1 mg, 200 ul BSA 4-5 odalar kaplamak için yeterlidir. Endotel yüzey kaplama proteini ile her bir bölme (0.04 x 0.4 x 50 mm) enjekte bir 25 G iğne bağlı 1 ml&#39;lik şırınga kullanarak. Gece boyunca 4 ° C de, 15 ml bir tüp içinde kaplanmış bölmeleri saklayın. </li></ol> Deney günü: 3. Odası Hazırlama <ol><li> 4 ° C kaplı odaları çıkarın ve her tarafa boyun ve karotid boru bağlayın. Bağlant Sealdikkatle boru odasını buluştuğu üzerinde parafilm küçük bir dikdörtgen parça gererek ons. Bir şırınga kullanarak,% 0.1 BSA (sızıntı olup olmadığını kontrol edin) ile odasını ve tüp doldurun. 45 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Çanak her iki tarafındaki çentik açılarak bölmeyi tutmak için bir 35 mm Petri kabı hazırlanır. Çentikler odacığı stabilize; Daha sonra çentikli yerinde çanak odasına tutturmak için silikon küçük bir damla kullanın. Kamara mikroskop altında bakarak düzeyi olduğundan emin olun. Silikon en az 15 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Heparin ile 60 ml&#39;lik kilitleme şırınga doldurun ve basınç dönüştürücü bağlanın. Transducer, silikon tüp, ve T-tüp: karotid aşağıdaki sırayla boruya basınç sensörü bağlayın. <ol><li> Dönüştürücü ve bağlantıyı sabitlemek T-tüp bağlı silikon tüp arasında 1 cm PE50 kullanın. Basınçlı bilezikte (Şekil 1D) ile karotid arter silikon boru geçirin. 100USP heparin uçtan bir uca koşöf hava kabarcığı boru ve bölme vardır kadar. </li></ol></li></ol> 4. Yazılım kurma <ol><li> Yazılımı hazırlamak için, bilgisayar, mikroskop, ve açık laboratuar aygıtı açın. Çift Leica uygulama paketi (LAS) (veya eşdeğeri) üzerine tıklayın ve video kaydetmek için bir klasör hazırlamak: göz → edinmekte → Film → kliplerinin dizisi tanımlamak (klipleri = 15, kayıt süresi = 30 sn ve aralıkları = 15 sn) sonra onaylamak için &quot;+&quot; işaretine tıklayın. </li><li> Akış basıncı yukarıda adım 4.1 kayıt klasörüne dosya adını LabChart (veya eşdeğeri) dosyasını açmak ve koordinat kaydetmek için. </li></ol> 5. Cerrahi Prosedür <ol><li> Ketamin (60 mg / kg) ve ksilazin (6 mg / kg) bir kombinasyonu kullanılarak 8-10 haftalık fare anestezisi intraperitoneal (İP) enjekte edildi. Derin sedasyon pedalı geri çekme refleksi kaybı ile 5-10 dakika içinde ulaşılır doğrulayın. Gerekli izofluran isegerektiği gibi yüz maskesi yoluyla teslim verilebilir. </li><li> Anestezi altında iken, kafesin altındaki bir ısıtma pedi yerleştirmek ve vücut ısısını korumak için 37 ° C olarak ayarlanır. Uygun anestezi onaylandıktan sonra, göz kuruluğu önlemek için bacitracin merhem ile ventral pozisyonda ve kat gözleri fare koyun. </li><li> Bundan sonra, bir jilet kullanarak insizyon yerinde saç tıraş ve iyice alkol ile siteyi temizleyin. </li><li> Tam anestezi kez bant ventral pozisyonda fareyi tutarak hayvan sabitleyin. Makasla boyun alanı Açığa ve trakea ve gemiler (Şekil 2A) maruz tiroid bezi çıkarın. </li><li> Tam vagus siniri (Şekil 2B) zarar vermemeye dikkat ederek ortaya çıkıncaya kadar karotid arteri temizleyin. Sütür bir parça katlayın ve sonra karotis altında sütür 2 adet şimdi yani viraj kesilmiş karotid arter altında viraj geçmek. Döngü knot içine her sütür (sıkmayınknot). </li><li> Aynı şekilde (Şekil 2B) sütür hazırlamak, sol juguler ven (Şekil 2C) maruz aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Fare damar boru bağlayın. <ol><li> Heparin IP 1 ml enjekte edilerek fare Heparinize. </li><li> Karotis arter üst dikiş sıkın. Karotis arter (Şekil 3A) gitmek ahlaka damar kelepçesini yerleştirin. Microscissors (Şekil 3B) kullanarak, küçük bir kesi, arter çevresi yaklaşık 1/8 üst dikişle arteri tutun ve yapmak için forseps kullanın. </li><li> Üst dikiş ve arterde yapılan kesi içine ikinci düğüm ile karotis arter boru geçirin. Arter (Şekil 3C birkaç knot sıkı bir mühür sağlamak için yapılmalıdır) boru etrafına sızdırmaz şekilde alt dikiş kapalı kravat. </li><li> (Şah damarı tüp sokulması için gemi aynı işlemi tekrarlayınKelepçe boyun tarafı için gerekli değildir, Şekil 3B). </li><li> Damar kelepçesini bırakarak akışını sınayın. Hiçbir sızıntı yoksa mikroskop fareyi ve oda tüp (cerrahi işlemin gösteri için ekli video) karotis boru ve şah damarını bağlamak. </li></ol></li></ol> 6. Kayıt Rolling Hız <ol><li> Fare dolaşım sistemi ile bir devre yaparak, odasını doldurmak için karotis kelepçesini açın. Akış koşulları stabilize böylece kan 3-5 dakika dolaşmaya izin verin. Odacık mikroskop amacı ile bir ucundan diğerine düzeyi ve kenar ekranındaki video kayıt penceresi ile paralel olacak şekilde 3-5 dakika bekliyor döneminde, mikroskop sahne ayarlayın. </li><li> Odasından akan hücreler görülebilir böylece daha sonra yemeğin içine 10X suya daldırma hedefi düşük su ile cam haznesi içeren modifiye Petri kabı doldurun.ışık yoğunluğu hücrelerinin yeterli görüntüleme için ayarlanması gerekebilir. Genel olarak daha düşük bir yoğunluk daha iyidir. </li><li> Transdüser orta fizyolojik akış basıncı ilişkilendirerek, sürekli bir 30 mm Hg okur ya da arzu edilen boru kelepçeyi ayarlayın. </li><li> Basın video ve juguler ucuna yakın ve tamamlanana kadar karotis sonuna doğru akışına karşı hareket ilk kez sukut ile basınç hem de kayıt başlatmak için &quot;start&quot;. Not: Farklı yapışma molekülleri ile çeşitli kaplama koşullarının çok bölme ile aynı fare incelenebilir. Sadece bir bölme, bir zaman kaydedilmektedir. <ol><li> Kayıt tamamlandığında, kan akışını durdurarak, giriş yerinde vanasını kapatın. Odasına çıkarın ve diğer yandan bir yandan ince forseps ve yivli forseps kullanarak devre (farklı yapışma molekülü ile kaplı) yeni bir odasını uygun. Adımlarda belirtildiği gibi yeni odası için kayıt Özgeçmiş6,1-6,4. </li></ol></li><li> CO deney sonunda bir omurilik dislokasyon 2 boğulmaya tüm fareler öldürülür. Böylece işlem fareler deney sonunda bir omurilik çıkık terminal ötenazi edilir. </li></ol> 7. Sonuçları yorumlama <ol><li> Kaydedilen veriler ImageJ yazılım 23 &quot;M TrackJ&quot; eklenti kullanmak analiz etmek. </li><li> Dosya seç → ithalat → AVI → gri tonlama dönüştürmek tarafından gri tonlama dosyayı dönüştürün. </li><li> Küresel → çerçeve aralıkları (i) girin mülkiyet → → → seçeneğini görüntü ile kareleri standart hale. (Resim J video penceresinin üst köşesinde gösterilir) bir video kare sayısına göre toplam video süresi (genellikle 30 sn) bölünmesiyle çerçeve aralıklarını hesaplayın. </li><li> M TrackJ → bir lökosit seçin parçaları ekleyin → → Seç eklenti tarafından her lökosit akışını ölçmek→ 15 her çerçeve ile Takip - 20 sn → Merge. </li><li> Görünümünde tüm lökositler için yineleyin 7.4. </li><li> İki sütun Kopyala → M TrakJ tüm görünür → Seç tedbir lökositlerin ortalama haddeleme hızı belirleyin: Bir elektronik tabloya izler. &quot;V demek&quot; etiketli sütun piksel / saniye olarak ölçülen lökosit haddeleme olduğunu. 2/3 bölerek mikron / sn dönüştürmek. </li><li> Bir elektronik tabloya basınç veri vurgulamak ve ihracat analiz ve aşağıdaki hesaplamayı gerçekleştirmek için: Ap (mm Hg) ve t (din / cm 2) Her bir deney grubu arasında bir karşılaştırma için. Hesaplanan kez, grafik için prizma yazılımına veri kopyalama. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

lökosit işe süreci inflamatuvar yanıt çok önemli bir adımdır; Bu onların efektör işlevini yerine getirmesini mümkün hedef dokulara doğru dolaşım sistemi için lökositlerin migrasyonunu içerir. Lökositin görevlendirilmesi, aterosklerotik istilanın, miyokardiyal enfarktüs, iskemi / reperfüzyon ve transplant ameliyatını 1, hem de birden çok merkezi sinir sistemi ile ilgili nöro-enflamatuar durumların 10-12,20,24,25 gibi inflamatuar olaylardaki çeşitli ayrılmaz bir parçasıdır. Lökosit işe açıklıklı, autoperfused Mikrosirkülasyon odası araştırmacı lökosit göç dinamiklerini incelemek için yeteneği sağlayan vazgeçilmez bir aracı sağlar hastalık koşulları çeşitliliğini göz önüne alındığında. Son birkaç on yıl boyunca, in vitro tahlillerin çeşitli lökosit hücre yapışmasının 26 dinamikleri üzerinde çalışmak üzere geliştirilmiştir. Ne yazık ki, bu tahlillerin tümüne çıkarılmasını gerektirirkandan lökositler, mekanik aktivasyon tanıtan. In vivo ortamda yakın olsun, uyarlamalar tam kan örnekleri toplamak ve hemodinamik akış koşulları 16,17 kontrol yapılmıştır. Burada, biz fare dolaşım sistemine kaplanmış odayı bağlayarak alanında önceki avans. Biz bir fizyolojik aralık kan akışını düzenleyen ve lökosit haddeleme dinamiklerini incelemek mümkün. kaplanmış odası bize belirli yapışma molekülleri ile lökosit etkileşimleri çalışmak için yeteneği verir. Sistem, canlı fare tarafından işletilen bir birim olarak görev olduğu için, daha yakından bize immünolojik fare modellerinde çeşitli lökosit-endoteliyal etkileşimler üzerinde çalışmak için izin doğal çevreye taklit eder. Ayrıca, bu sistem bize mevcut çoklu genetik fare modellerinin yararlanmak için izin verir. Sistem tamamen in vivo ortamda çoğaltma değil iken, specifi incelemek için bir platform sağlarfizyolojik koşullar altında lökositlerin c elemanları, daha önce mümkün olmayan bir başarı. Bu bir adım daha yakın, daha fizyolojik bir ortamda bizi alır olsa sisteme sınırlamalar vardır. Biz odası kaplama sınırlıdır lökosit etkileşimlerinin bazı unsurları değerlendirmek için sadece edebiliyoruz, böylece tamamen damar karmaşık 3D matrisi çoğaltma değil. Buna ek olarak, büyük bir dikkatle protokolde belirtilen tüm adımları fare dolaşımı için bir kapalı sistem sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Hava kabarcıklarının giriş ölçüde deney doğruluğunu ve tekrarlanabilirlik etkileyecektir. Biz lökosit haddeleme dinamikleri değerlendirmek için Autoperfused Microflow odanın kullanımını tarif ederken prosedür çeşitli hastalıkları çalışma araştırmacılar tarafından kişiselleştirilmiş bir potansiyele sahiptir. Örneğin, kanser hücreleri, lökositler tarafından paylaşılan ortak integrinler çok ifade metastaza. Studying daha yakından bilgi yardımcı olabilecek bir in vivo ortamı taklit eden bir ortamda, ve bazı kanser hücrelerinin invaziv doğası muhtemelen tahmin, onların haddeleme dinamiği. Olası metotlardan biri, GFP ifade eden kanser hücrelerinin haddeleme dinamikleri parça akış odası deneyi ile birlikte böyle bir GFP 27 kanser hücreleri için bir etiketleme tekniği birleştirmek olabilir. Bu prosedür, genetiği değiştirilmiş fareler ve hastalık modelleri ile birlikte diğer laboratuarlarda kullanılmak üzere modifiye nasıl görmek ilginç olacak maddelerin çeşitli odasına kaplanması ve aynı fare birden odaları bağlayan esnekliği göz önüne alındığında. Biz burada açıklamak tekniği sadece sadece araştırmacı yaratıcılığı ile sınırlıdır çok daha geniş bir uygulama potansiyeline dokunur.

Enflamasyon yaralanma vücudun evrensel bir yanıttır ve hem doğal ve adaptif bağışıklık sistemi fonksiyonu çok önemli bir adımdır. Yaralanma ve / veya iltihap uyarıcıya tepki olarak endotelial hücreler, belirli bir yapışma moleküllerini arttırdığı; Bu öncelikle sonrası kılcal venüllerdeki, mikrovasküler endotel ile ekstravazasyon lökosit yol açar. Bu süreç endotel üzerindeki kan dolaşımında serbest akan lökositlerin tethering ile başlar. Kararlı haddeleme ve sırayla tenasühe ve sitotoksik ajanların salgılanmasına yol açar lökositlerin, firma yapışma, bu 1,2 tethering izleyin. Selektinler kademeli 3-5 erken aşamaları neden olduğu bilinmektedir; integrinlerinin firması yapışması ve göçü 1,6-8 sonraki adımlar için sorumludur. Kanıt artan vücut iskemi reperfüzyon hasarı hayvan modellerinde lökosit ve endotel adezyon molekülleri sahip hayati rolleri önerir, Astım, psöryazi, multipl skleroz, ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon 9-12. Bu koşullar altında, inflamatuvar yanıt sağlıklı doku yıkımında ortaya çıkan, kişinin kendi bedenini saldırmaya yanlış yönlendirilmiş olduğunu. (Örneğin, non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar, kortikosteroidler ya da diğer kemoterapötik maddeler olarak) mevcut anti-enflamatuar maddeler, uzun süreli kullanım 13 ile ciddi yan etki riskini taşırlar. Bu nedenle, bu toksik olmayan 14 kalarak sonuçta istenen anti-inflamatuar etkiye sahip hedeflenebilir hastalığa özgü molekülleri tespit yeteneği, uygun araçlara sahip büyük ilgi olduğunu. Statik lökosit yapışma deneyi olarak in vitro yöntemler mevcut erken 1976 15 olarak kullanıldı. Paralel akış bölmesi, birinci akış şartları altında, lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için 1987, in vitro olarak kullanılmıştır. Bu deneylerde, Huma uyarılmışn, toplardamar kanından polimorfonükleer lökositler (PMNler), primer insan göbek damar endotelial hücrelerinde (HUVECler) bir tek tabaka içinde perfüze edildi. Hemodinamik akış koşulları kontrol etmek için, Harvard Apparatus şırınga pompası 16 kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yapay lökosit izolasyonu önlemek için, tam kan, immobilize edilmiş yapışma moleküllerinin 17 ile kaplanmış cam bölme ile bir arada kullanılmıştır. Lökosit stimülasyonu önlemek ve mekanistik yaklaşık fizyolojik koşullar altında yapışma molekülleri ile etkileşimi incelemek için, bir ex vivo autoperfused, ekstrakorporel, arteriyovenöz devre 16 geliştirilmiştir. Bu devrede, kan tek ya da birlikte immobilize yapışma molekülleri ile kaplanmış bir cam Mikrosirkülasyon bölme içinde doğal BBL&#39;lerin etkileşimi sağlayan, anestezi altında canlı bir farenin sağ ortak karotid arter ve sol dış boyun toplardamarı arasına akar. Bu Sistemli için önemli bir avantajm, enflamatuar yollar doğrudan ya da dolaylı olarak manipüle edildiği genetik olarak fareler kullanmak yeteneğidir. Ayrıca, akış koşulları altında, dış aktivasyon serbest inflamasyon lökosit adezyon molekülleri, izole katkı saptamak için yeteneği var. Akış odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama arteriyel veya venöz sistemleri 18-22 ya taklit etmek kesme kuvvetlerinin deneysel varyasyonları geniş bir yelpazede sunmaktadır. Burada detaylı olarak ex vivo autoperfused Mikrosirkülasyon odası testinin hazırlanması ve performansı ile ilgili bir protokol açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Lökosit-Endotelyal etkileşimler, akut ve kronik iltihap erken ve kritik olaylar ve bozulmuş zaman, daimi patolojik hasarına yol açan doku hasarı aracılık edebilir. Mevcut konvansiyonel testler sadece kan lökosit çıkarma sonra lökosit adezyon moleküllerinin analiz izin. Bu periferik kan lökosit (PBL&#39;ler) da araştırma bulgularını etkileyen PBLs teşvik, hangi analiz için hazır olabilir önce birkaç adım geçmesi kan gerektirir. autoperfused mikro akış odası deneyi, ancak, bilim adamları bir kaplanmış odasını manipüle özgürlüğü yerken canlı fare sistemik akışını kullanarak fonksiyonel düzensizliği erken lökosit çalışma sağlar. Bir hastalık modeli sayesinde, lökosit adezyon moleküllerinin fonksiyonel ifadesi değerlendirilebilir ve immobilize endotel adezyon molekülleri ex vivo ile kaplanmış bir mikro-cam odasında sayısal. Bu modelde, kan akarodasında yerli BBL&#39;lerin etkileşimini sağlayan sağ karotis arter ve anestezi altında canlı farenin sol eksternal juguler ven arasında. Gerçek zamanlı deneysel analiz intravital mikroskop yardımı olarak bir Harvard Apparatus basınç aracı ile birlikte sağlanır. Cam odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama deneyleri arasında karşılaştırılabilir fizyolojik akış koşulları izin verir. Lökosit haddeleme hızı, ana sonuçtur ve Sağlık açık erişim yazılımı ImageJ Ulusal Enstitüleri ile ölçülür. Özetle, autoperfused mikro akış odası tahlil Lökositler endotel etkileşimi incelemek için optimal fizyolojik bir ortam sağlar ve inflamasyonu okuyan zaman araştırmacılar doğru sonuçlara varmak için izin verir.

<html> Her kayıt, sadece etkileşim lökositler sırasında odasının üzerine belirgindir. Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar, Şekil 4&#39;te görülebilir. Beyaz oklar ilgi yapışma molekülü tarafından yakalanan ve kan akışı içerisinde diğer akıcı olanlar arasında bölme boyunca yuvarlanan bireysel lökositlerin işaret etmektedir. Odasının dışında ortak bir eserdir tüm görüntüleri büyük karanlık alanlarda görülebilir. Karanlık küre okuyucu sabit bir noktaya göre lökosit hareketini takdir yardımcı. 22 saniyelik bir süre boyunca lökositler ilerleme küreler ile ilgili olarak görülebilir. Aynı şekilde grafik Tx1 haddeleme hızı (solda bir vardiya) azalır ve Tx2 kontrole göre hızı (sağa kaydırma) artar verilerin son grafiğini göstermektedir. 0 &quot;/&gt; Şekil 1: akış bölmesi için boru hazırlanması. (A) Araçlar silikon 002, Y tüpü, T tüp, 35 mm Petri, ince forseps, ince makas tüp, boru ve hazne montajı (mikro cam haznesi 0,4 x 0.04 x 50 mm, polietilen boru PI10, polietilen boru PE60 için gerekli, tüp tutucu, vasküler kelepçe, 7-0 ipek dikiş. kaplı bölmesi boyunca fare kan akışını yeniden yönlendirmek için karotis arteri ve jugular damar boru (B) hazırlanışı. (C) basınç transdüktörüne karotid arter boru bağlama. (D) kan akış hızını ayarlamak için kelepçenin içinden transdüktörden boru geçirin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Şekil 2:.. karotid arter ve juguler ven maruz (A) dikkatlice sarı noktalı ((B) trakea maruz boyun alanını kesip dikiş bir parça geminin altında geçti böylece sağ karotis arter temizleyin hat) karotis arter özetliyor. sütür bir parça (noktalı sarı hat juguler ven özetliyor) geminin altında geçti böylece (C) sol juguler ven temizleyin. (D) gevşek üst ve alt bölgelerinde dikişlerle bağlı Yerleştir karotis arter ve juguler ven (oklar gemilerin üst ve alt bölgeleri belirtilen) olarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Şekil 3: tüp bağlanması tO arter ve juguler ven karotid. (A) karotis üst düğüm sıkın ve alt düğüm altında kelepçeyi yerleştirin. (B) Microscissors kullanarak, karotis küçük bir kesi yapmak, yaklaşık 1/8 çevresi (noktalı sarı daire kesi gösterir). ( C) karotis içine tüp yerleştirin ve en az iki sütür (yeşil noktalı çizgi boru ve sarı noktalı çizgi karotis arter gösterir) ile sabitleyin. (D) Benzer yeşil noktalı çizgi boru ve gösterir (juguler hortumu takın sarı noktalı çizgi juguler ven). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Şekil 4: akış cham aracılığıyla haddeleme lökositlerin Temsilcisi zaman dersber (Ölçek çubuğu = 100 mikron) (beyaz ok başları haddeleme lökositler işaret). Grafik bir grafik programına ihraç sonrası temsili sonuçlar göstermektedir (Tx1 ve Tx2 deneysel tedavi grupları ve TO kontrol grubu). Tx2 hız haddeleme lökositlerde artış yansıtan doğru kaymasına neden olurken Tx1 hızı ve tedavi edilmeyen gruba (TO) kıyasla grafik bir sol kaymasını haddeleme lökositlerin bir azalmaya yol açan yavaş lökositleri olan bir işlemi göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.5K Görüntüleme.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar. 

Video: Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Biyomühendislik

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Bir ıntrinsic Vaskülarizasyon tarafından Doku Mühendisliği<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Mühendisliği Odası

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Sıçan Vivo içinde kısmi karaciğer Dairesi'nde için bir temel olarak yeni bir cerrahi teknik

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Domuz Kalbinde Kapasitif İmmünoprob ile Nöropeptit Dinamiğinin İn Vivo Ölçümü

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by scoring MN in once-divided, cytokinesis-blocked binucleated cells or fully divided mononucleated cells. Historically, light microscopy has been the gold standard method to score the assay, but it is laborious and subjective. Flow cytometry has been used in recent years to score the assay, but is limited by the inability to visually confirm key aspects of cellular imagery. Imaging flow cytometry (IFC) combines high-throughput image capture and automated image analysis, and has been successfully applied to rapidly acquire imagery of and score all key events in the MN assay. Recently, it has been demonstrated that artificial intelligence (AI) methods based on convolutional neural networks can be used to score MN assay data acquired by IFC. This paper describes all steps to use AI software to create a deep learning model to score all key events and to apply this model to automatically score additional data. Results from the AI deep learning model compare well to manual microscopy, therefore enabling fully automated scoring of the MN assay by combining IFC and AI.

The micronucleus (MN) assay is a well-established test for quantifying DNA damage. However, scoring the assay using conventional techniques such as manual microscopy or feature-based image analysis is laborious and challenging. This paper describes the methodology to develop an artificial intelligence model to score the MN assay using imaging flow cytometry data.

Görüntüleme Akış Sitometrisi ve Yapay Zeka Kullanılarak Mikronükleus Testinin Otomasyonu

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...