Biz mükemmel teknik destek için Angela Kralemann-Köhler teşekkür ederim. Burada açıklanan deneysel çalışmalar bizim laboratuvarımızda gerçekleştirildi ve CK ve BK ve BK Araştırma ve Eğitim Alman Bakanlığı (Bmbf) bir hibe Alman Araştırma Kurumu (DFG) hibelerinden tarafından desteklenmiştir.

Etik beyanı Bu çalışma, toplum ve hayvan bakımı kullanım komitesi, devlet Kuzey Ren-Vestfalya, (Düsseldorf, Almanya) ve LANUV düzenlemeleri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri lisans numarası 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW) altında LANUV, Düsseldorf tarafından kabul edildi. Tüm çabalar sıkıntı ve çalışma için gerekli hayvan sayısını en aza indirmek için yapılmıştır. 1.. Hayvan Bakım ve Barınma <ol><li> European Federation Laboratory Animal Science Derneği (FELASA) tarafından tanımlanan, burada tarif edilen protokollere kullanılan tüm hayvanlar, özel patojen içermeyen koşullar altında tutulmalıdır. </li><li> HEPA süzülmüş havası sahip olan fareler, günlük koşullarında (12 saat ışık / karanlık çevrimi) altında bir ısı-ve nem-kontrollü (22 ° C) bir odada standart kafeslerde muhafaza edilmelidir. </li><li> Standart yiyecek ve su ad libitum temin edilmelidir. &lt;/ Li&gt; <li> IkB / tTA ve IkB / ise - kontrol fareleri kullanılır 7, 18 de tarif edildiği gibi, PCR tabanlı bir genotipleme, her bir hayvan için gerçekleştirilmelidir. </li><li> Az dört gün bir yaş farkı olan erkek hayvanlar bireysel değişkenliği azaltmak için kullanılacak gerekir. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI): NF-KB etkinleştirme deneyler için, doksisiklin, en az 14 gün boyunca (% 2.5 sükroz ile 2 mg / ml) içme suyu içinde tatbik edilmelidir. </li></ol> 2. Mekansal Desen Ayırma-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Tüm davranış testi uluslararası ve yerel kurallara uygun olarak yapılmalıdır. </li><li> ÖNEMLİ! Altı ay veya daha eski bir çağda sadece erkek fareler kullanın. Bir test serisinin hayvanlar arasındaki yaş farkı az dört gün olmalıdır. Test, her seri için aynı operatör tarafından gerçekleştirilmelidir. Fareler ayrıca kısmen olarak tahrik motivasyonunu artırmak için önce test için bir standart diyet almalıdırweet gıda ödül. </li><li> Sert plastikten yapılmış bir beyaz dairesel plaka ayarlayın en az 4 x 80 W ve 3 x 215 W neon floresan lambalar ile aydınlatılan bir nem ve sıcaklık kontrollü bir odada (22 ° C) ve (çapı 120 cm, Şekil 5A bakınız) . ÖNEMLİ! Farelerin motivasyon kısmen aydınlık, maruz yerlere kendi kaçınma tarafından yönlendirilen gıda evlere girmek için, doğru aydınlatma kullanıldığından emin olun. </li><li> Video izleme sistemi kurmak. Kamera 115 cm plakasının merkezinde (bkz. Şekil 5A) üstünde olmalıdır. </li><li> Hayvanların, plakanın sınırında yaklaşık 100 cm (Şekil 5A bakınız) kolayca görülebilir pozisyonlarda beyaz renkli kumaş için çok renkli ekstra-labirent ipuçları (EMC) takın. </li><li> Dikkatli deneysel set-up herhangi bir koku kaldırabilirsiniz hızlı bir dezenfektan ile plakasını temizlemeyin. </li><li> Yedi özdeş sarı gıda evler (12 cm x 7 cm x 8 cm, bakınız Şekil 5A yerleştirin </beyaz plaka üzerinde)&gt; güçlü. Konumları (Şekil 5A bakınız) Tümden işaretlenmiş olmalıdır. </li><li> Şekil 5A, tek bir tanımlanmış gıda ev hayvan (konum F serbestçe erişilebilir olmak (Şekil 5A bakınız) tanımlanmış pozisyonlara tüm gıda evlerin içine tatlı gıda pelet ödülleri (bir Kellogs `s Froot Döngü / gıda evin bir çeyrek) bkz yerleştirin .) Şeffaf folyo ile nontarget gıda evleri kapatın. </li><li> Testten önce, alışma (görev başlamadan bir gün önce) gerçekleştirin. Tüm gıda evler serbestçe erişilebilir yapın ve fareler serbestçe labirenti keşfetmek ve bir gıda pelet ödül (10 dk / hayvan) almak için izin verir. </li><li> Üzerinde bilgisayar ve kamerayı açın ve video izleme sistemi yazılımını başlatmak. </li><li> Kayda başlayın. </li><li> Dairesel plaka üzerinde tanımlanmış başlangıç ​​noktası (Şekil 5A, S: başlangıç ​​pozisyonu) de hayvan koyun ve fareler 10 dakika boyunca hedef gıda evde aramak için izin verir. </li><li> Stop video izleme. </li><li> ÖNEMLİ! Hızlı dezenfektan ile her deneme sonrasında dairesel plaka ve gıda evler temizleyin. </li><li> (Her hayvan için) yedi gün boyunca günde testi tekrarlayın. </li><li> Uygun istatistik yazılımını kullanarak sonuçları (gecikme, katedilen mesafe ve hatalar) analiz. Yanlış gıda ev ve / veya girme ve gıda pelet ödül almak olmadan uygun bir kutu ile temas yaklaşıyor gibi hataları tanımlayın. Gruplandırılmış analizi için Bonferroni post-hoc testi ile iki yönlü ANOVA kullanın. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) fareler Kurban ve aşağıda açıklandığı gibi hippocampi analiz. </li></ol> 3. BrdU Etiketleme <ol><li> 3 gün (farklılaşma ve entegrasyon analizi) ya da tek bir enjeksiyon (proliferasyon analizi) için 200 mg / kg ip boyunca günde bir defa intraperitoneal olarak 50 mg / kg ip BrdU enjekte edilir. </li><li> , Hayvanların Kurban hipokampus incelemek ve aşağıda açıklandığı gibi 40 mikron bölümleri hazırlamak. </li><li> Denatüre10 dakika için 2 M HCI ile bölümler ve 10 dakika boyunca 0.1 M borat tamponu içinde inkübe edilir. </li><li> BrdU karşı antikorlar kullanılarak aşağıda tarif edildiği gibi, immünohistokimyasal olarak, her bir hayvandan 40 um bölümler (ayrı 240 um) bir tek-in-on iki serisi etiketleyin. </li><li> Tanecik hücre katmanlarında ve subgranular zonunun rostro ölçüde boyunca konfokal mikroskopi analizi ile etiketlenmiş hücrelerin ölçmek. DG başına etiketli hücrelerin toplam sayısını elde etmek için iki ile hipokampus ve bölme başına BrdU etiketli hücrelerin tahmini toplam sayısını elde etmek için, 12 ile elde edilen numaralar çarpın. </li></ol> 4. Perfüze olmayan hayvanlardan Brain ve kriyokesitler Hazırlanması çıkarılması <ol><li> Hayvanların ötenazi için lokal olarak onaylanmış prosedürlere uymak. Fareler doğrudan servikal dislokasyon ile ötenazi olabilir. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) Hayvanlar periton inje örneğin, yerel ve uluslararası kurallara uygun olarak, ölümden önce anestezi olabilir(taze ya da fizyolojik tuz tamponu 1.85 ml 2.2 mg 2,2,2-tribromoethanol izoamil etanol ml 1 içinde yapılmış 150 ml stok çözelti karıştırılarak yapılan) 33 g bir fare için 0.8 ml olarak Avertin&#39;in şeklinde gösterilmektedir. </li><li> Betadine (% 10 povidon-iyot)-batırılmış% 70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez ile sonradan gazlı bez ve bez ile kafası sterilize. </li><li> Uygun cerrahi makas kullanılarak hayvan başını kesmek ve bir kenara cilt çekin. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) Fiksatörleri geri zekalı cilt katlama önlemek için uygulanabilir. </li><li> Kafatasında bir ensizyon olun ve dikkatli bir kenara kafatası parçaları çekin. </li><li> Dikkatle uygun bir cerrahi alet (örneğin Moria Kaşık) kullanılarak tüm beyin kaldırmak. </li><li> Kuru buz üzerinde -30 ila -40 ° C, 50 ml&#39;lik bir cam kaba (örneğin, Schott Duran) içindeki bir 2-metilbütan ön soğutma 25 mi. Not: ideal konfokal lazer taramalı mikroskopi için uygundur &quot;kalın&quot; bölümlerinin serbest yüzen boyama için, beyin kaldırmak, 3 yıkamabeyin (tipik olarak gece boyunca) dibine kadar batmış fosfat içinde 4 ° C&#39;de tampon ve mağaza kez 50 ml bir tüp içinde% 30 sukroz çözeltisi tamponlu. </li><li> Dikkatle nescofilm (Parafilm) bir parça beyin koyun ve TissueTek Ekim bileşik bol miktarda kapak, -80 ° C&#39;de kullanıma kadar 2-metilbutan, mağaza nescofilm dondurulması. Not:% 9 sakaroz, 7 mM MgCI2, 50 mM fosfat tampon maddesi,% 44 gliserol içinde -20 ° C bir mağazada uzun süre depolama için. </li><li> Uygun cryomicrotome 10-12 mikron kalınlığında kesitler halinde beyin kesin. Not: Kalın, serbest yüzen kesitler için, (örneğin Reichert Jung, Frigomobil.) Ve -20 ° 40 mikron yatay bölümleri kesmek uygun kriyotomu arasında kriyotomu sahnede beyin dondurmak - 25 ° C. Ince bir fırça ile bıçak bölümleri toplayın ve tampon toplamak veya uzun süre depolama için -20 ° C&#39;de (4.9 adım) depolama çözümü tutmak. </li><li> Dikkatle tek mikroskop lamı üzerine iki dilim monte. BiziUltraPlus Superfrost slaytların e çok bölümlerden yapışmasını arttırmak için tavsiye edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca slaytlar kurutun. Slaytlar, kullanılıncaya kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 5. Perfüze Animals Bölümler hazırlanması <ol><li> (Adım 4.2) yukarıda tarif edildiği gibi hayvanların anestezisi. </li><li> Dikkatle 10-15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid, ardından 2-4 dakika boyunca fosfat tamponlu heparin ihtiva eden tuzlu su (PBS) (0.025 g/100 ml PBS) ve prokain (0.5 g/100 mi PBS) ile transkardiyal hayvan perfüze . Perfüzyon en iyi şekilde yaklaşık olarak 1.2-1.4 m ya da yaklaşık olarak 15 ml / dak &#39;ya ayarlanmış bir peristaltik pompa kullanılarak bir hidrostatik basınç kullanarak sol ventrikül ve sağ atriyum açıklığı yoluyla perfüze edilmesi ile gerçekleştirilir. Hiç kırmızı kan damarları görünür olmak bir soluk beyaz beyin Optimal perfüzyon sonuçları. </li><li> Inceleyin ve 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası düzeltin. </li><li> Cryoen az 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de PBS içinde% 30 sukroz içinde beyinleri korur. </li><li> Kriyotomu sahnede beynini dondurur. </li><li> Uygun bir kriyotomu kullanarak tüm forebrains 40 mikron yatay kesitler hazırlamak. </li><li> Slaytlar, -20 ° C&#39;de kullanıma kadar, dondurarak saklama çözeltisi (0.1 M fosfat tampon maddesi,% 50 gliserol,% 0.14 MgCI2,% 8.6 sukroz) saklanabilir. </li></ol> 6. Perfüze Hayvanlar Beyin Bölümler İmmünohistokimyası <ol><li> 10 dakika boyunca -20 ° C soğuk metanol kullanılarak, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan cryosections, Post-düzeltin. </li><li> 4 ° C de bir gece (ikincil antikor yükseltilmesi için kullanılan türden)% 0.3 Triton-X içeren% 5, normal serum ile bloke </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve 4 ° C de bir gece primer antikorlar ile inkübe </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve bir saat süre ile, oda sıcaklığında, ikincil antikor ile inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın </li><li> CouSYTOX yeşil veya DAPI (ya da bir başka DNA boya) kullanılarak DNA bölümünün nterstain. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın </li><li> Sulu bir ortam içinde gömme bölümleri Embed. </li><li> Gömülü maddenin en az 48 saat boyunca polimerize olsun. </li></ol> 7. Perfüze Hayvanlar Beyin Bölümler İmmünohistokimyası <ol><li> Adım 6.2 &#39;de tarif edilen ve daha sonra 4 ° C de bir gece boyunca% 0.3 Triton-X (yüzer) ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi içinde tespit edilmiş olan beyin bölümleri inkübe olarak Block </li><li> 1x PBS ile üç kez yıkayın ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında,% 0.3 Triton-X (serbest yüzen) ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş sekonder antikor, çözelti içinde inkübe edilir. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın </li><li> SYTOX DAPI, yeşil ya da (ya da bir başka DNA boya) kullanılarak DNA bölümü Counterstain. </li><li> 1x PBS ile üç kez yıkayın </li><li> Sulu bir ortam içinde gömme bölümleri Embed. </li><li> Gömme ortamı için polimerize olsunt en az 48 saat. </li></ol> 8. Yosunlu Fiber Projeksiyonlar Araştırılması <ol><li> , Hayvanlar kurban yukarıda tarif edildiği gibi 40 mikron koronal kesitler hazırlamak ve sinir lifi M. antikoru kullanılarak hipokamp bölümü leke </li><li> Mossy elyaflar çekirdek ve görselleştirmek için bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak, uygun dalga boyunda bölümleri tara. Düşük büyütme taramayı başlatın. </li><li> Yönlendirme için düşük büyütme görüntüleri kullanmak ve yosunlu lif projeksiyonları ile hipokampus hedef. </li><li> Yüksek çözünürlüklü ve yüksek büyütme bölümleri (z-bölümleme) tarayın. </li><li> NF-M lekeleme ile görselleştirilmiştir mossy liflerinin morfolojik görünümünü ve bağlantı analiz edin. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) hipokampal bıçaklarının boyutu ve hacmini analiz. Ölçümler için DNA sinyali kullan. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Deneyi (Nöron Hücre Ölümü) <ol><li> Hayvanların Kurban, hipokampusunda teşrihAmpus, ve yukarıda tarif edildiği gibi 12 um kesitler hazırlamak. </li><li> Kesitler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. </li><li> Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca% 4 PFA içinde bölümleri düzeltildi. </li><li> Kısaca bölümler GKD 2 O. ile 3 kez yıkayın </li><li> , Sürekli, yumuşak çalkalama altında 10 dakika boyunca% 0.06 potasyum permanganat (KMnO 4) ile bölümleri inkübe edin. </li><li> Bölümler GKD 2 O. ile 3 kez yıkayın </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 0.002 Floro-Jade C solüsyonu ile bölümleri inkübe edin. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) eşzamanlı nükleer boyamalar için,% 0.002 Flor-Jade C çözeltisi 10 mg / ml DAPI ile takviye edilebilir. </li><li> Kısaca bölümler GKD 2 O. ile 3 kez yıkayın </li><li> Kesitler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. </li><li> Ksilen ile inkübe bölümleri (1 dakika) </li><li> Bir ksilen bazlı montaj ortamı (DPX) kullanarak bölümleri monte edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, H., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neural+process+growth,+elaboration+and+structural+plasticity+by+NF-kappaB.">Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB.</a> Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).</li><li>Imielski, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regrowing+the+adult+brain:+NF-kappaB+controls+functional+circuit+formation+and+tissue+homeostasis+in+the+dentate+gyrus.">Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahippocampal+injection+of+A+beta(1-42)+inhibits+neurogenesis+and+down-regulates+IFN-gamma+and+NF-kappaB+expression+in+hippocampus+of+adult+mouse+brain.">Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain.</a> Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).</li><li>Denis-Donini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adult+neurogenesis+associated+with+short-term+memory+defects+in+NF-kappaB+p50-deficient+mice.">Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice.</a> J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).</li><li>Bracchi-Ricard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+nuclear+factor-kappaB+regulates+learning+and+memory+and+synaptic+plasticity+in+female+mice.">Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice.</a> J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).</li><li>Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+is+a+critical+mediator+of+stress-impaired+neurogenesis+and+depressive+behavior.">Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).</li><li>Fridmacher, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain-specific+neuronal+inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activity+leads+to+loss+of+neuroprotection.">Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection.</a> J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).</li><li>Whiteside, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-terminal+sequences+control+degradation+of+MAD3/I+kappa+B+alpha+in+response+to+inducers+of+NF-kappa.">C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa.</a> B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).</li><li>Mayford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+memory+formation+through+regulated+expression+of+a+CaMKII+transgene.">Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene.</a> Science. 274, 1678-1683 (1996).</li><li>Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+hepatic+apoptosis+and+embryonic+lethality+in+RelA/TNFR-1+double+knockout+mice.">Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice.</a> Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).</li><li>Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+of+a+water-maze+procedure+for+studying+spatial+learning+in+the+rat.">Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat.</a> J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).</li><li>Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+deficits+associated+with+senescence:+a+neurophysiological+and+behavioral+study+in+the+rat.">Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat.</a> J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).</li><li>Brun, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+cells+and+place+recognition+maintained+by+direct+entorhinal-hippocampal+circuitry.">Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry.</a> Science. 296, 2243-2246 (2002).</li><li>Meshi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+neurogenesis+is+not+required+for+behavioral+effects+of+environmental+enrichment.">Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment.</a> Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).</li><li>Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+separation+in+the+human+hippocampal+CA3+and+dentate+gyrus.">Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus.</a> Science. 319, 1640-1642 (2008).</li><li>Dupret, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+relational+memory+requires+hippocampal+adult+neurogenesis.">Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).</li><li>Kaltschmidt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+regulates+spatial+memory+formation+and+synaptic+plasticity+through+protein+kinase+A/CREB+signaling.">NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).</li><li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation.">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, 210-213 (2009).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Yetişkin nöron ve doksisiklin ile nöronlarda NF-KB inhibisyonu, ve daha sonra yeniden aktivasyonu ile kendi manipülasyon olasılığı, yetişkin beyin, hem de nöronal de-ve yeniden üretimi içine yeni doğmuş nöronlar araştırmalar için ilginç bir sistem sunar . Bu sistemin güzelliği olduğu nöronal hücre ölümü, progenitör çoğalma ve yer değiştirme, ve ağır yapısal ve anatomik değişimler değil, aynı zamanda açık bir öğrenme kusurları değişikliklere nöron sonuçlar sadece NF-KB siny...

Ontolojik, hipokampus bilinen eski anatomik beyin yapılarından biridir. Bu tür uzun süreli bellek, uzaysal ve ilgili hafızanın oluşumu ve konsolidasyon düzenlenmesinde önemli fonksiyonlar gibi çeşitli karmaşık görevler için sorumludur. Anatomik olarak, hipokampus kendi subgranular bölge içinde granül hücreleri ve birkaç nöronal progenitörlerin içeren cornu ammonis (CA1, CA2, CA3 ve CA4) bölgeleri ve kıvrımlarının (dentat girus), dahil olmak üzere, piramidal hücre tabakası (stratum pyramidale) oluşmaktadır . Granül hücreleri olarak adlandırılan mossy liflerden (granül hücrelerin akson) ile CA3 bölgesine doğru çıkıntı. Geçen yüzyılın sonuna kadar, yetişkin memeli beyin hücre plastisite ve nöron eksik statik bir organ olduğuna inanılıyordu. Ancak, son iki yılda, kanıtların giderek artan miktarı açıkça yer alıyor yetişkin nörogenezi gösterir en azİki beyin bölgeleri, bölge subventricular (SVZ) ve hipokampus subgranular bölge. Daha önceki çalışmalar, ve diğer gruplar bu, transkripsiyon faktörü NF-KB yetişkin nöron önemli moleküler düzenleyicilerin biridir ve ağır yapısal kusurlar hipokampal ve bilişsel bozukluklar 1-6 onun de-regülasyon sonuçları olduğunu göstermiştir. NF-KB, beş DNA-bağlayıcı alt birimlerinin farklı dimerik kombinasyonlarından oluşan bir endüklenebilir transkripsiyon faktörünün genel adıdır: p50, p52, c-Rel, RelB ve p65 (RelA), bunlardan son üç transaktivasyon alanları vardır. Beyin içinde, sitoplazma içinde bulunan en bol bir şekilde p50 ve kappa B (IkB)-proteinleri inhibitörü ile bir inaktif halde tutulur p65, bir heterodimerdir. NF-KB odaklı nöron çalışma ve direkt olarak işlemek için, NF-KB subun tüm basit önlenmesini sağlamak için transgenik fare modelleri kullanmakonun, özellikle ön beyin 7 (Şekil 1). Ve -/tTA - Bu amaçla, biz şu transgenik fare hatları, IKB / çapraz yetiştirilmiş. Transgenik IKB / - hat NF-KB-inhibitörü IκBa (süper-represor IκBa-AA1) bir trans-dominant negatif mutant kullanılarak oluşturulan 8. Yabani tip IκBα aksine, IκBα-AA1 inhibitörünün fosforilasyonunu ve daha sonra proteozomal bozulmasını engelleyebilir alaninler (V32 ve V36) için mutasyona uğramış iki serin kalıntısına sahiptir. IκBa-AA1-transgenin ön beyin nöron-özel ifadesi için, IkB / - fareler fareler, kalsiyum-kalmodulin bağımlı kinaz barındıran çapraz-yetiştirilmiş IIα tetrasiklin trans-etkinleştirici bölgesiyle (tTA) tarafından tahrik edilebilir (CAMKIIα)-promoteri 9. p65 knock-out fareler nedeniyle masif karaciğer apoptoz 10, bir embriyonik ölümcül fenotip var, bu nedenle burada gösterilen yaklaşımı zarif bir yöntem sağlarpostnatal ve erişkin nöron NF-KB rolünü araştırmak için. Uzaysal öğrenme ve bellek çalışma klasik davranış testi Richard Morris, Morris su labirenti-(MWM) 11 olarak bilinen bir test tarafından 1980&#39;lerde tanımlanmıştır. Bu açık alanda su labirentinde, hayvanlar yönlendirme ve ekstra labirent ipuçları dayalı gizli bir platform üzerine opak sudan kaçmak için öğrenirler. MWM kuru bir varyant olarak adlandırılan Barnes labirenti (BM) 12&#39;dir. Bu test, bir bir çıkış kutusu olarak tanımlanan delik ve yönlendirme için görsel fazladan-maze ipuçları ile, plakanın sınırında düzenlenmiş dairesel delikler 20 ile dairesel bir levha kullanır. Hem deneysel paradigmalar bir kemirgen `ın su kaçınma, ya da açık, parlak ışıklı mekanlarda tarafından uyarılan uçuş davranış güveniyor. Her iki test uzaysal bir soruşturma ve ilgili bellek performansı sağlar. Hipokampus uzamsal hafıza oluşumunda genel ve önemli bir rol oynamasına rağmen, hipokampal rkatılan egions uygulanan teste göre değişir. BM test bellek enthorinal korteks (EC) ve DG 13-16 bir katkısı olmadan hipokampusun CA1-bölgesinde bulunan piramidal nöronlar arasında nöronal etkinlik ortaya çıkar. Özel olarak, klasik BM esas Önemli olarak, DG önemlisi işleme bölgesinin sadece ima sözde uzamsal örüntü tanıma 17, katılır EC V&#39;a CA1 EC III monosinaptik temporo-amonik yolu ile gösterime dayanır görsel ve mekansal bilgi değil, aynı zamanda farklı, örtüşmeyen gösterimleri içine benzer temsilleri veya anıları dönüşüm. Bu görev CA1 ve BM 15 test edilemez AT VI, için CA3 için DG EC II fonksiyonel bir tri-sinaptik devre gerektirir. Bu sorunları çözmek için, biz özellikle co dentat girus bağımlı bilişsel performansını test etmek için bir davranış testi olarak SPS-BM tasarladılarntrol hayvan ve NF-KB inhibisyonu aşağıdaki IkB / tTA süper-represör modelinde. Önemli olarak, MWM ya da BM aksine, SPS-BM nöron düşüklüğü kaynaklanan ince davranışsal hasarları ortaya çıkarabilir. Uzamsal-desen-ayırma EC II ve DG ve CA3 ve CA1 ve AT VI arasında işlevsel bir devre üzerinde sıkı sıkıya bağlı olduğundan, bu test içinde potansiyel nörojenezindeki değişiklikler, yosunlu lif yolunun değişiklikler veya doku homeostasisin değişikliklere son derece hassas DG. Teknik olarak, bizim test set-up Clelland ve arkadaşları tarafından araştırmaya dayanmaktadır., Mekansal ayrılık desen ahşap 8-kollu radyal kollu labirent (RAM) 19 kullanılarak test edildiği. Bizim modifiye set-up, sekiz silah yedi özdeş sarı gıda evler almıştır. Özet olarak, yöntemler, hipokampus, mossy lif çıkıntılar, nöronal hücre dE içinde doublekortin salgılayan (DCX +) hücre analizleri de dahil olmak üzere, burada gösterilenATH ve özellikle SPS-BM Burada yer, yetişkin nöron üzerinde bir etkiye sahip transgenlerin katıldığı diğer fare modelleri araştırmalar uygulanabilir. Diğer uygulamalar farmakolojik ajanların çalışma ve DG ve mekansal desen ayrılık üzerindeki etkisini ölçmek içerebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Moria MC17 Perforated Spoon&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td style="width:132px;">10370-18</td>
			<td style="width:167px;">removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi SV8</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14381-43</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SuperFrost Slides</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td align="right">1879</td>
			<td>slides for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">TissueTek OCT compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:132px;">1004200018</td>
			<td>embedding of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">005-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Rabbit Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">011-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">017-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Neurofilament-M antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>2H3</td>
			<td>IHC, Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-doublecortin&#160;antibody</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>IHC, Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-GFP antibody</td>
			<td>ab290</td>
			<td>abcam</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-BrdU antibody</td>
			<td>OBT0030G</td>
			<td>Accurate Chemicals</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Fluoro Jade-C</td>
			<td>FJ-C</td>
			<td>HistoChem</td>
			<td>Determination of neuronal cell death</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Betadine</td>
			<td style="width:127px;">&#160;MUNDIPHARMA</td>
			<td>D08AG02&#160;</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td>preparation of brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">H3393</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)</td>
			<td style="width:127px;">lab made</td>
			<td style="width:132px;">none</td>
			<td>plate for SPS-BM, diameter 120cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buraton rapid disinfectant&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sch&#252;lke &#38; Mayr</td>
			<td style="width:132px;">113 911</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2</td>
			<td>tse systems</td>
			<td style="width:132px;">302050-SW-KIT</td>
			<td>tracking and analysis of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>permeabilisation/IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">cryotome</td>
			<td style="width:127px;">Reichert&#160; Jung/Leica</td>
			<td style="width:132px;">Frigomobil 1206</td>
			<td>preparation of 40&#181;m brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth&#160;</td>
			<td>Art.-Nr. 0713</td>
			<td>embedding of the slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SYTOX green</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Food pellets (Kellog`s Froot Loops)</td>
			<td>Kellog`s</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:447px;">Prism, Version 3.0</td>
			<td style="width:127px;">Graph Pad Software, San Diego, USA&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Statistical evaluation of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Zen 2008 or Zen 2011 Software</td>
			<td style="width:127px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Software (Confocal microscope)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">D.P.X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">317616</td>
			<td>mounting medium for Fluoro Jade C staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the modulation and analysis of nf-&#954;b-dependent adult neurogenesis

Hipokampus epizodik anıların oluşumu ve konsolidasyon önemli bir rol oynar, ve mekansal yönde. Tarihsel olarak, yetişkin hipokampus, memeli beyin, çok statik bir anatomik bölgesi olarak incelendi. Ancak, son bulgular hipokampusun dentat girus mevcut nöronal devrelerin değişiklikler, aynı zamanda yetişkin nöron sadece içeren, yetişkinlerde büyük bir plastisite bir alan olduğunu göstermiştir. Bu esneklik, transkripsiyon faktörü NF-KB önemli bir rol oynadığı, kompleks transkripsiyonel ağlar tarafından düzenlenir. Yetişkin nöron, NF-KB aktivitesi ön beyin özgü nöronal engellenmesi için bir fare modeli de kullanılabilir çalışma ve işlemek için. Bu çalışmada, yöntem, yapısal açıdan, nöronal apoptoz ve progenitor çoğalması ve bilişsel önemi, hangi içeren NF-KB-bağımlı nöron analizi tarif edilmektedirh özellikle kıvrımlarının (DG)-bağımlı davranış testi, mekansal desen ayrılık-Barnes labirenti (SPS-BM) üzerinden değerlendirildi. SPS-BM protokolü sadece erişkin hipokampal nöron özellikle genlerin etkisini değerlendirmek için tasarlanmış diğer transgenik hayvan modelleri ile kullanım için adapte olabilir. Dahası, SPS-BM farmakolojik ajanları kullanarak, örneğin, DG-bağımlı öğrenmeyi araştıran ve manipüle amaçlı diğer deneysel ortamlarda kullanılabilir.

IkB / çapraz yetiştirme - tTA ve transgenik fare hatları hipokampta NF-KB aktivitesi şartlı inhibisyonuna yol açar. Çift transgenik fare (Şekil 1A) &#39;de IκBα-AA1-transjenin ekspresyonunu incelemek için, beyin izole cryosectioned ve GFP (yeşil floresan protein) karşı bir antikor kullanılarak boyandı. Konfokal lazer tarama mikroskobu CA1 ve CA3 bölgelerde transgenin yüksek ifade ile uyumlu idi ve dg içinde (Şekil 1 B). <...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÎºB-dependent Adult Neurogenesis at JoVE.com

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

NF-KB-bağımlı yetişkin hipokampal nöron manipülasyonu ve analiz için yöntemler tarif edilmiştir. Ayrıntılı bir protokol farelerin bilişsel sonuçların araştırılması için bir dentat girus-bağımlı davranış testi (uzaysal desen ayrılık-Barnes labirent adlandırılır) için sunulmuştur. Bu teknik aynı zamanda, diğer deneysel ortamlarda araştırmaları sağlama yardımcı olmalıdır.

NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Görüntüleme.  University of Bielefeld.  NF-KB-bağımlı yetişkin hipokampal nöron manipülasyonu ve analiz için yöntemler tarif edilmiştir. Ayrıntılı bir protokol farelerin bilişsel sonuçların araştırılması için bir dentat girus-bağımlı davranış testi (uzaysal desen ayrılık-Barnes labirent adlandırılır) için sunulmuştur. Bu teknik aynı zamanda, diğer deneysel ortamlarda araştırmaları sağlama yardımcı olmalıdır. 

Video: Methods for the Modulation and Analysis of NF-κB-dependent Adult Neurogenesis

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

3D Görüntüleme ve Morfolojik Analizi Yetişkin Mouse Serebrovasküler Döküm

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Nörobilim

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Embriyonik Neurogenesis çalışmak için bir Model olarak fare arka beyin

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler