Yazarlar Voltaire Gungab yazının hazırlanmasında yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen hibe tarafından desteklenen: H. Su Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32 GM008440 EJ Walker, WL Genç ve H. Su R01 NS27713 WL Genç, P01 NS44155) ve R21 NS070153; ve Amerikan Kalp Derneği (AHA 10GRNT3130004 H. Su).

1. Kan damarları gelen Takas <ol><li> Fare 0.25 ml serum fizyolojik içinde sulandırılmış 10 mg / kg xylazine ile 100 mg / kg ketamin intraperitoneal anestezisi. </li><li> Anestezi pençe tutam hiçbir yanıt tarafından onaylandıktan sonra, diyafram üzerinden kesilmiş, sadece xiphoid işlemi aşağıda makas, göğsünde bir kesi yapmak için makas kullanmak ve dorsal ve ventral segment, göğüs boşluğu maruz ile göğüs kafesi arasında kesmek. Sternum ve komşu göğüs duvarı, katlama ve hemostat ile güvenli kalp Açığa. Perikard kesesi, kalp açığa çıkarmak için cımbız ile açın. </li><li> PBS artı heparin (5 adet / ml) sıcak su banyosu çözüm 37 ° C ve çıkışı künt 22 gauge iğne ile tüp sıcak bağlı perfüzyon pompası (basınç 100mmHg) açın </li><li> Kalbin apekse yakın, sol ventrikül içine iğne takın. Sistemik kan çıkışı hemen etkinleştirmek için sağ atrium ve açık kesmek kadar kan i yıkamaya devam edindolaşımdan kaldırılmış. </li></ol> 2. Damar Sistemi içine Döküm Agent Perfüzyon <ol><li> Mix süzülmüş MV bileşik 4 ml ile 5 ml OG seyreltici: Microfil (Akış Tech, Inc Carver, MA) üreticinin protokol başına döküm çözüm hazırlayın. Katalizör 450μl (% 5) (OG sertleştirici) ekleyin. Çözüm çalışma süresi 20 dakikadır, ancak uygun viskozite sağlamak için kullanmadan önce hemen karıştırın. </li><li> 10ml şırınga içine ajan çözüm döküm Çekme 20 künt bir iğne, şırınga takın ve çözümü ile iğne doldurun. </li><li> Sol ventrikül içine kan kızarma için kullanılan aynı delikten iğne takın. Güvenli iğne kalp hemostat kelepçe yerleştirin. </li><li> Döküm ajan çözümü yaklaşık 3 ml / dk yavaş yavaş sol ventrikül içine enjekte edilir. Aşırı basınç döküm ajan veya potansiyel damar rüptürü yanlış akışına neden olabilir. </li><li> Dahil olmak üzere başarılı bir perfüzyon belirtilerini arayın: döküm görselleştirilmesibağırsak ve karaciğer damarsal, distal ekstremite renk değişikliği, ve burun ve dilde renk değişikliği ing ajan. Gerekli uygun perfüzyon ulaşmak için iğne yeniden ayarlayın. </li></ol> 3. Doku Toplama ve İşleme <ol><li> % 4 paraformaldehid beyin ve yer çıkarın gece 4 ° C </li><li> % 25 EtOH, 1 gün,% 50 EtOH, 1 gün,% 75 EtOH, 1 gün,% 95 EtOH, 2 gün ve% 100 EtOH, 2 gün oda sıcaklığında giderek konsantre EtOH içine doğrudan paraformaldehid koyarak beyin dehydrate: . </li><li> 2 gün boyunca oda sıcaklığında metil salisilat perfüze beyin çeker, kan damarlarının çevresindeki beyin dokusu netleştirin. </li><li> Bütün unsectioned açıklık beyin damarları, beyin, diseksiyon mikroskobu (Şekil 1) (Leica MZFL III mikroskop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) veya aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) (Leica DM / altında metil salisilat içine ile görüntülenmiş olabilir LS, Leica Microsystems). </li><li> Reclarificationdoku tamamen temizlenir değilse yapılabilir. Metil salisilat, transfer beyin itibaren 2 gün boyunca% 95 EtOH, 2 gün boyunca% 100 EtOH ve 2 gün boyunca metil salisilat. </li></ol> 4. Micro-CT Görüntüleme veya histolojik Uygulama Doku Hazırlama <ol><li> Beyin doğrudan (Şekil 4) açıklama sonra veya yeniden hidrasyon sonra mikro-BT ile görüntülenebilir. </li><li> Beyin dokusu histolojik analiz için hazırlamak için, seri seyreltilmiş EtOH ile beyin rehidrate% 95 EtOH, 1 gün;% 75 EtOH, 1 gün,% 50 EtOH, 2 gün,% 25 EtOH, 2 gün% 100 EtOH, 1 gün: PBS içinde saklayın. Beyin, daha sonra standart bir prosedür kullanılarak parafine gömülü olabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Vasküler döküm cerebrovasculature makroskobik beyin yüzeyi (Fig.1A) görülebilir. Parankim içinde damar ağacı (Şekil 1B) görüntülenmiştir aşağıdaki açıklama olabilir. Detaylı bir damar yapısıgörüntülü ve kapsamı diseksiyon (Şekil 3) ve mikro-BT (Şekil 4), bir aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) altında analiz edilebilir. Aydınlık alan mikroskobu kullanarak, damar, yüksek büyütme (Şekil 2B) (Şekil 2A) beynin yanı sıra bireysel mikrodamarlar kesit farklı odak uçakları görülebilir. Diseksiyon kapsamında, bir cerebrovasculature üç boyutlu yapısı (Şekil 3) daha iyi görselleştirme izin, tek bir odak düzlemli tüm vasküler yapı görebilirsiniz. Büyük damar morfolojisi ve tüm beynin damarsal bir diseksiyon mikroskobu altında çekilen görüntüler gösterir, ancak aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2B) ile çekilen fotoğrafları gösterilen detayları eksikliği olabilir. Bu teknik bize deneysel BAVM yetişkin fare modelinde 2 düzensiz damarları tespit etmek için izin verdi. Şekil 5 mikro-BT (Şekil 5A) ve aydınlık alan mikroskobu (Şekil 5B) tarafından tespit edilen aynı düzensiz damarlarının bir örnek gösterir. Hep birlikte, bu veriler t analiz olduğunu gösterirvasküler attıktan sonra çoklu görüntüleme araçları ile aynı örnek. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg" /> Şekil 1. Tüm fare beyin damar döküm. Önce (A) ve (B) solvent metil salisilat açıklama sonra. Gemileri beyin yüzeyinin (A) ve parankim aşağıdaki açıklama prosedürü (B) açıkça görüntülenmiştir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg" /> Şekil 2 açıklık vasküler döküm beyin aydınlık mikroskop görüntüleri. Beyin, çeşitli uçaklar ve farklı büyütme seviyelerinde görüntülü olabilir. Ölçek Bar 200μm (A) ve (B) 50μm. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg" /> Şekil 3 dorsal görünümü gösteren tüm yetişkin fare beyin cerebrovasculature 1x mikroskopta görüntü Diseksiyon. &lt;img alt = &quot;Şekil 4&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg&quot; /&gt; Şekil 4 Micro-CT dorsal görünümü Şekil 3&#39;te gösterilen tüm yetişkin fare beyin tarama görüntü. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg" /> Şekil 5 beyin arteriovenöz malformasyon tespit etmek için vasküler döküm yöntemi uygulanması. A) beyin damar döküm Micro-CT taraması ventral bir görünümden sağ hemisfer genişletilmiş, düzensiz AVM gibi gemiler bölge gösterir. Bölge büyütülmüş görüntü (beyaz kutu), sağ tarafta gösterilmiştir. B) Aynı düzensiz damarlar 50x büyütme aydınlık mikroskop altında görüntülendi. Ölçek çubuğu 50 mm.

<ol>
	<li>Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vivo+muCT+evaluation+of+neovascularisation+in+tissue+engineered+bone+constructs.">Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs.</a> Bone. 43, 195-202 (2008).</li><li>Walker, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriovenous+malformation+in+the+adult+mouse+brain+resembling+the+human+disease.">Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease.</a> Ann. Neurol. , (2011).</li><li>Iqbal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+novel+mono-+and+multivalent+VHH-fragments+and+their+application+for+molecular+imaging+of+brain+tumours.">Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).</li><li>Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+after+simultaneous+transplantation+with+neuro-epithelial+stem+cells+and+adjacent+mesenchymal+tissues+into+infarcted+rat.">Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat.</a> 145, 473-480 (2003).</li><li>Chugh, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cerebral+blood+volume+in+mouse+brain+regions+using+micro-computed+tomography.">Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography.</a> Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).</li><li>Marxen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med. Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. a. i. n. e. y., L, L., Silverman, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis:+vasa+vasorum+and+neovascularization+of+human+coronary+arteries.+A+possible+role+in+the+pathophysiology+of+atherosclerosis.">Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis.</a> N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).</li><li>Fossett, D. T., Caputy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Operative Neurosurgical Anatomy. , (2002).</li><li>Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+the+small+intestinal+mucosa+of+the+monkey+(Macaca+mulatta).">The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta).</a> Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).</li><li>Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+size+of+bronchopulmonary+anastomoses+in+sheep+lung.">Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).</li><li>Brady, J. M., Cutright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+of+measuring+blood+vessel+volume+in+bone+applied+to+the+mandible+and+humerus+of+the+rat.">A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat.</a> Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).</li><li>Evan, A. P., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferent+arterioles+in+the+cortex+of+the+rat+kidney.">Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney.</a> Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).</li><li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice.">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li></ol>

Laboratuar hayvanlarının kullanıldığı için deneysel prosedürler, University of California, San Francisco (UCSF) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

Biz burada çeşitli yöntemleri ile görüntülü olabilir yetişkin fare cerebrovasculature döküm için bir yöntem raporu. Bu yöntemin hastalık modeli BAVM Uygulama düzensiz damarlarının 3 boyutlu analiz sağlar. Potansiyel gelecek çalışmalar, mikro-BT görüntüleri nicelik, histolojik analiz, doku ve damar hastalığı ilerlemesi tanısı içerir. Ortak Sorunlar ve Öneriler Karşılaşılan Beynin damarsal Komple perfüzyon her zaman elde değil. Sol atrium veya aort çatlaması olmaksızın distal kan damarları ulaşmak için yeterli basınç olması bir sorundur. Bunu aşmak için, yaklaşık 100mmHg tutarlı bir basınç uygulayın. Ayrıca, aort içine ajan döküm uygun çıkış sağlamak için iğne pozisyonu ayarlayın. Döküm ajan beyin damarlarının ulaşabilirsiniz karotis arterler sınırlı değildir ki önemlidir. Kritik işlemler için geliştirilmiş küçük bir gemi ile ilişkilifüzyon (1): damar kan uygun takas döküm ajan (2) filtrasyon; ve (3) ajan enjeksiyon döküm sırasında iğne yerleştirilmesi. Bakım, sol atrium ve akciğer içine ajan döküm enjeksiyon önlemek için alınmalıdır. Diğer araştırmacılar başarıyla ek prosedürleri kullanarak 3 olmadan fare ve sıçan 4 cerebrovasculature perfüze var. Hemotoxylin% 93 damar lümeni perfüzyon 5 gösterdi Microfil perfüze gemilerin Manuel analiz zıt. Daima atmayın veya hızlı polimerize ve araçlar çok konular için kullanılamaz olarak döküm maddesi ile temas gelen herhangi bir araç tamamen temiz. Çevresindeki fare beyin dokusu netleştirilmesi zor olabilir. Metil salisilat batırıldıktan sonra, doku, damar görüntüleme zorlaştırır opak görünebilir. Uygun dehidratasyon ve açıklama sağlanması, bu sorunu çözmek gerekir. Bir rocker beyin dokusunun yerleştirilmesi sırasında alkol ve metil salicylate tedavi doku açıklama artırabilir. Tekniğin dezavantajları Bu tekniğin sınırlamalar şunlardır: (1) katalizör ilave edildikten sonra hızlı bir şekilde kalınlaşmasına olarak karıştırılarak hemen sonra döküm ajan çözüm enjekte etmek için gerekli olan, (2) döküm aracı kolayca büyük iletkenlik damarları doldurur, ama değil mi arteriol (direnç damarları) ve kılcal (besleyici damarlar) gibi güvenilir küçük gemilere, dolgu ve bazı gruplar mikro-CT görüntüleme 1,6 Microfil tercih rağmen (3), mikro-BT görüntüleme için en iyi radyoopak kontrast değildir. Ancak, uygun iğne yerleştirilmesi, geminin konumu ve perfüzyon basıncı da dahil olmak üzere yukarıda önerilen önerileri aşağıdaki, küçük damarları tam bir döküm elde edilebilir. Çeşitli analiz araçları çeşitli adaptasyon, bu ajan, arteriyel ve venöz dolaşım da dahil olmak üzere, serebrovasküler yapısını analiz etmek için değerli bir araç yaparperspektifler. Tekniğin Uygulamaları Bu yöntemin avantajı, geniş bir uygulama potansiyeli. Döküm, arterler, venler, bünyesinde tüm doku kılcal damarları dahil tüm damarları, dolgular, çeşitli türler birden fazla organların vasküler yapıları analiz edilebilir. Daha önceleri, diğer grup insan, maymun 9, 10 koyun, sıçan 4,11,12, fare 3,13 8 7 büyük ve küçük gemiler için bu perfüzyon kullanmışlardır. Biz şimdi, hem de sağlıklı ve hastalıklı devletlerin, fare beyin mikrodamarlar yapısını analiz 2 bu tekniği kullanarak kanıt gösteriyor . Buna ek olarak, çeşitli organlarda gemilerin görselleştirme artırmak için farklı boyutlarda ve farklı renkler gemileri serpmek için çeşitli viskozite Microfil çözümleri vardır. Örneğin, kırmızı ile tezat soluk beyin parankimi kolayca görüntülenebilmekte ve sarı olabilirkoyu kırmızı miyokardın. Ayrıca, malzeme radyoopak olduğu gibi, damarlar mikro-CT 3D dönebilen bir görüntü elde etmek için tarama görüntülü olabilir. Dokusu aynı zamanda görüntülü edildikten sonra parafin bölümleri ve histolojik analiz için kullanılabilir. Sonuç Damar, cerebrovasculature morfolojik yapısını incelemek için bir dizi analiz teknikleri kullanarak adapte edilebilir yetişkin fare beyin, kan damarları, bir döküm yapmak için buraya bir protokol göstermektedir. Ayrıca, düzensiz şekilli genişlemiş damarlar tarafından temsil edilen, BAVM hastalık durumu bir model, bu yöntemin uygulanması için kanıt sağladı venöz dolaşım için arteriyel kan şant. Çeşitli vasküler döküm yöntemleri vardır. Bir damar döküm için buraya sağlayan basit bir protokoldür, çeşitli görüntüleme yöntemleri kullanılarak yetişkin fare beynin damarsal incelemek için bir araç olarak kullanılıyor olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> FlowTech, Inc. </td><td> MV130 </td><td> 4 ay raf ömrü </td></tr><tr><td> Metil salisilat </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3695-500 </td><td> doku açıklığa kavuşturmak için </td></tr></tbody></table>

cerebrovascular casting of the adult mouse for 3d imaging and morphological analysis

Vasküler görüntüleme, serebrovasküler hastalıklar, beyin arteriovenöz malformasyonlar (BAVMs) klinik tanı ve tedavisinde çok önemlidir. Hayvan modelleri, serebrovasküler hastalıklar etiyopatogenezinin multi ve potansiyel tedaviler eğitimi için gerekli olan. Görüntüleme büyük hayvanlarda damar nispeten kolaydır. Ancak, damar görüntüleme yöntemleri fare beyin hastalığı modelleri gelişmekte olan genetiği değiştirilmiş fare hatlarının maliyeti ve yer durumu nedeniyle arzu edilen bir durumdur. Görüntüleme fare serebral vasküler ağacın bir sorundur. Insanlar ve büyük hayvanlar, makrovasküler angioarchitecture değerlendirilmesi için altın standart (iletkenlik) x-ray kontrast tabanlı kateter anjiyografi, küçük kemirgenler için uygun bir yöntem değil. Bu makalede, birçok d kullanarak, analiz edilebilir arterler, venler ve kılcal damarlar dahil olmak üzere, tüm vasküler yatağın dayanıklı bir iskelet oluşturur, serebrovasküler döküm bir yöntem mevcutifferent yöntemleri. Fare cerebrovasculature mikrodamarlar komple döküm zor olabilir, ancak bu zorlukları, adım-adım, bu protokolde ele alınmaktadır. Vasküler döküm malzeme Intracardial perfüzyon sayesinde, vücuttaki tüm damarları döküm. Beyin sonra kaldırılır ve organik solvent metil salisilat kullanılarak açıklık olabilir. Beyin kan damarlarının üç boyutlu görüntüleme, herhangi bir konvansiyonel aydınlık mikroskop ya da diseksiyon mikroskobu ile basit ve masrafsız bir görüntülenebilmekte. Döküm cerebrovasculature aynı zamanda görüntülü ve mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) 1 kullanılarak sayısal olabilir. Buna ek olarak, görüntülü edildikten sonra, döküm beynin histolojik analiz için parafine gömülü olabilir. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında bu damar döküm yöntemi yararı aydınlık mikroskopik analizi de dahil olmak üzere, çeşitli analitik araçlar, geniş bir adaptasyon, CT nedeniyle radyoopak karakteristik taramamalzemenin yanı sıra, histolojik ve immünohistokimyasal analiz teristic. Bu doku etkin kullanımı, hayvan kullanımını kaydetmek ve maliyetleri azaltabilir. Biz son zamanlarda düzensiz kan damarlarını mikroskobik seviye 2 yetişkin BAVM bir fare modeli görselleştirmek, ve mikro-CT taraması görüntülü biçimlendirilmiş damarların ilave bir resim sağlamak için bu yöntemi uygulaması göstermiştir . Bu yöntemin dezavantajı var ve her türlü analiz için ideal olmamasına rağmen, kolay öğrenilen ve vücutta yaygın kan damarlarının damar döküm uygulanan bir basit, pratik bir tekniktir.

Watch this Scientific Journal Video about Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis at JoVE.com

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Bu makalede, biz gerçekleştirmek için kolay ve görüntü yetişkin fare beyin damar ağacı kullanılabilir serebrovasküler döküm için basit ve pratik bir tekniği mevcut.

3D Görüntüleme ve Morfolojik Analizi Yetişkin Mouse Serebrovasküler Döküm

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

cerebrovascular-casting-adult-mouse-for-3d-imaging-morphological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Bu makalede, biz gerçekleştirmek için kolay ve görüntü yetişkin fare beyin damar ağacı kullanılabilir serebrovasküler döküm için basit ve pratik bir tekniği mevcut.

Video: Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

Stimulus-spesifik kortikal görsel uyarılmış potansiyel morfolojik desenler

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Fluorescence Angiography for Evaluation of Aneurysm Perfusion and Parent Artery Patency in Rat and Rabbit Aneurysm Models

Brain aneurysm treatment focuses on achieving complete occlusion, as well as preserving blood flow in the parent artery. Fluorescein sodium and indocyanine green are used to enable the observation of blood flow and vessel perfusion status, respectively. The aim of this study is to apply FVA to verify real-time blood flow, vessel perfusion status and occlusion of aneurysms after induction of sidewall aneurysms in rabbits and rats, as well as to validate the procedure in these species.
Twenty sidewall aneurysms were created in 10 rabbits by suturing a decellularized arterial vessel pouch on the carotid artery of a donor rabbit. In addition, 48 microsurgical sidewall aneurysms were created in 48 rats. During follow-up at one month after creation, the parent artery/aneurysm complex was dissected and FVA was performed using an intravenous fluorescein (10%, 1 mL) injection via an ear vein catheterization in rabbits and a femoral vein catherization in rats. Aneurysms were then harvested, and patency was evaluated macroscopically.
Macroscopically, 14 out of 16 aneurysms in rabbits indicated no residual parent artery perfusion with totally occluded luminae, however 11 (79%) were detected by FVA. Four aneurysms were excluded due to technical problems. In rats, residual aneurysm perfusion was macroscopically observed in 25 out of 48 cases. Of the 23 without macroscopic evidence of perfusion, FVA confirmed the incidence of 22 aneurysms (96%). There were no adverse events associated with FVA. Fluorescein is easily applicable and no special equipment is needed. It is a safe and extremely effective method for evaluating parent artery integrity and aneurysm patency/residual perfusion in an experimental setting with rabbits and rats. FVA using fluorescein as a contrast agent appears to be effective in controlling patency of aneurysms and the underlying vessel and can even be adapted to bypass surgery.

We present a protocol to efficiently evaluate aneurysm perfusion and vessel patency of sidewall aneurysm in rats and rabbits, using fluorescein-based fluorescence video angiography (FVA). With a positive predictive value of 92.6%, it is a simple but very effective and economical method with no special equipment required.

Rat ve Rabbit anevrizma modellerinde anevrizma perfüzyon ve ebeveyn arter patensinin değerlendirilmesi için floresan anjiyografi

Brain aneurysm treatment focuses on achieving complete occlusion, as well as preserving blood flow in the parent artery. Fluorescein sodium and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...