Bloomington Drosophila hisse senedi Merkezi'nden (NIH P40OD018637) elde edilen hisse senetleri bu çalışmada kullanılmıştır. Bu yayında bildirilen Araştırma Biyomedikal araştırma Excellence üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri grant numarası altında Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) ağ tarafından desteklenmiştir P20GM103430 ve Rhode Island Vakfı tarafından. Yazar J. suları ve P. Snodgrass-kemer bu protokolü gelişmekte olan desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

1. assay hazırlık (1 gün)
<ol><li>Bir kuluçka veya 11 ° C'ye ayarla bir ısı kontrollü Oda metabolik analyzer (Tablo reçetesi) yerleştirin Not: tahlil çalıştırırken oluşur ~ 14 ° C sıcaklık dalgalanması için izin verdiği bu sıcaklık 25 ° C'de alınan ölçümler için idealdir. Bu çalışma sırasında aracı tarafından üretilen ısı kaynaklanır.</li>
	<li>Metabolik Çözümleyicisi'bağlı olan bilgisayarda uygun yazılımını açın. Sayısal Sıcaklık ekranın alt sol tarafında tıklayın. Açılan yeni pencerede "Isıtıcı" komutu yanındaki kutuyu tıklatın ve onay işaretinin olun. 25 ° C sıcaklığa ayarlamak ve tolerans aralığı 0.2 ° c ok tuşlarını kullanarak ayarlayın. Not: Birkaç saat kararlı sıcaklıklar elde etmek için gerekir.</li>
	<li>Kartuş konteyner (Tablo reçetesi) açın ve sondalar dokunmadan yeni plaka kartuşunu çıkarın. Not: Yeni plaka kartuş kalibrasyon sırasında kullanılır ve metabolik tahlil çalıştırırken kullanılmaz.</li>
	<li>Bir calibrant çözüm (Tablo reçetesi) 200 μL yardımcı programı plaka ve sensör suyla temasa geri yardımcı programı plaka üstüne kartuşu çıkarma, probları yer ekleyin. Sondalar dokunmaya değil ve onları ışıktan korumak.</li>
	<li>Parafin film kartuşla kapatın.</li>
	<li>Gecede 25 ° C'de kartuş kuluçkaya</li>
</ol>2. tahlil medyası hazırlama (2 gün)
<ol><li>10 mM glikoz ve 10 mM sodyum pyruvate tahlil orta olarak ekleyin.</li>
	<li>Sıvı bu sıcaklığa equilibrated kadar 25 ° c orta kuluçkaya.</li>
	<li>PH 7.4 pH metre kullanarak için ayarlayın.</li>
</ol>3. Drosophila melanogaster beyin (gün 2) metabolik analizi için yazılımın kurulması
<ol><li>1.2. adımda kullanılan metabolik analyzer metabolik yazılım ayarlayın.</li>
	<li>"Şablon" yazılım ana ekranında seçin.</li>
	<li>Yeni bir tahlil tasarım başlatmak için "boş" çift tıklatın.</li>
	<li>Hücre tahlil plaka tasarımını görüntülemek için en iyi araç çubuğundaki "Plaka göster" butonuna tıklayın. Not: Hücre tahlil plaka beyin örnekleri içerir ve çalıştırmak metabolik tahlil başlamadan önce Kartuşu ile eşleştirilmiş olacaktır.</li>
	<li>
Ekle'yi tıklatın grupları 3 x düğme.
	<ol>
<li>"Grup 1" etiketini çift tıklatın ve "Deneysel" olarak yeniden adlandırın. Not: Bu grup sinek bir beyin ve ilaçlar ile tedavi bir mikro-doku kısıtlama içerir.</li>
		<li>"Grup 2" etiketini çift tıklatın ve "Kontrol" olarak yeniden adlandırın. Not: Bu grup sinek bir beyin ve hiçbir ilaç tedavisi ile bir mikro-doku kısıtlama içerir.</li>
		<li>Çift-tıkırtı üstünde "Grup 3" etiket ve rename o için "kısıtlama yalnızca". Not: Bu grubun bir mikro-doku kısıtlama olmaksızın herhangi bir beyin ya da ilaç tedavisi içerir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kuyuları hücre plaka örnekleri nerede yerleştirilmesi içindir üzerinde dayalı olan her gruba atayın.
	<ol>
<li>"Deneysel" etiketini tıklatın ve sonra kuyu B2 - B8 plaka haritada vurgulayın.</li>
		<li>"Kontrol" etiketinde'ı tıklatın ve sonra kuyu C2-C8 plaka haritada vurgulayın.</li>
		<li>Tıkırtı üstünde "kısıtlama tek" etiket ve o zaman vurgulamak wells D2-D8 plaka harita üzerinde.</li>
		<li>Tüm dört köşe (A1, A12, H1 ve H12) arka plan olarak atanan kontrol edin. Not: Wells plaka çevre boyunca herhangi bir kenar etkileri azaltmak için kullanılır. Bu bir yazılım varsayılan ayardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protokol hazırlamam için en iyi araç çubuğundaki "Protokol" düğmesini tıklayın.
	<ol>
<li>"Ölçüm Ayrıntıları Düzenle" temel ölçüm kutusunda tıklatın.</li>
		<li>"3:00" döngü süresi bazal ölçü değiştirerek metabolik analyzer beyin ölçecektir zamanını tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını ayarlayın.</li>
		<li>Metabolik analyzer bazal bekleme döngü süresi için değiştirerek beyin ölçümleri arasında bekleyeceği süreyi ayarlamak "0:00" tıklatarak yukarı ve aşağı okları.</li>
		<li>Metabolik analyzer medya mix süreyi ayarlamak bazal değiştirerek beyin ölçme önce "1:00" döngü süresi tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını karıştırın.</li>
		<li>Bazal döngüleri, ölçü birimi, bekle ve mix döngüleri, ye içerir toplam sayısını ayarlamak "7" tıklatarak yukarı ve aşağı okları. Not: İstikrarlı oksijen tüketim oranı ölçümleri başlar, tahlil ~ 25 min sonra elde edilir.</li>
		<li>Üst sol araç çubuğunda bulunan "enjeksiyon Ekle" düğmesini tıklayın.</li>
		<li>"Enjeksiyon etiketinde" tıklatın ve "Oligomycin" değiştirin.</li>
		<li>Enjeksiyon ölçü, bekle ve mix kez bazal için uyum için ayarlayın.</li>
		<li>Tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını enjeksiyon döngüleri "6" için toplam sayısını ayarlayın.</li>
		<li>Aygıtlarından 3.7.6 - 3.7.8 ama "İçin Rot/AA" etiketini değiştirmek ve tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını enjeksiyon döngüleri 7 toplam sayısını ayarlayın.</li>
		<li>En iyi araç çubuğunda "Tahlil çalıştırmak" düğmesini tıklayın.</li>
		<li>"Tahlil kaydetmek" ve tahlil kartuş (Tablo reçetesi) kurma başlamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kalibrasyon (2 gün) için kartuşun hazırlanması
<ol><li>
25 ° C kuluçka Kartuşu ve kapaðý çýkarýn.
	<ol>
<li>Küçük üst sol dairesel enjeksiyon bağlantı noktasını, bağlantı noktası A, hücre plaka üzerinde tüm ilgili deneysel kuyuları için kartuş 100 mikron oligomycin 20 μL ekleyin ve 20 μL tahlil medya kontrol ve arka plan wells de dahil olmak üzere diğer Wells, A bağlantı noktası ekleyin. Not: Kartuş 4 Port (A-D) her hücre plakasına ne örnekler içerir karşılık gelen 96 wells için içerir. Bu adım örnekleri eklemeden önce yapılır. Bir kez de metabolik Çözümleyicisi tarafından uyuşturucu enjekte edilir 100 mikron oligomycin sonuçlarının 20 μL hücre plaka 10 mikron son oligomycin konsantrasyon ekleyerek. Oligomycin bir ATP sentaz inhibitörü olduğunu. Elde edilen oksijen tüketimi değeri ATP bağlı solunum beyinde miktarını yansıtır. Düzgün belirtilen kuyu uyuşturucu enjekte için aynı mektup tüm bağlantı noktaları ile aynı güç sıvı, hatta değilse kullanımda doldurulması zorunludur.</li>
		<li>50 mikron Rotenon/antimycin A 22 μL küçük üst şu dairesel bağlantı noktasına ekleyin, hücre plaka üzerinde tüm ilgili deneysel kuyuları için kartuş B, liman ve tahlil medya 22 μL kontrol ve arka plan wells de dahil olmak üzere diğer wells, B noktasına ekleyin. Not: bir kez de metabolik Çözümleyicisi tarafından uyuşturucu enjekte edilir bir son Rotenon/Antimycin hücre plaka 5 mikron bir konsantrasyon sonuçlanır. Rotenon ve antimycin A inhibitörleri, elektron taşıma zinciri kompleksleri ı ve III, sırasıyla vardır. Elde edilen oksijen tüketimi değeri beyinde sigara mitokondrial solunum yansıtır.</li>
		<li>"Çalışma" Başlat dolu kartuş yardımcı programı plakalı araç, makine sağ taraftan uzanan plaka loader ile karşı karşıya zaman sol üst köşede konumlandırılmış iyi A1 ile metabolik çözümleyicisine yerleştirmek için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Ben denge ve metabolik tahlil örnekleri içeren hücre plaka ile başlayan önce kartuşu kalibrasyonu başlamak için yazılım hazır yaşıyorum" seçin. Not: Program dosyayı kaydedin ve sonra başlamak sorar sıcaklığına ve ayarlama. Bu adımlar 1 h. adımları 5-8 denge ve kalibrasyon saatinde yapılmaktadır.</li>
</ol>5. mikro-doku bağlar (2 gün) hazırlanması
<ol><li>1 mikro-doku kısıtlama ölçülür beyin başına artı kullanmak için en az 3 (% 70 etanol içerir) saklama kabı üzerinden yalnızca sınırlama denetimleri seçin.</li>
	<li>Bağlar taze % 70 etanol ile durulayın ve onları yıkamak deiyonize suyla 3 x 2 dakika her biri, bir hasır sepet ve 6-şey plaka (Tablo reçetesi) kullanarak. Bağlar hala bir alkol kokusu verirsen ek su yıkar ekleyin.</li>
	<li>Mikro-doku bağlar tahlil medyada yıkayın ve kullanıma hazır olana bu çözümde bırakın.</li>
</ol>6. diseksiyon Drosophila melanogaster larva beyin (2 gün)
<ol><li>Geç (göçebe) üçüncü INSTAR larva yüksek hassasiyetli kullanarak kültürlü Oregon-R sinekler bir şişe seçin, 5 (0,10 x 0,06 mm2) cımbız stil.</li>
	<li>Larva 1 x PBS 500 μL içeren bir temiz diseksiyon spot plaka (Tablo reçetesi) kuyuya yerleştirin. Not: Bir cam levha ile çöküntü, küçük doku ve organizmaların incelemek için kullanılan spot bir plakadır.</li>
	<li>Larva yavaşça su kuyusunda sallayarak Cımbız kullanarak yıkayın.</li>
	<li>Larva 1 x PBS 500 μL içeren bir spot plaka temiz kuyuya taşımak.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskop altında spot tabak koyun.</li>
	<li>Larva kendi midsection, cımbız, bir çift ile göz kanca cımbız ikinci bir çifti ile açgözlü iken kavramak.</li>
	<li>Yavaşça ve sorunsuz larva cımbız iki kümesi kullanarak ters yönde çek.</li>
	<li>Genellikle konaklamalar için göz kanca bağlı beyin görselleştirmek ve sık göz antennal diskler için eklenmiş.</li>
	<li>Dikkatle ek doku beyin, beyin tutmak için göz kancalar kullanarak kaldırın. Son olarak, beyin üzerinden göz kanca ayırın.</li>
	<li>Cımbız disseke beyin için yeni bir kuyu 1 x PBS içeren spot bir plaka üzerinde taşımak için kullanın.</li>
	<li>14 beyin disseke 6.1-6.10 tamamlayana dek. Not: Diseksiyon başlar, toplam süre olarak tahlil çalıştırılmasını 30 dk aşmaması gerekir.</li>
</ol>7. ek disseke beyin 96-iyi metabolik tahlil hücre plaka (2 gün)
<ol><li>Deney, deneysel dahil olmak üzere, denetim, salt kısıtlama ve arka plan wells kullanılan 50 μL 96-iyi metabolik tahlil plaka (Tablo reçetesi) kuyu için tahlil medya ekleyin.</li>
	<li>Dikkatli bir beyin A2-A8 ve B2-B8 hücresi plaka, cımbız, bir spatula veya bir pipet kullanarak her kuyudan yerleştirin. Not: Bu diseksiyon mikroskop uzak yapılabilir.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskop altında bir bükülmüş iğne mikro-sonda beyin kuyunun için lavabo için kullanın.</li>
	<li>Yavaşça beyin üç yükseltilmiş küre sonda kullanarak ortasında konumlandırın.</li>
</ol>8. mikro-doku bağlar 96-iyi metabolik tahlil hücre plaka (2 gün) eklenmesi
<ol><li>Cımbız kullanarak, mikro-doku kısıtlama iyi tahlil plaka kenarına yerleştirin ve mikroskop aşağı bakacak şekilde plastik halka ve üstüne mesh ile odaklı olduğunu incelemek için kullanın.</li>
	<li>Mikroskop altında plaka kaldırmak ve her iki tarafında ve hafifçe kısıtlama kavramak için kullanım cımbız kuyunun içine bırakın.</li>
	<li>Bir bükülmüş iğne mikro-sonda ilk sayısı aşağı kuyunun içine itmek için kullanın.</li>
	<li>Mikroskop altında beyin doku kısıtlama görülebilir ve kuyuda merkezli olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>8.1 – 8,4 tahlil olacak bütün kuyuları için adımları yineleyin — A2-A8, B2-B8 ve C2-C8.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde tahlil medya her birine deneysel 130 μL, kontrol ve salt kısıtlama wells ekleyin.</li>
	<li>Beyin ve mikro-doku bağlar onları mikroskop altında görselleştirme tarafından medya eklenirken kımıldamadım olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Arka plan denetim olarak kullanmak için dört köşe wells için 180 μL tahlil medya ekleyin.</li>
</ol>9. metabolik Analyzer ve tahlil (2 gün) başlangıcı hücre plakasına eklenmesi
<ol><li>Denge ve kalibrasyon örnek içeren hücre plaka-e sevketmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için bekleyerek tam olduğundan emin olun.</li>
	<li>"Açık" i seçin ve araç yardımcı programı plaka çıkarmak bekleyin.</li>
	<li>Yardımcı program plaka kaldırın ve hücre plaka olmadan kapağı, aynı yönde ekleyin.</li>
	<li>"Yük hücre hücre plaka almak ve kapatmak belgili tanımlık tepsi kalıbı" araç için seçin ve daha sonra tahlil başlar.</li>
	<li>Ölçümlerde görüntülemek gerçek-zaman ile belgili tanımlık bilgisayar yazılımı çalıştıran bilgisayar ekranında hata çubukları.</li>
	<li>Tahlil tamamlandıktan sonra çkarlyor hücre plaka ve kartuş kaldırın. Not: Yeniden kullanılan 5 eþleþtirilmiþ kartuşların ve hücre tabak olabilir x.</li>
</ol>10. sonrası ölçüm analiz (2 gün)
<ol><li>Diseksiyon mikroskop tahlil tamamlandıktan sonra beyin ve mikro-doku bağlar hala düzgün kuyuda yer doğrulamak için kullanın. Herhangi bir wells anormallikler ile çözümleme dışı bırakmak.</li>
	<li>Oksijen tüketim hızı (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) verileri daha ayrıntılı bir çözümleme için verme.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+related+neurodegenerative+disorders.">Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders.</a> Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-derived+mutations+in+IDH1+dominantly+inhibit+IDH1+catalytic+activity+and+induce+HIF-1alpha.">Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha.</a> Science. 324 (5924), 261-265 (2009).</li><li>Brody, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metabolic+changes+in+major+depressive+disorder+from+pre-+to+post-treatment+with+paroxetine.">Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine.</a> Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>Dona, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+the+identification+of+metabolites+in+NMR-based+metabonomics/metabolomics+experiments.">A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. -. M., R&#252;hl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).</li><li>Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cancer+cell+metabolism+with(13)C+flux+analysis:+Recent+progress+and+future+challenges.">Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges.</a> Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).</li><li>Clark, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+recording+of+blood+oxygen+tensions+by+polarography.">Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography.</a> Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).</li><li>Lighton, J. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Metabolic+Rates.">Measuring Metabolic Rates.</a> Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).</li><li>Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+measuring+cellular+bioenergetics+using+extracellular+flux.">Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux.</a> Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).</li><li>Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+whole+white+adipose+tissues.">A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues.</a> Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).</li><li>Fan, Y. -. Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mitochondrial+activity+in+renal+proximal+tubule+cells+from+young+spontaneously+hypertensive+rats.">Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats.</a> Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+glycolysis+is+essential+for+neuronal+survival+in+drosophila.">Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).</li><li>Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+oxygen+consumption+increase+following+acute+HDAC/KDAC+inhibition+in+Drosophila+tissue.">Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Tipping, M., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+device+for+restraining+contents+of+a+cell+plate.">Method and device for restraining contents of a cell plate.</a> United States patent. , (2017).</li><li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+method+for+measuring+whole+brain+metabolism+in+model+systems.">A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems.</a> Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).</li><li>Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+as+tools+for+metabolic+studies.+I.+A+survey+of+toxic+antibiotics+in+respiratory,+phosphorylative+and+glycolytic+systems.">Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).</li><li>Turrens, J. F., Boveris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+anion+by+the+NADH+dehydrogenase+of+bovine+heart+mitochondria.">Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria.</a> Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).</li><li>Potter, V. R., Reif, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+an+electron+transport+component+by+antimycin+A.">Inhibition of an electron transport component by antimycin A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Origin+of+Cancer+Cells.">On the Origin of Cancer Cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis:+A+Hallmark+of+Cancer+Metabolism.">Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).</li><li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen.">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).</li></ol>

M. Tipping geçici patent açıklanan bu protokolü17' mikro-doku bağlar için tutar.

Burada, D. melanogaster larva ve yetişkin beyin ex vivo metabolik analizi için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bazal koşullar altında nasıl metabolik olarak aktif beyin olduğunu ve bir doku mitokondrial karşı glycolytic solunum daha bağımlı hale gelmiştir olup olmadığını belirlemek için oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları gösterir, sırasıyla11.
Beyin inhibitörleri veya tedavi edici ilaçlar ile tedavi daha fazla dokunun metabolik durumu hakkında bilgi sağlar. Metabolik yüzeylerde Warburg etkisi22 veya glutaminolysis23araştırmak için glutamin için test etmek için glikoz gibi belirli metabolitleri bağımlılıkları belirlemek için de eklenebilir — metabolik yeniden programlama içinde her iki ortak. Uzun vadeli çalışmalar, larva veya sinekler enjeksiyon bağlantı noktalarını kullanmak yerine uyuşturucu da beslenen ve beyin aralıklarla veya bağlı olarak deneysel tasarım son noktada denetlesinler. Bu yöntem için çeşitli uygulamalar getirilebilir.
Bu yöntem beyin yerine getirilmiş ancak diğer larva18 ve yetişkin dokuları analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca, diğer küçük model sistemleri tüm organizmalar18 veya doku ölçmek için bu yöntemi kullanabilir. Bu yöntem diğer sistemler için en iyi duruma getirme için tek organ, doku veya organizma boyutunu kısıtlamadır. Mikro-doku kısıtlama tarafından oluşturulan odası için tahlil çalışan boyut engeldir. Metabolik çıktı beyin veya test edilen doku için çok düşüktür ve örnek boyutu bir kısıtlaması değil, örnekleri havuzu tahlil ölçümleri ve duyarlılığı artırmak için kullanılabilir. Diğer uygulamalar için bu iletişim kuralını değiştirme yalnızca küçük en iyi duruma getirmeleri 1) uygun ölçü birimi seçimi de dahil olmak üzere, gerektiren ve döngüsü numaraları ve zamanlama ve 2) belirlemede etkili tedavi konsantrasyonlarda doku için karıştırın. Ölçü ve karıştırma kez metabolik Çözümleyicisi tarafından her döngüsü sırasında ölçülen izleme oksijen konsantrasyonu tarafından belirlendi. Bu çalışma tamamlandıktan sonra O2 genel bakış penceresinde Y2 eksen düğmesini seçerek görüntülenebilir. Her döngüsü sırasında karıştırma sırasında ilk oksijen konsantrasyonu dönüş ardından doku'nın oksijen tüketimi sırasında ölçülen süreyi yansıtan bir açılan oksijen konsantrasyonu olmalıdır. Bu desen görülmektedir kadar ölçü ve mix kez test edilmelidir. Bu yöntemi kullanarak, diğer böcek beyinler incelenmiştir. Bu beyin burada kullanılan ancak hala doku kısıtlama tarafından oluşturulan odası sığması sinek akıldan çok daha büyük. OCR okuma bu beyin üzerinden 400 pmol / dk (veri gösterilmez) yüksek. Bu çalışmalar yanı sıra bütün-fly oksijen tüketimi18,24, ölçme diğer çalışmalar ile hizalamak OCR oranları sonuçlarından D. melanogaster beyin oksijen sınırlı değildi öneririz. D. melanogaster beyin ve diğer organizmalar dokulardan için bu yöntemi uygulayarak dört kritik adımlar için özel dikkat gerektirir.
Başarılı bir şekilde biyolojik olarak uygun ve tekrarlanabilir ölçümler elde etmek için takip edilmesi gereken Protokolü'nün kritik adımlar vardır. İlk olarak, bir mikro-doku kısıtlama kullanımı bu yöntem için gereklidir. Bu bağlar özellikleri ve listelenen malzemeleri kullanarak üretim esastır. Malzemeler nedeniyle etkisiz kimyasal bileşimi ve yeteneklerini karıştırma adımları olmadan hava kabarcıkları oluşturulması sırasında uygun ortam değişimi izin için seçildi. İkinci olarak, zamanında bir diseksiyon ve plaka hazırlık doku metabolik çıkışını en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Kısa diseksiyon kez değil önemli ölçüde zarar beyin. Diğer çalışmalar düzgün bir perfüzyon depolanmış olsa diseksiyon odası sonra25sinek beyin gün saat süre hayatta tutulabilir olduğunu göstermiştir. Ancak, uzun bir süre önce tahlil için tahlil medyada oturan beyin bırakılırsa Şekil 3B ve 3D, görüldüğü gibi oksijen Tüketim oranları azalmıştır. Tahlil sırasında örnekleri her döngüsü sırasında karıştırma bir adım tabi. Bu karıştırma sadece kimyasal bileşikler enjeksiyonları ile yardımcı olur ancak aynı zamanda medya recirculate ve oksijen sağlamak için görür. Onlar medya tezgah üstüne kuluçka daha metabolik olarak aktif bu ölçü-mix döngüleri sırasında daha uzun süre kalmak mümkün beyinlerdir. Bu nedenle, larva beyin diseksiyon bu tahlil ayarlamak başlamadan önce hakim. Bu tahlil kurma çözümlediğinizde genotip az sayıda bir zamanda beyin sayısını en aza indirmek için gerekli ve kuyu faydalanır. Bu gecikmeler anatomi ve tahlil ölçümler arasındaki engeller. Üçüncü olarak, istikrarlı bir sıcaklık sürdürmek fizyolojik ilgili koşullarda metabolik oranları analiz etmek için gereklidir. Yüksek tahlil sıcaklıklar düşük oksijen Tüketim oranları (Şekil 3 c) tarafından gözlenen doku ölüme neden olabilir. Sinekler farklı bir sıcaklıkta deneysel amaçlı yetiştirilen Eğer ölçümler bu sıcaklıkta da yapılmalıdır. Tahlil farklı bir sıcaklıkta yapılacaktır diseksiyonlarının büyük olasılıkla oda sıcaklığında gerçekleştirilir iken, kaplama ve ölçülü beyin tahlil çalıştırmadan önce 15dk için gerekli sıcaklığında inkübe. Son olarak, kuyu sonrası tahlil doku konumlandırma ölçümleri etkilenen belirlemek için kritik olduğunu gözlemleyerek. Bazen, bu plaka diseksiyon mikroskop altında gözlemleyerek sonra her iki doku kaybı veya mispositioning, nedeniyle veri analizi nerede beyin iyi Merkez dışında kaydı ve sıkışmış çıkarılabilir bir aykırı iyi olacak altında polimer yüzük gözü kör. Kısıtlama kuyuya düzgün sağlanmadığını ve karıştırma döngüsü sırasında rahatsız oldu Eğer doku kaybolabilir. Eğer onlar analizinden dışlanan değil de bu olayların sık sık, olur iken, onlar oranı değerleri önemli ölçüde düşürür.
Bütün doku metabolik akı izleme oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme tarafından ölçümü nasıl metabolizma genetik manzara veya diğer deneysel koşullar tarafından değiştirilmez anlamak için biyolojik olarak uygun bir yöntem sağlar. Bu yöntem tek bir metabolik değişiklikleri algılamak için hassas dur akış basınçlırespirometri veya dolaylı Kalorimetre kullanarak mümkün değildir D. melanogaster beyin. Bu da oksijen tüketimi ölçmek için Clark elektrot kullanarak daha az teknik olarak davet ediyor. Bu iletişim kuralı bir avantajı iyi başına bir bütün beyin analiz etmek için yeteneğidir. 96-şey biçimi daha duyarlı okumaları için izin verir ve böylece, birden fazla genotip tahlil gerekli örnekleri daha az sayıda nedeniyle bir anda denetlesinler. Doku metabolizmasında ölçme hala zorlu ve dikkatle gerektirir iken yetiştirilen ve senkronize hayvanlar, bu iletişim kuralı hızlı, nispeten basit bir yöntem açıklanır ve d içinde çok sayıda metabolik hassasiyetleri analiz potansiyeline sahiptir melanogaster larva ve yetişkin beyin.

Metabolik yeniden programlama Glioblastoma Multiforme (GBM), Huntington hastalığı ve büyük depresif bozukluğu (MDD)1,2,3de dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda tespit edilmiştir. Metabolizma tedavi stratejileri odak olduğunda, temel metabolik araştırma araçları Gelişmiş. Ancak, bu yöntemlerin çoğu hücre satırları ve primer hücre çalışmaya veya daha büyük doku sonrası fiksasyon veya - dondurucu analiz etmek için tasarlanmıştır. Bazı yaklaşımlar diğerleri kromatografi kütle spektrometresi4 aynı amaç için birlikte kullanan daha maliyetli ve karmaşık analiz kullanılan iken belirli metabolitleri, basitçe ölçmek için kiti yararlanmıştır. Büyük metabolik manzara anlamak için metabolik5,6 ve metabolik akı analiz profil oluşturma (MFA)7 büyük ölçekli proteomik ve genomik çalışmalar tamamlayacak şekilde ortaya çıktı. MFA bunun üzerine etiketli metabolitleri izleme zaman içinde izin vererek genişletir profil oluşturma metabolitleri bir hücre veya doku bir noktada bir nicel temsil zaman içinde sağlar. İkincisi nasıl enerji kaynakları farklı bir hücre veya bir hastalık durumu8ne zaman dokusunda kullanıldığında ortaya yararlı olmuştur. Ancak, bu yöntemleri genel olarak metabolizma hızı ölçümü dahil etmeyin.
Küçük model sistemleri genel olarak metabolik durumunu sorgulamak için Clark elektrot9 ve dolaylı Kalorimetre10, gibi geleneksel yöntemleri edilebilir oksijen tüketimi ölçmek için kullanılan veya stop akışı basınçlırespirometri için yapılandırılmış oksijen ve karbondioksit konsantrasyonu, sırasıyla ölçmek. Bu teknikler, doğru bir şekilde metabolik organizma düzeyinde yeniden programlama okuma içgörü sağlarken bazı kısıtlamalara sahiptir. Clark elektrot kullanımı teknik olarak zor olabilir ve yüksek üretilen iş çalışmaları için tasarlanmamıştır. Dur akışı respirometer hücre ve dokulara tahlil için gerekli hassasiyeti ile çalışamaz. Birkaç yıl önce özellikle bu küçük uygulamalar11için yeni bir teknoloji geliştirildi. Bu aletleri başlangıçta oksijen tüketimi ve hücre satırları ve primer hücre bir 24 - veya 96-iyi biçimde ekstraselüler asitleştirme ölçmek için tasarlanmıştır. Kurulum ve veri çıkış kolaylığı bu yöntemi alternatif geleneksel yaklaşımlar olarak kurulmuş. Bu metodoloji hücreler için güçlü bir araçtır ve son gelişmeler doku yumruklar12,13,14ölçüm için izin vermiş. Ancak, bu deneyleri içinde kullanılan yöntemleri tüm organ sistemleri küçük modellemek ölçümü için izin vermez.
Metabolik hastalık modelleri analizini sık sık özel işlev aynı doku içinde ikamet eden hücreler arasındaki etkileşimi içerir. Örneğin, Gliyal hücreler nöronlar tarafından kullanılan metabolitleri üretmek. Bu metabolik etkileşimler için nöronal hayatta kalma15gereklidir. Bu gibi sorular soruşturma için avantajlı küçük model sistemlerdir. Hücre tipleri, çeşitli içeren bütün bir organ metabolizma ölçmek için çalışmalar enerji kullanımı içinde vivoanlamak için ekleyecektir. Son zamanlarda, Becker ve ark. oksijen tüketimi bütün sinek kafa16ölçme yöntemi bildirdi. Kafasına bir şey 24-şey hücre plaka birlikte bir dizi havuzu tarafından oksijen tüketimi okuma metabolik bir Çözümleyicisi'ni kullanarak elde edilmiştir. Bu kolayca bedenden ayrılmış, iyi başlar için çalışırken büyük bir miktar için bu yöntemi disseke gerektiğinden, larva beyin gibi organlarda için kullanmak çok daha zor. Bu nedenle, oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme okuma hassasiyeti artar, bir 96-şey hücre plaka kullanan bir yöntem tek bir bütün larva beyin tahlil için geliştirilmiştir.
Bu çalışmada kullanılan metabolik analyzer bir 96-şey hücre tabak kuyu dibinde kalmasını ölçülen örnek gerektirir. Hücreleri ve görece düz dokular için bu bir sorun değildir; Ancak, D. melanogaster larva ve yetişkin beyin geleneksel levha kaplama protokolleri kullanarak mümkün değildir. Beyin küresel üç boyutlu şeklini güvenilir bir şekilde plaka yüzeyine uygun olmaz ve yapmak bu kez onları düzgün kuyuda yere çalışılırken bozulmuş. Bir kritik protokolünün bir parçası olarak bu yeni tasarım ve geliştirme beyin metabolizma ölçümleri ile engel olmadan bulunması için küçük bir oda sağlayan mikro-doku bağlar17 var. Oluşturulan odası yaklaşık de içinde 0.016 yüksekliği ve kolayca birçok D. melanogaster beyin tutmak için yeterli alan sağlar. Bağlar için bir inert polimer yüzüğü ekli naylon mesh oluşur ve daha fazla ele alınacak Temsilcisi sonuçları. Bu bağlar kullanarak disseke beyin metabolik ölçüm için hazırlamak için gereken süreyi en aza indirir. Ölçüm işlemi en iyi duruma getirme sabit, tekrarlanabilir oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları altı ölçüm döngüleri (25 dk) sonra oluşturur. Beyni 2 h, metabolik analyzer kartuş ilaç teslim bağlantı noktaları enjeksiyonları therapeutics, inhibitörleri veya diğer tedaviler ile sağlayan en az bu koşullar altında metabolik olarak aktif kalır. Bu iletişim kuralı da diğer doku ve küçük model sistemleri18için kolayca adapte edilebilir.
Aşağıda ayrıntılı protokolü ile mitokondrial stres istediğinde bir bütün Drosophila larva beyin oksijen tüketiminde tahlil açıklar. Beyin stres, oligomycin ATP sentaz19etkisizleştirmek için eklenir. Bazal okuma dan oksijen tüketiminde azalma, beyinde ATP bağlı olarak solunum miktarı ölçümü gösterir. Daha fazla oksijen tüketimi tedaviler Rotenon20 ve antimycin bir21sonra düşüşler, elektron taşıma zinciri kompleksleri inhibitörleri ı ve III, sırasıyla, belirtmek mitokondrial Sigara oksijen tüketim miktarı beyin. Bu tahlil bir örnek bir sinek beyinde nasıl mitokondrial solunum karşılaştırıldığında ve nasıl bu protokolü değişen genotip metabolizmasında karşılaştırmak için kullanılabilir olduğunu. Ancak, bu iletişim kuralı sadece bazal oksijen tüketimi ve daha ayrıntılı çalışmalar belirli enerji kullanımı veya substrat kullanımı hipotezler soruşturma tasarım olarak ekstrasellüler asitleştirme fiyatlar, de ölçmek için adapte edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Assay medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102365-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DLW354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delrin</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2XMK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Schneider Media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont High Precision Tweezers (style 5)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 409</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitostress kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>oligomycin, rotenone, and antimycin A included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell inserts (6-well)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave v2.4 XFe96 analyzer software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop</td>
			<td>free download to mac or windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 catridge and cell plates</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic analysis of drosophila melanogaster larval and adult brains

Bu iletişim kuralı Drosophila melanogaster larva ve yetişkin beyin metabolizmasında ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bütün organları metabolizmasında miktarının primer hücre ve hücre hatları analiz ederken yakalanamayan enerji kullanımı bir doku düzeyinde anlayış sağlar. Bu analiz ex vivoolmakla birlikte, ölçüm bir dokuda bir fonksiyonu gerçekleştirmek için birlikte çalışan özel hücreler bir dizi için izin verir ve daha yakından vivo içinde organ modelleri. Metabolik yeniden programlama neoplazi ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda gözlenmiştir. Bu iletişim kuralı bir ticari olarak mevcut metabolik Çözümleyicisi'ni kullanarak nörolojik hastalık modelleri metabolizmasında D. melanogaster toplumun Soruşturmama yardım etmek için geliştirilmiştir. Metabolik Çözümleyicisi'ndeki tüm beyin metabolizma ölçme beyin geometri nedeniyle zordur. Bu analiz örnekleri bir 96-şey tabak dibinde kalmasını gerektirir. Hücre örnekleri ve doku yumruklar hücre plaka yüzeyine bağlı veya küresel kaplamalar, sırasıyla kullanmak. Ancak, küresel, üç boyutlu şekle D. melanogaster beyin doku plakasına kalarak engeller. Bu iletişim kuralı Çözümleyicisi'nin iki katı hal sensör sonda gelen metabolik ölçümleri hala izin verirken beynin herhangi bir hareket engelleyerek bu sorunu kaçınmanızı sağlar özel olarak tasarlanmış ve imal edilmiş bir mikro-doku kısıtlama gerektirir. Oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları tekrarlanabilir ve metabolik inhibitörleri ile tedavi için hassas. Örnek boyutu kısıtlama tarafından oluşturulan odası aşmaması koşuluyla küçük bir optimizasyon ile bu iletişim kuralı tüm doku ve/veya modeli sistem, ile kullanmak için adapte edilebilir. Bazal metabolik ölçüm ve analiz mitokondrial inhibitörleri ile tedavi sonrası bu protokolde açıklanan iken, enerji kaynağı tercih ve yetiştirme ortamı gibi sayısız deneysel koşullar sorguya.

Burada sunulan Protokolü aşağıda açıklanan özellikleri karşılamak mikro-doku bağlar kullanımını gerektirir. 96-şey hücre kalenin dibinde yer beyinlerinde başarısız tutmak için diğer yöntemleri kullanarak (Şekil 2A ve 2B). İlk olarak, plaka doku uyumu artırmak için çeşitli ajanlar test edildi. Piyasada bulunan doku yapıştırıcı (Tablo reçetesi) hücreleri ve hücre plakaları ve küresel kaplamalar, organoids kullanımı için sırasıyla önerilir. Başlangıçta, beyin iyi yüzeye bağlı kalmak için ortaya çıktı; Ancak, oksijen tüketimi (OCR) okuma düşüktü ve sonra tahlil kuyuları gözlemleyerek beyin artık iyi yüzey (Şekil 2A) bağlı olduğunu ortaya koydu. Ayni-den sonuçlanmak süper yapıştırıcı (Şekil 2A) ile oluştu. İleri, kuyunun dibinde küçük bir oda içinde beyin çalıştı tutmak için küçük ekranlar imalat (Şekil 2B).
Metal ekranlar yüksek OCR okuma ekranları ekran (2B rakam) yerinde tutan bir polimer halka ile metal gibi tek başına üretilen. Plastik hasır örgü aynı polimer yüzükle kullanıldı. Bu cihaz elde edilecek negatif bir OCR okuma neden oldu. Son olarak, mikro-doku bağlar 0.146 içinde 0.1335 içinde 0.0125 içinde kalınlığında bir iç çapı ve 0,016 inç (Tablo reçetesi) yüksekliği bir dış çap ölçüm ring için etkisiz bir polimer kullanarak tasarlanmıştır. Süper yapıştırıcı (Tablo reçetesi) içinde 0.0039 çapı (Tablo reçetesi) belirli gözenek büyüklüğü ile naylon mesh yüzüğü takmak için kullanıldı. Hava kabarcıklarının oluşumunu olmadan medya ve metaboliti geçişine izin verir, ama hala beyin için bir engel olarak davranır gibi gözenek boyutu önemlidir. Bu kısıtlama yok tek başına hiçbir OCR için biraz okuma neden ve beyin ile kullanıldığında (Şekil 2A ve 2B) reproducible okumaları için izin. Doğrulama tahlil beyin hala doğru wells konumlandırılmış olduğunu gösterdikten sonra. Bu doku bağlar Şu anda ticari olarak mevcut değildir ama yukarıdaki belirtimi takip ederek üretilebilmektedir. Bu hassas üretim gerekirken, çoğu makine dükkan yukarıda başvurulan malzemeler kullanılarak bu kısıtlama çoğaltmak mümkün olacaktır.
Protokol daha fazla için tahlil medya, tahlil çalıştırmadan önce geçmesi gereken süreyi ve sıcaklık (Şekil 3) için optimize edildi. Başlangıçta, deneyleri Schneider ortamda larva in vivo ortamda modellemek için kurulmuştur. Ancak, pH D.H.T. ölçmek için kullanılan bu yana kullanılan ortamı arabelleğe alma aracıları içeremez. Bu medya, böylece, özel yapılmış, hangi maliyetlidir olmalı. Bu en iyi duruma getirmek için metabolik analiz (Tablo reçetesi) için tasarlanmış bir piyasada bulunan tahlil medya Schneider medya yerine kullanılmıştır. OCR düzeyleri bile modeli tahlil ortam koşulları (Şekil 3A) için biraz glikoz düzeyleri artan değişmeden, idi. Şu andan itibaren bütün deneyleri tahlil ortamda yapılmıştır. Olup olmadığını oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları bilinen mitokondrial inhibitörleri ile tedavi ederken bir tepki gösterdi medyaya takviyeleri gözlemleyerek optimize. Daha sonra gruptakiler ve tahlil ishal arasında bekleme süresi analiz edildi. 3 h bir kuluçka OCR seviyeleri (Şekil 3B) önemli ölçüde düştü. Şekil 3D fark, ne zaman OCR ve D.H.T. düzeyleri için her iki yetişkin ve larva beyin stabilize olan altıncı saat noktasına gösterir. Böylece, protokol deneme durumda bir kuluçka az 30 dk için önerilen bir sıcaklık denge gerektiren sürece hemen ardından gruptakiler, tahlil başlamak için gösterir. Metabolik analyzer 11 ° C ile 25 ° C sıcaklık boyunca tahlil için izin verecek biçimde ayarlayabilirsiniz bir kuluçka depolanır. Sıcaklıklar yüksek ortam sıcaklığı ve enstrüman işlemi nedeniyle, azaltılmış OCR düzeyleri (Şekil 3 c) gözlenir. Bu doku ölümü nedeniyle olacak olan.
En iyi duruma getirilmiş koşulları izlendiğinde, larva ve yetişkin deneyleri beyin okuma biraz 150 pmol/dak, stabilize aşan OCR sonucu altıncı kez bağlantısı, ~ 25 dk tahlil (Şekil 4B) içine. Bu oran en az 30 dk (Şekil 4A) için ve en çok 2 s (veri gösterilmez) korunur. D.H.T. (Şekil 4 d) altıncı zamanda noktada larva beynindeki yetişkin beynindeki biraz aşağıda olan ve en az 30 dk (Şekil 4 c) korunur. Bu bulgu glikoliz bir artış büyümeyi desteklemek üzere larva aşamalarında karşılık gelir. İğne oligomycin gibi bir mitokondri inhibitörü ile ATP bağlı solunum açığa vurmak ve mitokondrial Sigara oksijen tüketimi (Şekil 5A ortaya çıkarmak için OCR Rotenon ve antimycin A düşürür tedaviyle daha için OCR okuma düşürür ). Bu veri bu inhibitörleri ve beyin dokusuna nüfuz edebiliyoruz değişik genotip mitokondrial solunum beynindeki karşılaştırmak için kullanılan gösterir. Bu tahlil, mix, bekleyin ve ölçü kez oksijen düzeyleri, tüketim oranını değil, gözlem ve karıştırma sonra sağlamak tarafından optimize için oksijen seviyesi ölçüm öncesi seviyesine döndü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig1.jpg"> Şekil 1: metabolik Çözümleyicisindeki larva beyin OCR ve D.H.T. ölçümlerin bir şematik. Kartuş tahlil çalıştırmadan önce bir gün hazırlanır. Ertesi gün, uyuşturucu kartuş enjeksiyon bağlantı noktalarına eklenir. D. melanogaster larva beyin disseke ve mikro-doku bağlı beyin kuyunun dibine güvenliğini sağlamak için eklenir. Beyin hücre plakalı metabolik Çözümleyicisinde denetlesinler ve veri analiz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig2.jpg"> Şekil 2: mikro-doku kısıtlama yok metabolik olarak aktif değildir ve beyin de bir tabak dibinde bir odasında tutun. (A)OCR Oregon-R ö melanogaster larva beyin doku yapıştırıcı (Malzemeler tablo) ile veya beyin kuyunun için süper yapıştırıldığında kaplı Wells ölçülür. Sonuçları mikro-doku bağlar kullanarak kuyu alt kısmında konumlandırılmış beyin ile karşılaştırıldığında. (B) OCR tahlil medya ve metal, polimer yüzük, plastik kafes kafes bezi ve polimer yüzük veya mikro-doku bağlar ile metal içeren Wells ölçülür. p-değeri < 0,05, ** p-değeri < 0,01, *** p-değeri < 0,001, *** p-değeri < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig3.jpg"> Şekil 3: medya, kuluçka zaman ve sıcaklık duruma getirilmesi. (A) Oregon-R ö melanogaster içinde ölçülen larva beyin Schneider medya (S2) sodyum pyruvate ile kullanarak eklenir, S2 ile glikoz ve sodyum pyruvate eklendi ve medya glikoz ve sodyum pyruvate ekledi tahlil OCR. (B) OCR larva beyinlerinde, kuluçka tahlil önce 3 saat sonra veya, kuluçka tahlil önce 30 dk sonra ölçülür. (C) OCR 33 ° C ve 25 ° c sıcaklığa çalıştırmak tahlil, larva beynindeki ölçülür Altıncı süresi noktası Grafiği çizilecek. (D) OCR larva beyinlerinde, kuluçka tahlil önce 3 saat sonra veya, kuluçka tahlil önce 30 dk sonra ölçülür. Verileri için altıncı zaman noktası bildirilmektedir. p-değeri < 0,05, ** p-değeri < 0,01, *** p-değeri < 0,001, *** p-değeri < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig4.jpg"> Şekil 4: OCR ve D.H.T. tekrarlanarak yetişkin ölçülür ve larva D. melanogaster beyin. (A)OCR 30 dk. (B) OCR veri paneli A altıncı zaman noktasından Grafiği çizilecek için Oregon-R ö melanogaster yetişkin ve larva beyinlerinde ölçülür. Bu hangi OCR okuma stabilize zaman noktadır. 30 dk. (D) D.H.T. Veri paneli bir altıncı zaman noktasından Grafiği çizilecek için (C) D.H.T. D. melanogaster yetişkin ve larva beyinlerinde ölçülür. Bu hangi D.H.T. okumalar stabilize zaman noktadır. p-değeri < 0,05, ** p-değeri < 0,01, *** p-değeri < 0,001, *** p-değeri < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig5.jpg"> Şekil 5: Oligomycin ATP bağlı solunum ortaya çıkarmak için D. melanogaster larva beyin OCR düzeyleri düşürür ve Rotenon/antimycin bir daha da düşürür mitokondrial Sigara oksijen tüketimi ortaya çıkarmak için OCR. (A)OCR Oregon-RD. melanogaster larva beyinlerinde bir 20 µM oligomycin ve 5 mikron Rotenon/antimycin A karışımı bir tedaviden sonra ölçülür. Denetim ve salt kısıtlama wells tahlil medya ile enjekte edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains at JoVE.com

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

metabolic-analysis-of-drosophila-melanogaster-larval-and-adult-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

9.2K Görüntüleme.  Providence College. Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Video: Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Nörobilim

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Yüksek-Kalite Dijital Video Edinme<em&gt; Drosophila</em&gt; Bir Yanal Perspektifinden Larva ve Yetişkin Davranışları

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Kaldırılması<em&gt; Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan&gt; Kas Dokusu

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...