Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (OJTM için KGP, OJTM ve R01HL101972 için U54CA143906) ve Oregon Tıbbi Araştırma Vakfı Erken Klinik Araştırmacı Ödülü (KGP) hibe tarafından desteklenmiştir. OJTM bir Amerikan Kalp Derneği Kuruldu Araştırmacı (13EIA12630000) &#39;dir. Biz bu çalışmada kullanılan hücre örnekleri hazırlamak için Şövalye Kanser Enstitüsü&#39;nden Dr Eric Anderson teşekkür ederim.

1.. Mikroskop Özellikleri Doğru şekilde görüntüleme yürütmek için mikroskop aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır: <ol><li> Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve aydınlık (BF) kontrast hem de sahip. </li><li> Bilgisayar kontrollü z-eksen hareketi var. </li><li> Yoğunlaştırıcı mercek sayısal açıklık değişeceği için ayarlanabilir diyafram durak var. Derecelendirilmiş bir kural veya elektronik okuma bir diyafram sayısal diyafram değerini bilmek gereklidir. Sayısal açıklık NIQPM için 0.1 HTDIC için 0.9 (veya daha yüksek) kadar aralık olmalıdır. </li><li> Mikroskop parlak bir alan görüntüleme için kullanılmak üzere bir dar bant renk filtresi olmalıdır. Bu filtre, kırılma artış, NIQP kütle yoğunluğuna faz dönüştürmek için kullanılan bir dalga boyuna bağımlı facture gidermek için gereklidir. </li></ol> 2. Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Z-yığın Edinme <ol><li> Slidebook yazılım a açınnd resim koleksiyonu için yeni bir slayt oluşturmak. </li><li> Sonra, Odak penceresi açmak. Filtre Seti bölümünde, DIC seçin. Kapsam sekmesinde, Kondenser bölümünde, uzak doğru pozisyonda (tüm yol açmak) için Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın. Bu yüksek sayısal açıklık aydınlatma sağlar ve numunenin optik bölümlendirilmeleri artırır. </li><li> Bir DIC objektif kullanılarak numune odaklanın. Örnek kolayca görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Kamera doymuş varlık değildir sağlamak için, Odak Penceresinde Kamera sekmesini seçin ve piksel yoğunluğunun histogram kameranın dinamik aralığında olduğunu kontrol edin. </li><li> Görüntü Yakalama penceresini açın. Yakalama Türü bölümünde, 3D kutusunu işaretleyin. 3D Capture bölümünde, merkez etrafında Aralığı seçmek ve mevcut yere geri dönün </strong&gt; kutuları ve Z-yönü aralığı, uçak sayısını ve adım boyutunu belirtin. Z-doğrultusu aralığı, tüm numune içermelidir. </li><li> Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, DIC kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı ve görüntüleme başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin. </li></ol> 3. Parlak Field (BF) Z-yığın Edinme <ol><li> Mikroskop numunenin DIC Z-yığını toplama bittikten sonra, Odak penceresi açmak ve Filtre Seti bölümünde Aç seçeneğini seçin. Düşük NA aydınlatma sağlamak için (tüm yol kapalı) uzak sol konumuna Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın. </li><li> Yeşil mikroskop ışık yolu filtresini değiştirin. Örnek görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Seçerek kamera doygunluk var olun <stRong&gt; Kamera Odak Penceresinde sekmesini ve piksel yoğunluğunun histogram belirtilen aralıkta olduğunu kontrol. </li><li> Görüntü Yakalama penceresini açın. DIC Z-yığın iktisabından 3D Çekim ayarları görüntülenir. </li><li> Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, AÇIK kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı, ve Z-yığın görüntü toplama başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin. </li></ol> 4. Z-yığın Görüntüler İhracat <ol><li> Z-yığın yakalama açın. % 100 görünümünü değiştirin. 0 arasında görüntülenecek piksel değerlerinin histogram ve kameranın maksimum piksel değeri (4.095 12 bit kameralar, 16 bit için 65.535.) Ayarlayın. </li><li> Görünüm&gt; Dışa Aktar&gt; TIFF Seri seçin. Bu TIFF görüntüleri bir dizi olarak Z-yığını ihraç edecek(Her Z düzlemi için bir tane). Sonunda (yani &quot;DIC Stack 1_&quot;) da bir çizgi bir adla ayrı bir klasörde TIFF dizi kaydedebilirsiniz. Her DIC veya BF Z-yığını ile bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5. Hacim Ölçümleri <ol><li> &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot; başlıklı HTDIC MATLAB programını açın. </li><li> HTDIC programın Bölüm 0 altında, bağımlılıkları dizin değişkeni güncelleştirmek. Kopyala ve &quot;dependencies_directory =&quot; Aşağıdaki tek tırnak arasındaki explorer hilbert_transform_dic.m ve sobel_edge_detect.m dosyaları (PC) içeren dizini yapıştırın. JoVE_HTDIC_v1.m program ExecuteSection 0. </li><li> Bölüm 1, &quot;images_directory&quot; güncelleyin. Yine, kopyalama ve tek tırnak arasında. Tif biçiminde yoluyla odak görüntüleri içeren dizini yapıştırın. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN. </li><li> Hizalama ve Hilbert için görüntülerin dönme çalıştırın kod Bölüm 2. dönüşümü. &quot;HTDIC parametreleri tanımlayın&quot; başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Beş numbers kullanıcı gereklidir: numune DIC görüntü odakta odak düzlemi sayısı, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), DIC görüntünün dönüş açısı Hilbert dönüşümü gerçekleştirmek için gerekli tipik değerler 45 ve -135 bulunmaktadır. Son olarak, ilgi boyutta bölge girmek, bu parametre, daha sonra görünür bir kutunun bir yan uzunluğunu tanımlayan - tipik değer 400&#39;dür. Ok tıklayın. </li><li> Odak düzlemi sayısına göre belirlenen DIC odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği üzerinde kutusunu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Kutu arzu edilen bölgeye, kutunun içinde çift tıklayarak üzerinde konumlandırılmış edildikten sonra. </li><li> Başka bir rakam şimdi görünecektir: Bu rakam bir önceki adımda seçilen ilgi bölgenin bir kırpılmış ve döndürülmüş görüntüsünü içerir. Görüntünün kontrast şekilde olmalıdırparlak özellikleri sağ tarafta görünür iken o karanlık özellikleri solda görünür. Ilgi bölgesi üzerinde mavi kutuyu sürükleyin, gerektiğinde yeniden şekillendirmek. </li><li> Bölüm 3 z-yığın küp için bir maske oluşturur. Dikdörtgen bir maske hücrenin etrafına bir dikdörtgen ve elle ilgi hücre anahat ücretsiz bir el aracı oluşturmak için: Mevcut İki maske türü vardır. </li><li> Dikdörtgen bir maske, dosyamıza hattı 167 ve açıklama satırı 170 (bu çizginin başında bir &quot;%&quot; koyarak bir satırı yorum) oluşturmak için. Programın Bölüm 3. yürütün. Görüntüdeki tıklayın ve dikdörtgen maske tanımlayarak başlamak için fareyi sürükleyin. Bunu kabul etmek kutuya çift tıklayın. </li><li> Elle çizilmiş bir maske, Yorum satırı 167 ve yorumsuz hattı 170 oluşturmak ve Bölüm 3. yürütün. Tıklayın ve fare ile istenen maske çizin. Bunu kabul etmek maskesi üzerine çift tıklayın. </li><li> Hilbert inşa 4to çalıştırın Bölüm DIC Görüntü yığını ve ilgi alanının tekabül DIC görüntü yığınını dönüştürdü.Bölüm 3 inşa maske DIC yığını ve &quot;Maskon&quot; satırında 179 1&#39;e set edilir düzenli DIC yığını dönüştürmek Hilbert uygulanacaktır. 0 &quot;Maskon&quot; ayarı maske uygulamadan görüntü yığınlarının inşa edecek. </li><li> Ilgi bölgenin xz kesit görüntülerin görüntü segmentasyon optimize Bölüm 5 çalıştırın. Program tarafından üretilen rakam 500, kontrast, üç farklı görüntüleme görünür. Hücrenin sınırları bulmak için algoritmanın başarısı, kullanılan maske ve program doğrultusunda 229 at &quot;eşik&quot; değerinin bir kombinasyonu ile bağımlıdır. 0.5 bir değerle başlar. Eşik değerini ayarlamak ve doğru özetleyen sütunlardan birinde elde edilinceye kadar programın bu bölümü yeniden çalıştırın. </li><li> Anahat 1. sütunda iyi olsaydı, DIC görüntü segmentasyon kullanarak ses seviyesini belirlemek için Bölüm 6 kullanın. Sütun 2 optimum sonuçlar verdiyse, Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri hücre hacmini belirlemek için Bölüm 7 çalıştırın. Eğer sütun 3 gave optimal sonuçları, koşmak Bölüm 8 Fourier-filtreden Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri kullanarak hacmini belirlemek. </li><li> Küp mikron (fl) rapor numunenin ölçülen hacim, hacim ölçümü seçildiği bağlı olarak program tarafından üretilen Şekil 600, 700, veya 800 başlığında sunulmuştur. </li></ol> 6. Kütle Ölçümleri <ol><li> &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot; başlıklı NIQPM MATLAB programını açın. </li><li> NIQPM programın Bölüm 0 altında, programı çalıştırmak için gerekli üç dizin konumunu güncelleştirmek. Bunlar &quot;dependencies_directory,&quot; &quot;brightfield_directory,&quot; ve vardır &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Sonraki Bölüm 1. çalıştırın. Bu kod bölüm görüntüler tüm setinin tam alanında parlak bir alan görüntü küp oluşturur. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN. </li><li> Sonraki Bölüm 2. çalıştırın. &quot;NIQPM parametreleri tanımlayın&quot; başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Dört numaraları kullanıcı gereklidir: odak düzlemi numarası nerede ve parlak alan görüntüörnek odakta olduğu, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), ve faiz boyutu bölgesi, bu parametre bir tarafı uzunluğunu belirler sonradan görünecektir kutusu - tipik bir değer 200&#39;dür. Ok tıklayın. </li><li> Odak düzlemi sayısına göre belirlenen aydınlık alan odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir. <ol><li> Görüntü odakta değilse, mavi kutu ve tekrar çalıştırın Bölüm 2 çift tıklayın, iletişim kutusunda odak düzlemi sayısını ayarlamak için emin olun. </li><li> Görüntü odakta ise, resmin etrafında mavi kutuyu sürükleyin ve kutunun düğümlerin seçimi ve gerektiğinde bunları sürükleyerek yeniden boyutlandırmak. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği etrafında kutu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Bunu kabul etmek kutunun içini çift tıklatın. </li></ol></li><li> Sonraki çalıştırmak parlak alan görüntülerin bir yığın oluşturmak için Bölüm 3 içinde bölgeye kırpılmışterest. </li><li> Faz haritası, sözde DIC görüntü ve parlak bir alan görüntüler ve gerçek DIC görüntüye karşılaştırmalar oluşturmak için, Bölüm 4 çalıştırın. </li><li> Sözde ile DIC ve kütle yoğunluğu haritası, toplam kütle ve hücre yoğunluğu histogram mümkün olduğunca benzer doğru DIC görsel bölüm 5a veya 5b çalıştırarak belirlenebilir. Hattında 300 at optimize &quot;eşik&quot; - - Bölüm 5a alanının otomatik yatılı tespitini gerçekleştiren tipik değerleri 0,1-1 arasında değişmektedir. Eşik değerini optimize etmek gerektiği gibi, bu bölümü yeniden çalıştırın. Kullanıcı ilgi hücresini özetliyor sonra bölüm 5b vb kitle belirlenmesi, yürütmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung.">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+contrast,+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects.">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Phase.">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li><li>Smith, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li><li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinterf&#233;rom&#232;tre+diff&#233;rentiel+&#224;+ondes+polaris&#233;es.">Microinterf&#233;rom&#232;tre diff&#233;rentiel &#224; ondes polaris&#233;es.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li><li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy.">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li><li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-enhanced+contrast,+differential+interference+contrast+(VEC-DIC)+microscopy:+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris.">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image+processing+greatly+enhances+contrast,+quality,+and+speed+in+polarization-based+microscopy.">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li><li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+shape+change+and+spreading.">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li><li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+microscopy+and+mass+determination.">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li><li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractometry+of+living+cells.">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li><li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy.">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li><li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy.">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li><li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide&#8208;field+differential+interference+contrast+microscope.">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide&#8208;field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li><li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+(TI-DIC)+microscopy+for+quantitative+phase+imaging.">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering-phase+theorem:+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media.">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li><li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Carr&#233;+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude.">Quantitative Carr&#233; differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li><li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+phase+microscopy.">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li><li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light.">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li><li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=non-iterative+phase+retrieval+by+Green&#8217;s+functions.">non-iterative phase retrieval by Green&#8217;s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li><li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+quantification+of+cellular+mass,+volume,+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient.">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li><li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+single+cell+refractive+index,+dry+mass,+volume,+and+density+using+a+transillumination+microscope.">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li><li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum.">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li><li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cell+membrane+tension.">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics.">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li><li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+phase+microscopy.">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li><li>Charri&#232;re, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy.">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li><li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging.">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li><li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+interference+microscopy.">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li><li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems.">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li><li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics.">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li><li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li><li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images.">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li><li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation.">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li></ol>

Yazarlar sunulan çalışmalarında hiçbir maddi çıkarları var.

Genel olarak, NIQPM ,25-44,7 değişen optik yol uzunlukları üzerinde doğrulanmış bir kırınım-sınırlı bir tekniktir. Doğrulama n gerçekleştirilmiştir = Fluoromount G içinde süspansiyon haline 0.11-9.8 um çap arasında değişen 1,596 polistiren küreler (veriler gösterilmemiştir). Hücreler yaklaşık 0-7 aralığında optik yol uzunluklarına sahip. Bir numunenin yoğunluk dağılımını ölçerken bir yoğunluk haritası, arka plandaki istenmeyen katkıları sahip iken...

Optik mikroskop kullanımı artık hücresel organizmaların araştırılmasında her yerde. Nedeniyle görünür optik spektrum üzerinde düşük endojen absorbans ve zayıf saçılma özellikleri, hücreler güçlü onları geçme optik dalgaların genlik etkileyebilir ve böylece standart parlak alan mikroskopları ile görüntülenmiş zaman yarı saydam görünmüyor. Hücresel örnekleri, bununla birlikte, doğrusal ışık hareket ettiği alanı belirli bir bölgede yerel bir kütle yoğunluğunun miktarı ile ilgili bir şekilde, kendi içinde seyahat eden optik dalgalar aşağı yavaş yok. Bu heterojen gecikmeyle veya mikroskobik yoluyla bulaşan optik dalgaların &quot;faz&quot; profilinin yararlanması ilk Fritleri Zernike 1 tarafından 1935 yılında tarif edilen ve deneysel Zernikein 1942 2 tarafından gerçekleştirilmiştir. Zernike bu başarı için 1953 yılında Nobel ödülü aldı. Zeiss 1945 3 bu yöntemi ticari. 1955 yılında Smith ve Nomarski diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, bir kontrast mekanizması olarak faz uzaysal gradyanı kullanan bir yöntem kullanımıyla 4 ve 5 teorisi üzerindeki ilk çalışma mevcut olacaktır. DIC Nomarski 6 ile 1965in yakın işbirliği içinde Zeiss tarafından ticari oldu. 1981 yılında, iki laboratuvar DIC mikroskop 7, 8 optik trenin içine video kameralar eklenmesi ile kaydedilmiş ilk canlı hücre DIC görüntüleri gösterdi. Canlı hücre görüntüleme çağı doğdu. O tarihten bu yana, ticari mikroskoplar üzerinde faz kontrast ve DIC hem yürütme büyük ölçüde değişmeden olmuştur. Morfolojisi, hücre altı yapıların takibi, ve membran dinamikleri 9 soruşturmalarının izlenmesi: Bu yöntemler esas nitel amaçlar için hücrelerin görüntülerini üretmek için biyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu teknikler faz ve dı olarak &quot;off-the-raf&quot; konfigürasyonunda nitelC görüntüleri keyfi ışık kaynağı yoğunluğu fonksiyonları, aydınlatma optik ayarları ve CCD kamera kazanç, gama ve pozlama ayarları vardır. Fizikçiler ve optik mühendisleri küçük bir lejyon ticari görüntüleme yöntemleri nicel yapmak için çaba harcadı. İlk çabaları arasında hekim-açık-Biyofizikçi Robert Barer piyasada bulunan bir fazlı mikroskop kullanarak bu hücre türleri ile faz değişimleri tahmin ederek hücrelerin hücre kuru kütlesini belirlemek için faz mikroskobu kullanımı gösterilmiş olan 1952 ve 1953 yılında Nature iki mektup vardı 10, 11. Faz mikroskopi 10,11, DIC mikroskopi 12-17, ve optik yol uzunluğu, faz, kütlesini belirlemek için parlak bir alan 18-22: alan üç temel etiket ücretsiz kontrast mekanizmaları etrafında dayalı takip eden yılda teknikleri çok sayıda geliştirdi yoğunluk, kırılma indeksi ve hücre hacmi. Paragraftallel, özel optik araçlar geniş bir koleksiyon da 1950&#39;lerden beri geliştirilmiştir ve parazit büyüme 23 uygulamalar, kırmızı kan hücrelerinin 25 membran dinamikleri soruşturma hücre döngüsünü 24 belgeleyen değişen optik ölçümler geniş kapsamlı yaptık. Özellikle, son on yıl kırınım faz mikroskobu 26 şeklinde, tomografik faz mikroskopi 27, dijital holografik mikroskopi 28, faz duyarlı optik koherens mikroskopi 29, uzaysal ışık girişim mikroskopisi 30, Hilbert etiket içermeyen nicel mikroskopi bir zenginlik gördü faz mikroskopi 31, ve kantitatif faz mikroskopi 32. Toplu başarılara rağmen, bu araçlar onların karmaşık enstrümantasyon ve hesaplama gereksinimleri, çoğunlukla nedeniyle biyolojik araştırmacıların büyük alana saçılmış olmamıştır. Burada biz dAydınlık saha ve DIC görüntülerinin bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun niceliksel ölçümlerini gerçekleştirmek için bir optik mikroskop kullanımını escribe. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Başarılı yürütülmesi için gerekli olan görüntüleme koşulları en ticari olarak temin edilebilir mikroskoplar normal çalışma kapsamı içindedir. Ayrıca, post-işleme algoritmaları, istikrarlı, hızlı ve sağlam - mümkün hızlı Fourier (FFT) tabanlı algoritmaları dönüşümü kullanılarak MATLAB uygulanmakta olan. NIQPM faz ve cel, eksensel olarak entegre kütle yoğunluğu oluşturmak için bir yöntemdirparlak bir alan görüntülerinden lular örnekleri. Numunenin bu alan üzerinde eksensel olarak entegre kütle yoğunluğunun toplamı numunenin toplam kuru kütle içeriği verir. Bir hücrenin faz profili numunenin odak-boyunca parlak bir alan görüntülerinin yeniden inşa edilebileceği gösterilmiştir edildiği - - NIQPM protokol Paganin ve Nugent 18, 19 döşediği deneysel temellere dayanmakta ve Frank teorik çalışma , Altmeyer ve Wernicke 20 - verimli bir FFT-tabanlı şekilde paraksiyel dalga modellerini çözme. Kuru kütle yoğunluğuna fazın bağlantı Barer 10, 11 ve 33 ile Popescu çalışma üzerine dayanır. Hacimsel bilgiler optik eksen boyunca numunenin optik olarak kısımlara sağlayan yüksek NA aydınlatma koşulları altında odak-boyunca DIC görüntü elde edilebilir. Hilbert DIC görüntü yığınlarının üzerinde işlem dönüşümü büyük ölçüde artırırArka plan olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları. Bu kontrast ve numunenin otomatik analizi için bir hacimsel sobel dayalı kenar algılama yöntemi geliştirmek için her iki Fourier filtreleme sebep olacak, ancak bu çalışma Arinson et al. 34 ile kaynaklanmaktadır. Biz de kırınım sınırından yukarı çapı 36, 20 mikron boyutu arasında değişen polistiren küreler daha önce HTDIC geçerliliği var. NIQPM ve HTDIC hem ticari mikroskopları onların gelişimine nedeniyle teknolojik erişilebilir olmakla birlikte, yöntemler temelde mikroskopları kendilerini donanım konfigürasyonu ile sınırlıdır. Bu tekniklerin temel sınırlamalar iki kat vardır: aksine nedeniyle tüm numune aşamasında çeviri, ticari Kabinlerdekilerden yavaş z-yığını alma zamanı sadece objektif lens içinŞu anda hızlı kabaca 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma sınırlar, ve ikincisi, kırınım etkileri sırasıyla, çapı 10 ve 20 mikron kadar 0.2 arasında değişen büyüklüklerde nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri tipik &quot;off-the-raf&quot; enstrümanlar üzerinde bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, en sabit hücresel örnekleri kolayca bu yöntemler ile incelenmiştir. NIQPM ve HTDIC protokollerin bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de verilmiştir. Şekil 2 biz, parlak alan ve DIC görüntüleri hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma koşulları altında optimal ve optimal yoluyla odak görüntüleme göstermektedir. 3 ve 4 başarılı ve başarısız uygulamaları vurgulayarak NIQPM algoritmasının parametre bağımlılığını göstermektedir Rakamlar. <strong&gt; Şekil 5, HTDIC görüntü işleme algoritması dahil adımları göstermektedir ve hücre hacmini belirlemek için algoritmanın en uygun uygulama göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

Bu, parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun sayısal ölçümler için standart bir optik mikroskop kullanılmasını tarif eder. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. Düşük sayısal açıklık (NA) aydınlatma, zayıf saçılma ve numune tarafından ışığın zayıf emilimi: NIQPM dalga yayılımının basitleştirilmiş bir modeline dayanan, üç temel varsayımlar ile, paraksiyel yaklaşım olarak adlandırılır. Neyse ki, boyanmamış hücre örnekleri bu varsayımları karşılamak ve düşük NA aydınlatma kolayca ticari mikroskopları üzerinde elde edilir. HTDIC yüksek NA aydinlatma altında odak-boyunca DIC görüntüleri hacimsel bilgileri elde etmek için kullanılıration koşulları. Yüksek aydınlatma NA optik eksen boyunca numunenin geliştirilmiş bölümlendirilmeleri sağlar. Hilbert DIC görüntü işleme dönüşümü büyük ölçüde yığınlarının arka olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları artırır. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları &quot;off-the-raf&quot; mikroskop kullanarak teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Ticari kapsamları yavaş z-yığını alma zamanı henüz hızlı 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma lağvetti, ve ikincisi, kırınım etkileri 10&#39;a kadar 0.2 ila nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak: Bu yöntemlerin iki temel sınırlamaları vardır sırasıyla (NIQPM) ve çapı 20 (HTDIC) um. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, çoğu sabit cellular örnekler hali hazırda, bu yöntemler ile incelenmiştir.

Odak-boyunca görüntü alımı sırasında doğru örnek aydınlatma NIQPM nd HTDIC algoritmaları başarılı bir şekilde uygulanması için önemlidir. Şekil 2 biz DIC ve polistiren küre ve insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı SW620 için parlak bir alan kontrast altında hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma göstermektedir. 2A Şekiller, 2C, 2I, ve 2K NIQPM için optimal görüntüleme göstermektedir. 2F, 2H Rakamlar, 2N,</...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope at JoVE.com

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Görüntüleme.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Video: Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Biyomühendislik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

Yerli, Fibröz Uzun Aralığı ve Bölümlere Uzun Aralığı Kollajen in vitro sentezi olarak

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

İmalat ve Macrostructure içeren optik doku hayaletler karakterizasyonu

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...