Biz Imaris, Imaris XT ve Matlab kullanımı için Kaliforniya Biyolojik Görüntüleme Geliştirme Merkezi (BIDC) Üniversitesi, San Francisco ederim. Biz teknik yardım ve Henry, LK Floren, yazının düzenleme katkılarından dolayı L. Daitch AT V. Kharazia ederim. 1R21DA029966-01 ve Eczacılık SEB, UCSF Okulu MLSMR koleksiyonu ekrana NIH Fast Track ödülü (: Bu çalışma SEB, Ulusal Sağlık Enstitüleri UCSF aracılığıyla Alkol ve Madde Bağımlılığı ile ilgili Kaliforniya Tıbbi Araştırma Devlet fon tarafından desteklenmiştir Dekanlık ve Klinik Eczacılık) ve CLHK Tıp Fakültesi (Klinik Farmakoloji ve Deneysel Therapeutics).

1. Tek hücreli Fenotipik Değişim Üç boyutlu Morfometrik Analizi <ol><li> Insan embriyonik böbrek (HEK293) hücreleri ile transfekte edildi hemaglutinin (HA) kortikotropin olarak bir G-protein çiftli reseptör (GPCR), önceden 4 5 faktör reseptörü-2 (CRF-R2) &#39;da anlatılan serbest bırakılması-etiketlendi. </li><li> Hücreler, (AS CRF-R2 endojen ligand, kortikotropin salgılatıcı faktör, CRF (1 uM, 30 dakika), ya da bir seçici CRF-antagonist R2, anti-Sauvagine 30 ile işlemden geçirilmiş ile uyarılmış (tedavi edilmemiş, NT) tedavi bırakılmıştır -30, 1 uM, agonist tedavi öncesinde 30 dakika). </li><li> Hücreler daha sonra, sabit permeabilize ve anti-HA ile tedavi edildi. CRF-R2 Alexa 594 nm konjugatı anti-fare (IgG 1) antikoru kullanılarak görüntülendi. DAPI çekirdekler mitotik Sahneye görselleştirmek için kullanılmıştır. </li><li> Deneyci öznellik sınırlamak için, deneysel koşullar görüntüleri elde edildi ve analiz sonrasına kadar bilinen değildi. </li><li> Biz görüntü eldeBir Verdi-V5 lazer ve Mira 900-F lazer sisteminden oluşan bir Tutarlı entegre iki foton lazer sistemine bağlı bir Plan-apochromat 63x/1.4 petrol DIC objektif ve Zeiss LSM 510 Meta Konfokal mikroskop kullanılarak sabit HEK293 hücrelerinden s. </li><li> Veri toplama işlemi sırasında, hücreler her iki dış hücre dışı reseptör için nükleer membran gelen verileri dahil çok spektrumlu kesit, 488 nm ve 790 nm (~ 350 nm 2PH Ör.) Ve z-bölme (0.5 um lik artışlarla) ile bölümlere edildi ekstremiteler. </li><li> Floresans verileri ilk 3D mikroskopi dataset görselleştirme ve segmentasyon sağlar Imaris kullanılarak işlendi ve küp vokseller oluşan bir 3D modeli morfometrik analiz için oluşturuldu. Sonra, Imaris XT modülü GPCR uzantıları koordinatları nokta belirlemek için MATLAB Bilgisayar program dili ile arayüz Imaris için kullanılmıştır. Hesap hücresel değişkenliği içine almak için, floresans görüntüleri tak elde edilen ve analiz22 hücrelerinden tr: agonist tedavisi (n = 7) öncesinde hiçbir tedavi (NT) (n = 7), agonist (KBY) tedavisi (n = 8) ve antagonisti ile tedavi öncesi (AS-30) (Şekil 2) . <ol><li> İlgi bölgesi (ROI) aktif mitoz aşamasında değildir ve diğer hücrelere yakın değil bir hücre içermelidir. Bu şekilde, analiz, sadece tek bir çekirdek ve reseptör uzantıları ile hücrelerin diğer hücrelerin yakınlık ile altüst olmayan içerecektir. </li><li> Hücresel 3D yapısı ilk Imaris (v.7.1.1) kullanarak multispektral floresans verileri yeniden inşa edildi. </li><li> Imaris göre tasarlanmış algoritması ardından, birinci yüzey işleme nükleer membran göstermek için kullanılmıştır. ROI içinde birden fazla çekirdek olup olmadığını Imaris belirleyecektir. </li><li> Sonra noktalar oluşturma algoritması CRF-R2 uzantısını bulmak için kullanılmıştır. Bu arka plan gürültü ve düzensiz yoğunluğu dengeler nedeniyle Spots algılama yararlanılmıştıramorf şekilli hücrelerin karmaşık bir ağ. </li><li> CRF-R2 floresans saptama her birim dahil üst düzeye çıkarmak için, noktalar &#39;çapı bir Gauss filtre kullanarak ölçülen yoğunluk şeklinde farklı bilgiler hesaplamak için görüntünün içinde en küçük birim olan 0,2 mikron için kurulmuştur. Nokta filtreleme noktalar otomatik oluşturma sürecine dahil edildi. Yazılım, ancak, kullanıcı parametreleri tanımlamak için filtreler kullanmak için gereken esnekliği sağlar. </li><li> Veri kesilmesi önlemek için, veri kümesi 32-bit ondalık 8-bit (imzasız) sabit nokta, dönüştürülmüş. </li><li> Voksel yoğunlukları veri bir referans noktası (Şekil 3) gibi nükleer membran kullanılan bir mesafe dönüşüm yaparak belirlendi Imaris XT MATLAB ile arabirim modülü ve her bir nokta arasında tam uzaysal konum koordinatlarını kullanarak veri nokta ile yer değiştirmiştir. </li></ol></li><li> Çıkan veriler s için ölçülebilir ve grafik biçiminde sunulabilirtatistical analizi. Gruplar arasındaki karşılaştırmalar iki yönlü ANOVA ve Bonferroni sontest kullanılarak yapıldı. Veriler ortalama ± SD olarak verilmiştir. Farklılıklar * p &lt;0.05 anlamlı olarak kabul edilmiştir. Hesaplamalar GraphPad Prism 5.02 (Şekil 4) ile yapılmıştır. </li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar Bizim yaklaşımın gücünü göstermek için, hücresel değişiklikleri belirleyen, G proteinine bağlı reseptörler (GPCRs) ve kortikotropin salgılatıcı faktör transfekte HEK293 hücrelerde endojen ligand KBY&#39;li reseptör-2 (CRF-R2) etkileşimi sonucu. Biz, CRF reseptörlerine R2 hücreleri (Şekil 2A ve Film 1) zar sonlu bölgelerinden plazma membranı ve proje içinde yer aldığını göstermektedir. Konvansiyonel 2D analiz kullanılarak, bu reseptör yapışma po analiz sadece hücre dışı CRF reseptör-R2 bu alt tespit etmek mümkündürcamına ints kapsar. Dolayısıyla biz z-yığılmış multispektral verileri (Şekil 5) elde edilen herhangi bir diğer bilgileri kaybedersiniz. Plazma zarından noktalar uzaklık azalması ile gösterildiği gibi hücrelerin CRF ile muamele edildiği zaman, hücre dışı reseptörler, büyük ölçüde azalır. Onlar da ayrık noktalarda bir dizi (Şekil 2B ve Movie 2) içine öncelikle sonlu yerden yeniden dağıtılır. Reseptör zar dağıtım CRF etkisi CRF-R2 spesifik antagonist, antisavagine 30 (AS-30) ile ön tedavi ile önlenebilir ve biz CRF-R2 uzantıları (Şekil 2C ve Film 3) değişmez olduğunu bulmak. Lekelerin distal dağılımı, 5 um spektrum renkli kodlanmış aralıklarla çizilen nükleer membran dan voksel mesafe görselleştirmek için kullanılmaktadır. Hiçbir tedavi ve antagonist pretreatment (AS-30, 1 uM, 30 dk) agonist tedavisi (CRF, 1 uM, 30 dk) önce GPCR daralma anlamlı (ns) farklılık göstermektedir. Tedavi yok, 0-5 mikron (NS), 6-15 mikron (göre agonist (CRF, 1 uM, 30 dk) ile hücrelerin tedavisi tedricen CRF-R2-içeren voksel sayısını azaltır, ** p &lt; 0.01) ve&gt; 15 mikron (*** p &lt;0.005), veya AS-30 tedavisi, 0-10 mikron (ns), 11-15 mikron (karşılaştırıldığında ** p &lt;0.01) ve&gt; 15 mikron (*** p &lt;0.005) (Şekil 4). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> Şekil 1. Mevcut geçerli teknikleri ve floresans görüntüleri analiz etme sınırlaması Diyagramı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt; Şekil 2. Agonist ve antagonist tedavi öncesi ve sonrası HA-KBY-R2 ile HEK293 transfekte hücre 3D multispektral floresan görüntüler. Birleştirilen görüntüleri gösteren anti-HA kullanılarak HA-CRF-R2-taranan ve Alexa 488 bağlı anti-fare (IgG 1) sekonder antikoru ile görselleştirilebilir; DAPI çekirdekler görselleştirmek için kullanılmıştır. Görüntüleri konfokal lazer tarama (CLS) mikroskop ile elde edildi. Ölçek çubuğu 5 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> Şekil 3. HA-KBY-R2 ile HEK293 transfekte hücreler 3 boyutlu model Imaris yazılımı kullanarak CLS görüntüleri yeniden. Küçük veziküller dönüştürülür GPCR uzantıları açıklayan nukleus ve noktalar oluşturma Yüzey işleme. Floresans verileri ilk 3D mikroskopi veri setinin görselleştirme ve segmentasyon sağlar Imaris kullanılarak işlendi. Daha sonra, Imaris XT MATLAB ile arayüz Imaris için kullanılmıştır. Voksel şiddetleri teati edildinokta koordinatları. Noktalar spektrum renk kodlu (mavi 0-5 mikron, yeşil, 6-10 mikron, sarı 11-15 mikron ve kırmızı&gt; 15 mikron) mesafe formu nükleer membran temsil eder. 5 mikron Scale. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> Şekil 4,. Lekelerin distal dağıtım grafik gösterimi, 5 um aralığı içinde kodlanmış spektrum renkli çizilen nükleer membran dan voksel mesafe görselleştirmek için kullanılmaktadır. Agonist tedavi öncesi bir antagonist (AS-30, 1 uM, 30 dk) (CRF, 1 uM, 30 dk) ile hiçbir tedavi ve tedavi öncesi GPCR daralma anlamlı (ns) farklılık göstermektedir. Hiçbir tedavi için 0-5 mikron (NS), 6-15 mikron (** p göre agonist (CRF, 1 uM, 30 dk) ile hücrelerin tedavisi tedricen CRF-R2-içeren voksel sayısı mesafesini azaltır &lt;0.01) ve&gt; 15 mikron (*** p &lt;0.005); veya AS-30 tedavi 0-10 mikron (ns), 11-15<html> mikron (** p &lt;0.01) ve&gt; 15 mikron (*** p &lt;0.005). <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> Şekil 5,. HA-CRF-R2 ile transfekte edilmiş HEK 293 hücreleri 2B morfometrik analizleri sınırlandırılması. Çekirdeğin merkez gösteren hücrelerin orta düzlem bölüm (cam lamel üzerinde 3-4μm) DAPI ve HA-CRF-R2 ile görselleştirilmiş anti-HA kullanılarak taranan ve Alexa 488nm bağlı anti-fare (IgG 1) orta kullanılarak görselleştirildi reseptör yapışma noktaları önemli ölçüde farklı ise antikor ve CLS ile elde edilen (A), tedavi yok (NT) ve (B) agonisti (CRF, 1 uM ve 30 dak) arasında herhangi bir fark göstermektedir. Film 1. Serbestçe HA-CRF-R2, herhangi bir tedavi ile 293 transfekte hücreler reseptör proteinleri arasındaki hücresel fenotip farklılıkları değerlendirmek için HEK arasında &quot;Aşan&quot; modunda 3D modeli döner. 5 ila 20 mikron dan Ölçeği bar./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; filmi görmek için buraya tıklayın. Serbestçe HA-CRF-R2, agonist tedavisi ile 293 transfekte hücreler HEK arasında &quot;Aşan&quot; modunda 3D modeli dönen Movie 2., CRF (CRF, 1 uM, 30 dk) reseptör proteinleri arasındaki hücresel fenotip farklılıkları değerlendirmek. 5 ila 20 mikron dan Ölçek çubuğu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın.</a> Film 3. Serbestçe HA-CRF-R2, agonist tedavi öncesi bir antagonist (AS-30, 1 uM, 30 dk) ile tedavi öncesi (CRF, 1 uM, 30 dk ile 293 transfekte hücreler HEK arasında &quot;Aşan&quot; modunda 3D döndürme ) reseptör proteinler arasındaki hücresel fenotip farklılıkları değerlendirmek. 5 ila 20 mikron dan Ölçek çubuğu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons.">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li><li>Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowing+what+counts:+unbiased+stereology+in+the+non-human+primate+brain.">Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain.</a> J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).</li><li>Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+morphometry+and+cell-cell+communication+of+the+osteocyte+network+in+chick+and+mouse+embryonic+calvaria.">The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria.</a> Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).</li><li>Vickery, R. G., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamin-dependent+and+-independent+mechanisms+target+structurally+homologous+dopamine+receptors+to+different+endocytic+membranes.">Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes.</a> J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).</li><li>Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+responsiveness+is+regulated+by+targeted+sorting+of+D2+receptors.">Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors.</a> Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).</li><li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial+morphogenesis.">Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> J. Microsc. 227, 140-156 (2007).</li><li>Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+single-cell+dynamics.">Measurement of single-cell dynamics.</a> Nature. 465, 736-745 (2010).</li><li>Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+multivariate+profiling+of+drug+responses+from+single+cells.">Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells.</a> Nat Methods. 4, 445-453 (2007).</li><li>Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+cell+migration+inhibitors+via+automated+microscopy+reveals+a+Rho-kinase+inhibitor.">Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor.</a> Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz CRF tedavisi önemli bir morfolojik değişim ve KBY-R2 yer indüklenen göstermiştir. CRF-R2 değişiklik seçici antagonisti tedavisi ile inhibe edilmiştir. Biz reseptör değişiklikleri standart 2D multispektral teknikler kullanılarak tespit edilmemiştir ve ölçülemez olduğunu gösterdi. Karmaşık 3D görüntüler çalışmaya yeteneği morfometrik analiz için biyolojik parametrelerin karmaşıklığı dahil etmek önemlidir. Biz tutarsız floresans ağ bileşenleri ile önceden tanımlanmış bir şeki...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> İnsan Embriyonik Böbrek (HEK293) </td><td> American Type Culture Collection&#39;dan </td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonal anti-HA.11 (IgG 1) </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td> Sigma </td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30 (AS-30) </td><td> Sigma </td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images

Floresans görüntüleri ölçüm için mevcut en yaygın yazılım analiz araçları veri noktaları ve analizlerin yorumlanması ve bulgularını desteklemek için bilgisayar destekli desen tanıma dahil etme ve dışlama manuel ayarlar güveniyor (2D) iki boyutlu veriler için vardır. Bu hücresel dinamikleri karmaşıklığına yakalamak ve biyolojik sistemler içinde hücre plastisite temelini anlamak mümkün olabilmesi için (3D) üç boyutlu veri setleri inşa floresans görüntüleri ölçebilmek için giderek daha önemli hale gelmiştir. Sofistike mikroskopi aletleri multispektral floresans görüntüler ve ardından toplanan 2D görüntüleri 3D temsilini sağlamak konfokal yığınlardan alınan görüntülerin yeniden yapılandırır güçlü analitik yazılım satın alma yoluyla 3D floresans görüntüler görselleştirme izin var. Gelişmiş tasarım tabanlı stereoloji yöntemleri Origina yaklaştırılması ve varsayımlardan ilerlemiştirhatta karmaşık doku kesitlerinde 2 l model tabanlı stereoloji 1. Mikroskopi bu bilimsel gelişmelere rağmen, ihtiyacı tam hücre morfolojisi, protein lokalizasyonu ve reseptör ticareti karmaşık değişimlerin analizi ve ölçümü için izin vermek için içsel 3D veri kullanan bir otomatik analitik yöntem için kalır. Floresans görüntüleri ölçmek için kullanılabilir Mevcut teknikler Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ve manuel analiz sağlamak Image J (NIH) içerir. Imaris (Andor Teknoloji, Belfast, Kuzey İrlanda) yazılımı bir ses dosyasını yerleştirilir ya da bir 3D nesne oluşturmak için 2D dilim bir dizi üzerine çizilebilir ölçüm noktalarının manuel oluşturulması sağlayan özelliği MeasurementPro sağlar. Bu yöntem, iki nesne arasında bir çizgi mesafe ölçmek ya da ilgilenilen bölge kapsayan bir çokgen oluşturmak için tek tıklama nokta ölçümleri için yararlıdır, ama compl uygulamak zordurex hücresel ağ yapıları. Filament Tracer (Andor) Ancak, bu modül gibi dendritler, akson ve dikenler (yapı ağacı gibi) oluşmaktadır nöronlar olarak tanımlanan yapıları ölçmek için geliştirilmiştir filament benzeri 3D nöronal otomatik algılama sağlar. Bu modül, ustaca nöronal olmayan hücreler 3 morfolojik ölçümler yapmak için kullanılmıştır, ancak çıkış verileri yerine bir amorf-şekilli hücre modeli olan daha tanımlanmış hücre şekline bağlıdır bir yazılım kullanılarak genişletilmiş bir hücresel ağ üzerinden bilgi sağlar. Amorf şekilli hücrelerin analiz ve biyolojik bir uygulama yazılımı daha uygun yapma sorunu aşmak için, Imaris Imaris Hücre geliştirdi. Bu hücre ve organeller arasındaki ilişkiyi hesaplamak için geliştirilmiştir Eidgenössische Technische Hochschule, bilimsel bir proje oldu. Yazılım hücre başına bir çekirdeği zorlayarak, biyolojik sınırların tespiti sağlarkenve segment hücrelere hücre zarlarını kullanarak, ideal geçersiz boşluksuz hücre yüzey oluşturur, çünkü sürekli değildir floresans verileri analiz etmek için kullanılan olamaz. Bildiğimiz kadarıyla, şu anda 3D floresans görüntüleri morfometrik bilgi sağlayan hiçbir kullanıcı tarafından değiştirilebilir otomatik yaklaşım tanımlanmamış bir şekli (Şekil 1) hücresel mekansal bilgi ulaştığından emin geliştirilmiştir. Biz MATLAB (Mat İşleri, Inc) da koordine Imaris çekirdek yazılım modülü ve Imaris XT kullanarak bir analitik platformu geliştirdi. Bu araçlar önceden tanımlanmış bir şekil vermeden ve tutarsız floresans ağ bileşenleri ile hücrelerin 3D ölçüm sağlar. Ayrıca, bu yöntem hücre dinamikleri morfolojik değişikliklerin ölçümü gerçekleştirmek için, bilgisayar uygulamalarına aşinalık biyolojik sistemlerde uzmanlık genişletilmiş, ancak araştırmacılar sağlayacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images at JoVE.com

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Video: An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biyoloji

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Sıçanlarda Meme Bezi Morfolojisi ve Meme Kanseri Riski değişiklikler

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...