Yazarlar rakamları ile yardım için Teele Palumaa teşekkür ederim. Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya Proje Grant 1008046 tarafından finanse edilmektedir.

1.. Disosiye Hipokampal Nöron Kültürü <ol><li> Lamelleri (borosilikat cam) hazırlayın: <ol><li> % 100 etanol içinde yıkayın. </li><li> UV ışınlaması altında hava kuru. </li><li> Poly-D-lisin (gece boyunca 4 ° C &#39;de, 0.15 M borat tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile kaplayın. </li><li> Bir sonraki gün (kültürün gün) laminin ile daha sonra kat PBS içinde 3 kez yıkayın üzerinde (2.5 ug / ml, doğal fare laminin) +% 5 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 saat de PBS içinde seyreltilmiş 37 ° C. </li></ol></li><li> Embriyonik 18 günlük (E18) sıçan hipokampları inceleyin ve kalsiyum ve magnezyum, buz üzerinde soğutulmuş içeren PBS içine toplar. NOT: hayvanları ile ilgili tüm deneysel protokolleri Melbourne Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre Papain&#39;in Ayrılma Kit gelen papain ve Dnaz ben çözümler hazırlayın. <ol><li> 1 ml papain çözeltisine 50 ul DNase I solüsyonu ekleyin. </li><li> NOT: Onceilk önce, hazırlanabilmekte papain çözeltisi ve DNase I çözeltiler ayrı ayrı (sırasıyla papain ve DNase I 0.5 ml ve 25 ul numuneler) alikotları dağıtılmış ve ihtiyaç duyulacak zamana kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Mümkün olduğu kadar PBS çıkarın ve 15-20 dakika boyunca 37 ° C &#39;de 1 ml papain / DNase I çözeltisi ile (embriyoların bir çöp itibaren) hipokampları inkübe edin. Yavaşça kuluçka dönemi sırasında iki kez içerikleri karıştırmak için tüp hafifçe vurun. </li><li> Hücre dispersiyon elde edilir ve eğer varsa, çok az kadar alevle parlatılmış Pasteur pipet silikonlu 10-15x hafifçe hipokampal doku (kabarcıkların oluşumunu önlemek) toz haline getirin, ayrışmamış doku parçaları kalır. </li><li> Dikkatle Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi artı katkı v sığır serum albümini (BSA) / w% 4, 3 ml yastığı üzerinde ayrışan hücre süspansiyonu katman (HBSS +; Bölüm 1.6.1 bakın). <ol><li> Rıştırılmalıdır oda sıcaklığında BSA eritilerek bu aşama gradyan çözeltisi hazırlayın2 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO 3 ve 40 mM glukoz (HBSS +), 4 ° C&#39;de daha sonra steril filtre ve mağaza ihtiva eden HBSS içinde bir halka </li></ol></li><li> Santrifüj, 100 xg, dışarı salınan bir rotor ile bir tezgah üstü santrifüj 7 dk. </li><li> Süpernatan hücre pelletini aspire için dikkatli olmak çıkarın. </li><li> 1 ml alevle parlatılmış (silikonlanmış) Pasteur pipeti (ya da 1 mi mavi pipet) ile yavaşça pelet hücreleri yeniden süspanse tam Neurobasal ortamı (% 2 B27 ile, 0.5 mM L-glutamin,% 1 FCS ile takviye edilmiştir). </li><li> (Sadece &quot;canlı&quot; hücreler olarak faz-parlak hücreleri saymak NB) Hemasitometre kullanarak iki 10 ul hacimde saymak. </li><li> Önceden hazırlanmış kaplı cam kapak slipleri (12 oyuklu bir plaka içerisinde 0.75-1 10 x 5/18 mm lamel) üzerinde birincil nöronlar Plate. (Aşağıya bakınız) hemen önce kaplama için, kapak slipleri fazla olan laminin / serum çözeltisi aspire ve primer nöron kültür ortamı ile değiştirin. NB Gerekli nlamelleri koyu kahverengi bir örtücü cam, hazırlama önce kültüre gün başlamış olduğu gibi (adım 1.1) önceden tespit edilmesi gerekmektedir. </li><li> Kültür sıçan primer E18 Neurobasal ortamı içinde in vitro (DIV),% 2 B27,% 1 FCS (ısı ile inaktive edilmiş) ile desteklenmiş 0.5 mM L-glutamin en fazla 21 gün boyunca hipokampal nöronlar. Bundan sonra haftada 7 DIV ve bir buçuk orta değişikliği gerçekleştirin. Anti-mitotik florodeoksiüridin / üridin 7 DIV ilave edilir, her nükleositin 10 mM stok) içinde 1/1, 000 seyreltme glial büyümeyi engellemek için. </li></ol> 2. Canlı Nöronlar ile antikor inkübasyon <ol><li> Kültüründe ilk haftasında, nöronlar dendritik milleri gelişmekte olan ve haftada 2-3, nöronlar sinaptogenez 6,7 geçiyor olması için yeterince olgunlaşmıştır. <ol><li> Seçilen deneme zaman noktası / s&#39;de, lamelleri birincil embriyonik nöron içeren üçlü çukurlara için birincil antikor uygulayın. Doğrudan bir kültür ortamı içine antikorun bir kısım eklemeistenen son seyreltme Not birincil nöronlar: Örneğimizde, proteinin rekombinant salgılanmış formu karşı ortaya çıkartılan bir tavşan poliklonal antiserumu de kültür ortamı içinde, 1 ml için 2 ul ekleyerek 1/500 seyreltilmiş, 10 dakika boyunca santrifüj , 13.000 xg, RT öncesinde bu gibi antikorun bir kısım alarak dahil edilebilir herhangi bir partikül madde kaldırır ve arka azaltmaya yardımcı olabilir. </li><li> Ön-bağışık serum kontrol için, (aynı nihai seyreltme) ön-bağışık serum eşdeğer bir miktar ekleyin. Herhangi bir ön-bağışık serum mevcut değilse, Neurobasal orta ya da PBS eşdeğer hacmi (birincil antikor kontrol) ekleyin. Uygun bir birincil antikor, proteinin hücre içi bölgesi / s tanıdığını kullanılabilir Alternatif olarak, bu antikor da, yüzey boyama spesifikliği test etmek amacıyla, bir kontrol eklenebilir. </li><li> 1-4 saat için kültür inkübatör hücreleri dön (bu kuluçka süresi deneysel olarak tespit edilebilir.) Bizim experime yılındaDeneysel tasarım içselleştirme zaman sürecini değerlendirmek için Yıkanmadan sonra başka bir inkübasyon süresi (darbe kovalayıcı deneyi), ardından bir antikorun bir darbe dahil olabilir, ancak nts, antikor, tüm süresi için de geçerlidir. Isteğe bağlı aşama: Bu inkübasyon gerektiğinde, bazal protein içselleştirme hızını yavaşlatmak için, oda sıcaklığında ya da buz üzerinde gerçekleştirilebilir. Olmayan bir CO2 kontrollü bir ortamda gerçekleştirilir ise, ortam bikarbonat antikor / antiserumu ilave edilmeden önce tamponlanmamış bir değiştirilmelidir. DİKKAT: Olgun nöron kültürleri (&gt; 14 gün, ve özellikle kültürlü fare embriyonik nöronlar) tam iyi orta değişiklik tahammül yok. </li></ol></li><li> Uygun zaman ilgilenilen protein bolluğu bağlı olarak rağmen biz iyi sonuçlar ile, 1 saat, 2 saat ve 4 saat içinde, bu primer antikor, geliştirilmiş içselleştirme aşama için inkübasyon sürelerini kullandık cel protein ticaretinin dinamikleriÇalışmanın altında ls. Not: Örnek Sonuçlar gösterilen çift-renkli görüntüler, bir doku kültürü inkübatörü içinde, 37 ° C&#39;de 1 saat bir kuluçkalama ile elde edilmiştir. </li><li> İstenen süre için inkübe edildikten sonra, antikor ihtiva eden bir ortam aspire. , Oda sıcaklığında PBS ile hafifçe fakat hızla bir kez kuyu yıkayın. </li></ol> 3. Sabit, Unpermeabilized hücreler İkincil antikor Application <ol><li> Fosfat tamponu pH 7.2 içinde% 4 paraformaldehit ile nöronlar Fix, oda sıcaklığında, 5 dakika Not: En iyi sonuçlar için, taze hazırlanmış fiksatif kullanımı, herhangi çökelmiş paraformaldehit belirgin olduğunu, alternatif olarak -20 ° C&#39;de saklanır ve tamamen çözülmüş edilmiş düzeltmeyi kullanmak . DİKKAT: paraformaldehid sabitleme maddesi hazırlanır ve bir çeker ocak içinde ele alınmalıdır. </li><li> Kuyular (davlumbaz sıvı atık kabına transfer) den düzeltme çıkarın ve PBS ile 3 kez yıkayın. <ol><li> İSTEĞE BAĞLI ADIM: İstenirse, antikor reaktifler kaydetmek için, lamelleri candikkatli bir forseps ile 12 oyuklu plakadan çıkarıldı ve tek bir kültür plakasının bazında koydu Parafilm bir tabaka üzerine, hücre tarafı yukarıya bakacak şekilde yerleştirilebilir. </li><li> Tamamen Parafilm üzerine lamel kenarına çözelti, sel olmadan sahiptir, böylece Solutions sonra, kapak slipleri üzerine pipetlendi yavaşça edilebilir. </li><li> Bu teknik, (örneğin, gece boyunca) nemlendirilmiş bir odada gerçekleştirilmelidir ancak uzun inkubasyon kısa süreli inkubasyon (1-2 saat) için uygundur. Seçenek olarak ise, lamelleri geri gece boyunca inkübasyon ve yeterli hacim için 12 oyuklu bir plakanın oyuklarına yerleştirilebilir lamelleri kurumaz emin olmak için ilave edilmelidir. </li></ol></li><li> PBS içinde% 5 BSA (: bu hücrelerin geçirgen olmadığı önemli olduğu gibi, bu aşamada bloke çözeltisine deterjanı Not) ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Blok. </li><li> Alt kanalların ile devam etmeden önce yüzey proteini etiketlemek amacıylaiçselleştirilmiş protein tion, seçimi ilk floresan etiketli 2 ° antikor uygulanır. Not: Burada tarif edilen örnekte, primer antiserumun bir rekombinant salgılanmış izoform 4 tavşan (in-house antikor) içinde büyüdü. Bu nedenle, unpermeabilized nöronların yüzeyinde zar izoformunun hücre dışı bölgesini tespit etmek için ilk sekonder antikor için, eşek anti-tavşan DyLight 649 (% 5 BSA ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş 1/200) kullanılır. Bu kullanılmadan önce seyreltilmiş sekonder antikor çözeltileri (10 dakika, 13,000 xg, RT) santrifüje önerilir. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca lamelleri inkübe edin. </li><li> PBS ile (kuyu) lamelleri yıkayın, 2x 5 dk. </li></ol> 4. Fazla Etiketsiz 2 ° Antikorla engelleme <ol><li> Etiketlenmemiş 2 ° antikoru, yüksek konsantrasyonda (&gt; 0.1 mg / ml) ile bloke unpermeabilized nöronlar. <ol><li> Etiketlenmemiş 2 ° antikoru türlerine karşı yükseltilmiş olmalıdır kiBirincil antikor, oda sıcaklığında gece boyunca inkübasyon ile (bu durumda tavşanda) yükseltilmiştir. </li><li> Bu protokol için, AffiniPure F ab fragmanı, keçi anti-tavşan IgG (H + L) 0.13 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda kullanılmıştır. Not: gece boyunca inkübasyon daha kısa bir kuluçka dönemi (2 saat) kadar önemli olduğu bulunmuştur tam olarak etiketlenmiş ikincil antikor ile bağlı değildi birincil antikor tam bloke etmek için yetersizdi. </li></ol></li><li> PBS ile (kuyu) lamelleri yıkayın, 2x 5 dk. </li><li> Bu Bloke etme kademesinden sonra, fosfat tamponu pH 7.2, oda sıcaklığında, 5 dakika içinde% 4 paraformaldehit ile hücrelerin post-düzeltin. (Çeker ocak içinde sıvı atık konteynerine transfer sabitleyici) sabitleyici ayrılmasından sonra, PBS (2x) ile durulayın. </li></ol> 5. İkinci Floresan Konjuge 2 ° Antikor Permeabilization ve Uygulama <ol><li> Permeabilize ve oda Tempe de% 0.1 Triton-X-100 içeren PBS içinde% 5 BSA ile bloke hücrelerin30 dakika boyunca hava sıcaklığı. </li><li> Engelleme çözüm (lamelleri kurumasına kalmamasıdır dikkat çekici) sökün. Farklı bir florofor ile etiketlenmiş ikinci floresan konjuge edilmiş 2 ° antikoru ilave edin. <ol><li> NOT: (aşağıya bakınız) konfokal mikroskop kullanılabilir uyarma / emisyon filtreleri bağlı olarak, önceden kullanılan birinden bu fluoroforun etiketi ayırt etmek mümkün olmalıdır. </li><li> Bu protokolde yer alan, örneğin, bir Alexa Fluor 488-konjüge edilmiş eşek anti-tavşan 2 ° antikoru (1 / PBS içinde 200,% 5 BSA ve% 0.1 Triton-X-100) kullanılmıştır. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe sonra 2 ° antikoru uzaklaştırın. </li></ol></li><li> Yıkama 3x PBS ile 5 dakika lamelleri ve son olarak, deiyonize su ile kısaca yıkayın. </li></ol> 6. Montaj ve Görüntüleme <ol><li> Dağı sulu montaj orta içeren antifade (örn. Vectashield) ile cam slaytlar lamelleri ve kurumasını bekleyin. Op boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta deposuflüoresan sinyal yoğunluğunun timal korunması. </li><li> Görüntü bir konfokal mikroskop hücreleri immunohistokimyasal. <ol><li> İki florofor sinyallerin tespiti için uygun uyarma ve emisyon filtreleri mevcut olmalıdır. </li><li> Farklı deney koşulları (depolarize 8,9 veya kontrol koşullarında, örneğin içselleştirme hızları) karşılaştırılabilir için ise, aynı görüntü tedarik parametreleri ile görüntülenmiş olan çeşitli koşullarından lamelleri çoğaltmak emin olun. Standart ilgi alanlarının ya da elde edilen görüntülerden puncta özelliklere (örneğin sayısı, boyutu) &#39;in yoğunluğu, daha sonra standart entegre görüntü analizi yazılımı (ör. Fiji / ImageJ, Metamorph) kullanılarak ölçülebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada anlatılan teknik, (by-Cárcamo Arancibia et al. Yorumlanan), hücre-yüzeyi biyotinilasyon 12 ile tamamlayıcı olan ve bu içsel proteininin hücre-altı lokalizasyonu hakkında bilgi muhafaza etmek için tercih edilen bir yöntem, uygun bir birincil antikor bir sağlanan hücre epitopu kullanılabilir. Buna ek olarak, zaman içinde protein ticareti / içselleştirme kantitasyonu protein özleri hazırlamak üzere gerek kalmadan (birincil antikor ile canlı hücre inkübasyonu boyunca farkl?...

Yeni tanımlanan proteinin işlevini kurulması, söz konusu proteinin hücre içi lokalizasyonu ve ticareti araştırılması protein 1,2 olası rolü / s ile ilgili önemli ipuçları sağlayabilir. Gelişmekte neokorteks 3 transcriptome biyoinformatik analizi fare beyin Kortikogenezin sırasında değişmiş ifadesini sergileyen genlerin bir listesini bize sağladı. Daha sonra, bu genlerin, sez6 tarafından kodlanan protein, nöron gelişmesinde önemli bir role sahip olduğunu tespit etmek için bir gen nakavt bir yaklaşım kabul etmiştir. Biz Nöbet-ilişkili gen 6 veya Sez6, protein gelişmekte dendritler bulunan ve aynı zamanda dendritik dikenler, almak ve uyarıcı sinyalleri entegre dendritler özelleşmiş yapılar mevcut olduğu görülmektedir. Bu proteinin eksik olduğunda Dahası, dendritler ve uyarıcı sinapsların doğru 4 oluşturmak için başarısız. Proteinin olası hakim izoformu transmembran bölgesinin özelliklere sahiptire imüno-reseptör proteininin hücre içi dağılımı konfokal mikroskopi ile ya da imünoelektron mikroskopla incelenmiş zaman, her ne kadar çoğu, hepsi değilse de, sinyalin plazma zarının etiketli çok az ya da hiç protein ile somatodendritik bölmesindeki küçük veziküller ile ilişkili ortaya Hücre yüzeyinde. Kesin bir tahmin büyük bir hücre-dışı etki alanı ile farazi reseptör plazma zarına kaçırılan olduğunu göstermek için, biz, hücre yüzeyinde proteini etiketlemek için proteinin bir hücre dışı kısmına oluşturulan olan antiserum kullanarak canlı hücre bir yaklaşım kabul etmiştir. Geniş bir bloke etme ve bir permeabilizasyon adım ayrılmış diferansiyel etiketli ikincil antikor, iki uygulama ile, bu &quot;antikor besleme&quot; yaklaşımı birleştirerek, floresan-etiketli sekonder antikorları farklı fluoresc taşıyan bağlanarak ayırt proteininin iki farklı havuzları tespit etmişlerdirKBB etiketleri. Böylece, ya da hücre yüzeyi üzerinde kalmış veya bu süre esnasında yüzeye ticareti yapılan edilmiş proteinden antikor inkübasyon aşaması esnasında endositoz tarafından internalize edilmiş bir protein ayırt etmek mümkün oldu. Bu yöntemi kullanarak, ilgi konusu olan protein nöronlarda hücre yüzeyine ve kaçırılan olduğunu kurulmuştur. Bu nedenle, bu nispeten hızlı ve basit bir teknik tüm bu teknikler için aynı tavşan poliklonal antiserumu kullanılan gerçeğine rağmen, geleneksel yöntemlerle immünositokimya ya da önceden gömme immünolojik elektron mikroskobu daha fazla bilgi kanıtladı. Bu teknik, hücre dışı alanı epitopları tanıyan iyi bir antikor kullanılabilir verilen herhangi bir transmembran proteinin genel olarak uygulanabilir. Bu teknik, glutamat reseptör alt-biriminin GluR1 5 reseptör kaçakçılığı incelemek için daha önce kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

Kültüre edilmiş nöronlarda bir farazi transmembran reseptörünün hücre yüzeyi yerini göstermek amacıyla, protein, bir hücre dışı bölümüne karşı ortaya çıkartılan bir antikor ile belirli bir primer, canlı nöronların yüzeyi üzerinde protein etiketli. Hücreler daha sonra tespit sonrası hücre yüzeyi ve iç protein her ikisi de aynı etiketli ikincil antikor ile tespit edilecek ise geçirgen reseptör olarak, yüzeye ve kaçırılan olduğu göz önüne alındığında. Burada, ya da hücre yüzeyi üzerinde kalmış veya bu süre esnasında yüzeye ticareti yapılan edilmiş antikor, inkübasyon kademesi sırasında ve protein endositoz tarafından internalize edilmiş etiket protein diferansiyel protein kaçakçılığı (&quot;antikor besleme&quot;) çalışma için kullanılan bir yöntem adapte . Bu iki protein havuzları ayırt etmek yeteneği bir ilk Kuluçka sonra yüksek derecede konsantre edilmiş, etiketlenmemiş ikincil antikor ile bir gece boyunca bloke aşamasının dahil edilmesi sayesinde mümkün olmuştur, flüoresan-işaretli sekonder antikor ile unpermeabilized nöronların n. Farklı bir florofor ile işaretlenmiş bir fluorescent sekonder antikor ile içsel havuz tespit izin nöron bloke edici aşama, sonra, nüfuziyet. Biz ne olduğunu ortaya koyan, bu farazi reseptörün hücre içi konumu hakkında önemli bilgiler elde başardık bu tekniği kullanarak, gerçekten, nöronlarda hücre yüzeyine ticaretine. Bu teknik, bir hücre-dışı epitopuna uygun bir antikorun sağlanması ve kullanılması, hücre tipleri ve hücre yüzey proteinleri bir dizi geniş çapta uygulanabilir kullanılabilir.

Burada sunulan iki renkli floresan immüno-lekeleme tekniği (Şekil 1 &#39;de şematik olarak gösterildiği gibi) canlı hücrelerde transmembran proteinlerin hücre dışı etki etiketleme için yararlıdır. Kuluçka süresi boyunca, immünoglobulinler, erişilebilir epitopları bağlanan ve birlikte bağlı antikor ile protein moleküllerinin popülasyonunun bir kısmı, endocytosed edilir. Buna ek olarak, yeni sentezlenen protein ileri ticareti vasıtasıyla hücre yüzeyine ulaşabilir ve geri ka...

Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Görüntüleme.  The University of Melbourne.  Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir. 

Video: Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Nörobilim

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.