,,, NRSA (DPS F32-NS-066698); Çalışma Smith Aile Vakfı (BS), Dana Vakfı (BS), John Merck Bilginleri Programı (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801) hibe tarafından desteklenmiştir Nancy Lurie Marks Vakfı (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Görüntüleme Çekirdek).

RGC Presinaptik Girişler 1. Anterograd Etiketleme Not: hayvanların kullanımını içeren tüm deneyler tüm NIH kurallarına uygun olarak gözden ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından denetlenecektir edildi. <ol><li> Alanını ve aletleri sterilize edin. </li><li> Bir pleksiglas indüksiyon odasında 4 hacim% izofluran (bu hacimce% izofluran yenidoğan yetişkin fareler için çalışır) ile fare anestezisi. Aşırı anestezi önlemek için yakından fareler gözlemleyin. DİKKAT: Bir vakum atık gaz tahliyesi ile solumaktan kaçının. </li><li> 1-3 dakika sonra, (eski fareler daha az zaman gerektirir) anestezi uygun düzey kuyruk kısma (hiçbir tepki dikkate alınmalıdır) ve solunum hızı (oranı yavaş ve istikrarlı olmalıdır) gözlemleyerek elde sağlamak. </li><li> Burun üzerinde 3-4 hacimce% izofluran teslim yan ve yer burun konisi üzerindeki stereo mikroskop altında fare yerleştirin (yenidoğan &lt;postnatal günde 10 (P10) ~ 4 hacimce%;&gt; P10 ~ 3 vol%). </li><li> Sklera Açığa. Yenidoğanların enjeksiyon için önce göz açma, göz kapağı açın ve sklera maruz cilt geri çekmek için küçük yaylı bir makas kullanın. Yaşlı farelerin için, sklera açığa göz çevresindeki cilt geri çekmek için parmaklarınızı kullanın. DİKKAT: yenidoğanlar, bazen gözün köşesinde dik bir kesim gereklidir. , Kesersek, aşırı kanama bir kan damarı olduğu gibi göz kapağı köşe keserken dikkat edin. </li><li> Sklera başlayan çizgisinde gözün tarafında küçük bir delik delmek için steril bir 30.5 G iğne kullanın. Sadece şimdiye kadar konik göz içine gider iğne sokarak lens zarar vermemek için dikkat edin. </li><li> Camsı delikten dışarı akar ve sıvıyı emmek için steril bir pamuk uçlu bir uygulama aleti kullanmak izin verin. </li><li> Vitreus deliğinden akan durduktan sonra, anterograd izleme boya ile önceden yüklenmiş bir Hamilton şırınga bağlı künt uçlu iğne takındeliğe. DİKKAT: yavaş yavaş gözün diğer tarafında delinme veya lens zarar görmesini önlemek için iğne takın. </li><li> Yavaşça göz içine boya enjekte. Tipik olarak, Alexa 594, 647 ya da 488 (CTB-594, CTB-647 veya CTB-488, 5-6 mg / ml) konjuge β kolera toksin alt-biriminin anterogradely iz RGC girişleri için kullanılır. Doğanlarda (≤ P10) için 1-2 ul yeterlidir ve fareler için&gt; P10-3 ul yeterlidir. Not: Alexa boyalar lizozomal bozulmaya karşı özellikle dayanıklıdır </li><li> Bir kaç saniye için deliğe iğne bırakın ve daha sonra yavaş yavaş çıkarın. </li><li> Aşırı sıvı emer ve dışarı sızmasını önlemek için boya bir pamuklu çubuk kullanın. </li><li> Göze antibiyotik merhemli bir miktar uygulanır. Göz cerrahi açıldı, hafifçe birlikte göz kapaklarını yeniden konumlandırmak. </li><li> Iki gözü enjekte ederseniz, diğer göz yordamı tekrarlayın. </li><li> Bu Anesth kurtarmak için başlayana kadar aşağıdaki enjeksiyon (ler), bir ısı lambası altında veya ısı pad üzerinde fare bırakınÇSED. </li><li> Temiz bir ev kafes fare dönün ve koloni dönmeden önce tamamen uyanık olduğundan emin olmak için monitör. </li></ol> 2.. Görüntüleme Doku hazırlayın Bu doku hazırlanması protokol fagositler fluoresan işaretleri (örneğin, mikroglia için CX3CR1-EGFP) ile etiketlenmiş olduğu raportör fareler için kullanılır. Bir muhabir satır mevcut değilse, araştırmacı (Tartışma) doku bölümleri immunostain olabilir. <ol><li> ~ 24 saat enjeksiyondan sonra, fare kurban ve beyin teşrih. </li><li> Gece boyunca 4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehit (PFA) ile dolu bir Falcon tüpüne beyin düzeltmek bırakın DİKKAT: PFA toksiktir. Bir davlumbaz veya bir aşağı doğru masaya kullanarak ve kişisel koruyucu ekipman giyerek solumaktan ve cilt maruz kalmaktan kaçınınız. Notlar: Fixation (≥ 4 saat) daha kısa olabilir. Yerine damla sabitleme Buna ek olarak,% 4 PFA perfüzyon kullanılan bir 2-24 saat damla düzeltme ile takip edilebilir. Bununla birlikte, perfüze karşılaştırılmasıSabit yenidoğan ve yetişkin beyin düşmesi d görüntü kalitesi veya nicellendirmesinde fark saptandı. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde beyin 3 kez yıkayın. <ol><li> Boş bir tartmak tekne içine beyin ve PFA dökün. </li><li> Başka beyin aktarmak için bir spatula kullanın PBS ile dolu tekne tartın. </li><li> Iki kez daha PBS yıkama beyin (transfer beyin iki PBS ile dolu tekneler tartın). </li></ol></li><li> % 30 sukroz çözeltisi ile doldurulmuş bir Falcon tüpüne beyin aktarın. Beyin borunun (24-48 saat) dibine batar kadar 4 ° C de sakaroz beyin bırakın. </li><li> Beyin lavabolar kez, kesit için beyin hazırlamak. Aşağıdaki adımlar, dondurma aşaması ile bir kayar mikrotom kullanılarak 40 um Yüzen kesitlerin hazırlanması (a kriyostat da kullanılabilir) vardır. <ol><li> (DLGN için, beynin rostral ve kaudal parçaları kaldırmak) gerekli değildir beynin parçalarını kaldırmak için bir jilet kullanın. </li><li> Sutyen FreezeKuru buz üzerine alüminyum folyo üzerine. Bu süre boyunca, mikrotom sahne dondurma ve 0.5 mi 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB) ile, 24 oyuklu plakanın her doldurun. </li></ol></li><li> Dondurma sahnede (opak görünmelidir) dondurulmuş beyni monte edin. <ol><li> Sahneye optimum kesim sıcaklık bileşik (OCT) küçük bir miktar uygulayın. </li><li> Ekim dondurmak başladığında, OCT beyin yatıyordu. Kesilecek beynin ucu (kuyruk tarafı yukarı bakacak DLGN için, örneğin) yukarı bakacak şekilde olmalıdır. </li><li> Çok ince ezilmiş kuru buz ile beyin ve Ekim örtün. </li><li> ~ 30 sn için beyin / Ekim kuru buz bırakın. </li><li> Kuru buz kaldırmak için büyük bir boya fırçası kullanın. Beyin ve Ekim sahneye dondurulmuş olmalıdır. </li></ol></li><li> Ilgi (ROI) bölgesi ulaşana kadar dokusu ile kesit başlayın. </li><li> ROI ulaşıldığında, bıçak bölümler çıkarmak ve 24-iyi plat bunları aktarmak için küçük bir boya fırça kullanınE 0.1 M PB (adım 2.5.2) içeren. Önce bıçak bölümleri çıkarılması için 0.1 M PB içinde ıslatarak ıslak boya fırçası tutun. Not: Bölümler, 4 ° C de bir gece boyunca 0.1 M PB bırakılabilir </li><li> Bölümlerde toplanmıştır sonra, bir floresan mikroskop altında anterograd etiketleme görselleştirmek ve yatırım getirisini içeren bölümler seçmek. </li><li> Küçük bir boya fırçası ile bir slayt bölümleri monte edin. <ol><li> Bir ücret mikroskop lamı 0.1 M PB küçük bir havuz uygulayın. </li><li> PB havuzuna doku bölümü aktarın. </li><li> Şark için PB ve boya fırça kullanın ve doku yayıldı. </li><li> Aşırı PB fitil için bir Kimwipe kullanın. Bölümü kapalı esneklik önlemek için özen gösterin. </li><li> Tamamen kurumaya bırakın. </li><li> Her bölüme montaj orta küçük bir damla uygulamak ve (22 x 50 mm, No 1.5) üstünde bir lamel monte. </li><li> Görüntüleme oturumu kadar -20 ° C&#39;de oje ve mağaza ile slayt kenarları mühür. Not: görüntüleme ile beraberhazırlanması tavsiye edilir bir hafta içinde, saydam görüntüleme önce birkaç hafta boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> 3.. Görüntüleme Doku Tüm görüntüler dönen bir disk konfokal mikroskop (ultraview Vox dönen disk diyot lazer (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm ve 640 nm) ile donatılmış konfokal mikroskop) üzerinde elde edilir. Görüntüler de (örneğin, lazer tarama konfokal mikroskop, deconvolution, vb izledi epifluorescent mikroskop) yüksek çözünürlüklü z-yığınları elde etmek için yeteneği ile herhangi bir mikroskop üzerinde elde edilebilir. Çerçeve boyutu genellikle 1,000 x 1,000 piksel. <ol><li> 10X büyütme ROI bulun ve bir görüntü kazanır. Retinogeniculate sistemde mikroglianın görüntüleme için, ROI en medial DLGN bölümleri olduğunu. </li><li> Yüksek büyütme Shift (60X Planı Apo amacı, NA 1.4, genellikle kullanılır =). </li><li> 0.2 mikron z-adımı kullanarak fagositler içeren görüş ilk alan Edinmes. </li><li> Hayvan başına fagositler içeren 15-19 daha fazla alan kazanmak. </li></ol> 4. Kantitasyonu (ImageJ) Görüntülerini hazırlayın <ol><li> ImageJ Open z-yığını. </li><li> Görüntü menüsünde, Renk ve bölünmüş Kanalları gidin. </li><li> Sardı malzemeyi içeren kanal (lar) için bir arka plan çıkarın. <ol><li> Yuttu malzeme (örneğin, presinaptik girdiler) içeren kanal penceresini seçin. </li><li> İşlem menüsünden gidin ve Çıkart Arkaplan seçin. DLGN presinaptik girdilerin anterograde izleme için 10 piksel yuvarlanan bir top yarıçapı kullanın. Not: yuvarlanan topu yarıçapı ampirik olarak belirlenir. Bununla birlikte, genel olarak arka parçası olmayan görüntüde en nesnenin yarıçapı kadar büyük olmalıdır. </li></ol></li><li> Fagosit içeren kanalı Smooth. <ol><li> Fagosit (örneğin, mikrogliya) içeren kanal penceresini seçin. </li><li> İşlem menüsünden ve sel gitEKT Filtreler, ortalama. 1.5 &#39;lik bir ortalama filtre (bu sonraki adımda yüzey sunumuna için görüntüyü yumuşatır) kullanın. </li></ol></li><li> Fagosit içeren kanaldan arka plan çıkarın. <ol><li> Fagosit (örneğin, mikrogliya) içeren kanal penceresini seçin. </li><li> (Ayarları ampirik kararlı olmak gerekir) çıkarma arka plan seçin, İşlem menüsünden gidin. EGFP-pozitif mikrogliada için 50 piksel yuvarlanan bir top yarıçapı kullanın. </li></ol></li><li> Görüntü menüsüne gidip Renk, Kanallar Birleştirme seçerek kanalları birleştirmek. </li><li> (Bu hızlı render yüzey yapar, adım 5) birleşti dosyadan phagocyte içeren kırpma ROI. <ol><li> Araç çubuğunda dikdörtgen seçimleri aracını kullanarak ROI çevresinde bir kutu çizin. </li><li> Görüntü menüsüne gidin ve Kırp seçeneğini seçin. </li></ol></li><li> (Adım 4.2) tekrar kanal bölünmüş. </li><li> Kendi TIFF dosyası olarak her kanalı kaydedin. </li></ol> 5. Nicelik için resim hazırlamaImaris içinde <ol><li> Açık Imaris ve Ses simgesi sol üst menüde (Şekil 2) seçili olduğundan emin olun. </li><li> Kırpılmış resmin açık ilk kanal (kanal herhangi sadece tutarlı olması ilk açılabilir). </li><li> Diğer kanal (lar) ilave edin. Düzen menüsüne gidin, Ekle Kanallar ve dosyasında sonraki kanalı belirleyin. (Kalan kanallar için bu adımı tekrarlayın). Not:, rengini değiştirmek Display Ayarları penceresine gidin ve kanal adı (Şekil 3A) üzerine tıklayın. Bu rengi ayarlamak için bir diyalog kutusu açılacaktır. Görüntü Ayarı penceresi görünmüyorsa, Düzen menüsüne gidin ve Display Ayarı seçin. </li><li> Piksel değerlerini ayarlayın. Düzen menüsüne gidin ve Görüntü Özellikler seçeneğini seçin. Bu pencerede, x, y, ve z piksel değerlerini (Bu değerler, mikroskop, objektif, kamera, ve z-adım edinimi bağlıdır ve görüntü elde etmek için kullanılan yazılım bulunabilir) ayarlayın. </li><li> Adım 5.5 &#39;a çok neden olurküçük resim. Yeniden boyutlandırmak için, sağ alt köşedeki Fit simgesi (Şekil 2) tıklayın. </li><li> Görüntü Ayarı penceresinde, sol ve orta üçgenler kullanarak her kanal için parlaklık ve kontrastı ayarlayın. </li></ol> Fagosit 6. 3 Boyutlu (3D) Yüzey Rendering <ol><li> Üst araç çubuğunda, aşmak modu (Şekil 3C) seçili olduğundan emin olun. </li><li> Görüntü Ayarı penceresinde, fagosit kanal hariç tüm kanalları işaretini kaldırın. Bu görüş alanında bunları kaldıracağız. </li><li> Yüzey Rendering simgesini (Şekil 2) tıklayın. </li><li> Bir oluşturmak pencere sol alt (Şekil 4A) görüntülenir, emin Segment ROI bu ilk pencerede işaretlenmemiş olun. Altındaki mavi ileri düğmesini tıklatın. </li><li> Yumuşatma ayarlayın. <ol><li> Bir sonraki pencerede, aşağı açılır menüden (Şekil 4B) den fagosit kanal seçin. Bu ayarlaryüzeyli olacak ve (0,1 mikron süzme genellikle mikrogliada için kullanılır) ampirik olarak tespit edilmelidir ayrıntı miktarı. </li><li> Mutlak eşikleme seçin. </li><li> Altındaki mavi ileri butonuna tıklayın. </li></ol></li><li> Eşik görüntü. <ol><li> Görüntü (Şekil 4C) uygun şekilde su yüzüne kadar histogram ve sürükleme tıklayın. Bu floresan resmi üzerine bindirilmiş gri yüzeyler doğru bir yüzey gösterimi sağlamak için görüntü çevirerek ampirik olarak belirlenir. Notlar: döndürme, ekran (Şekil 3B) sağ üst tarafındaki Pointer menüde navigasyon seçeneğini tıklatın ve döndürmek için görüntüyü basılı tutun. Orijinal yönüne Görüntüyü döndürmek için, öğesini seçin Origin Alttan Görünüm menüsünden Sol. </li><li> Altındaki mavi ileri butonuna tıklayın. </li></ol></li><li> Bir sonraki pencerede, görüntü çok gürültülü olmadıkça vb büyüklüğü, herhangi yüzeyleri süzmek için bir seçenek var, filtre ve bir silmeyinotomatik olarak görünür y filtreler. Fagosit render yüzeyini bitirmek için altındaki yeşil oku tıklatın. Sekmeleri yeni bir dizi (Şekil 5) görünecektir </li><li> Gerektiğinde, ilgi konusu fagosit bir parçası olmayan herhangi bir yüzey silme. <ol><li> Seç seçenek Pointer menüsünde (Şekil 3B) seçili olduğundan emin olun. </li><li> O sarı döner böylece silinecek herhangi bir yüzey tıklayın. Ctrl tuşunu basılı tutarak birden fazla yüzeyleri silmek için, yüzeyler üzerine tıklayın. </li><li> Kalem sekmesi altında Sil&#39;i tıklatın. </li></ol></li><li> Seçip bir yüzeyi içine fagosit tüm yüzeyleri birleştirme. <ol><li> Huni (; Şekil 5C yani Filtre sekmesi) tıklayın. </li><li> Ekle &#39;yi tıklatın. </li><li> , Herhangi bir filtre seçin kadar (tüm yüzeyler sarı olmalı) sola histogramı sürükleyin. </li><li> Geri Kalem sekmesine gidin ve birleştirmek tıklayın. </li></ol></li><li> Grafik sekmesine gidin (Şekil 5A </strong&gt;) ve Ayrıntıları tıklatın ve görüntülemek için herhangi bir parametre seçin. Hacmi (Şekil 5D) seçin. Birden parametreleri görüntülemek için, sol alt Anahtarı simgesini (Şekil 2) gidin ve kaydetmek için parametreleri seçin. </li><li> Fagosit hacmini kaydedin ve devam etmeden önce dosyayı kaydedin. </li></ol> Yuttu Malzeme 7. 3D Yüzey Rendering <ol><li> Fagosit tarafından yutulmuş olan malzeme için yeni bir kanal oluşturun. <ol><li> Fagosit yüzey seçili iken, kalem sekmesine tıklayın. </li><li> Tüm Maske tıklayın. </li><li> Görünen diyalog, yuttu malzeme (; Şekil 5B örneğin, presinaptik girişlerin anterograde izleme) karşılık kanalı seçin. </li><li> Maskeyi uygulamadan önce yinelenen kanalını kontrol ve Tamam&#39;a basın. </li><li> Yeni bir kanal sardı olmuştur yalnızca materyali içeren ve içinde olan Görüntü Ayarı penceresinde görüntülenirphagocyte. </li></ol></li><li> Yüzey işlemek toplam sardı ve nonengulfed malzeme içeren kanal. <ol><li> Yüzüne edilecek kanal hariç Görüntü Ayarı penceresinde tüm kanalları işaretini kaldırın ve fagosit için oluşturulan yüzey işaretini kaldırın. </li><li> Yine Yüzey işleme ikonuna tıklayın (adım 6.3) ve (6,4-6,11 adımlar) fagosit için anlatıldığı gibi aynı adımları kullanarak kanal için bir yüzey oluşturmak. Notlar: önce (adım 6.5; Şekil 4B) yumuşatma ve eşikleme için doğru kanalı seçmek için emin olun. Eşik değerini not edin (; Şekil 4C adım 6.6). Bu değer aynı zamanda yüzey sunumuna sonra elde edilebilir (Wand sekmesi; Şekil 5A) tamamlandı. </li></ol></li><li> Toplam sardı ve non-yuttu malzemenin hacmini kaydedin ve devam etmeden önce dosyayı kaydedin. </li><li> Yüzey yuttu malzeme (fagosit içinde malzeme) vermekteyiz. <ol><li> Sadece floresan görselleştirmesardı malzemenin yeni bir kanal (adım 7.2.1.) </li><li> Yukarıdaki gibi aynı adımları (7,2-7,3 adımları) izleyin. Notlar: (adım 7.1 oluşturulan yeni kanalı seçin) öncesinde yumuşatma çekme menüden doğru kanalı seçmek için emin olun. Eşik penceresinde, el toplam sardı ve non-sardı malzeme (adım 7.2.2 bakınız) render için kuruldu eşik değerini girin. </li></ol></li><li> Yuttu malzemenin hacmini kaydedin ve devam etmeden önce dosyayı kaydedin. </li></ol> 8. View Alan Toplam Hacim hesaplayın <ol><li> Herhangi bir kanal için yeni bir yüzey oluşturmak. </li><li> Tüm alan yüzüne böylece eşikleme penceresinin (adım 6.6), histogram sola doğru kaydırın. </li><li> Tüm alan yüzey bitirmek ve (6,7-6,11 adımlar) hacmi rekor. </li><li> Dosyayı kaydedin. </li></ol> 9. Fagosite Malzeme Tutar Hesapla <ol><li> Yoğunluğunu hesaplamakaşağıdaki algoritmayı kullanan toplam sardı ve non-sardı malzemesi kanal: Field (adım 8) Toplam yuttu ve Non-sardı Malzeme hacmi (7.3 adım) / Cilt. </li><li> Aşağıdaki algoritmayı kullanarak, hücre başına% yutulmasına hesaplayın: (Sardı Malzeme hacmi (7.5 adım) / fagosit (adım 6.11) Toplam Hacmi) x 100 Notlar: hücre boyutuna farklılaşmaların hesaba katılması için, veriler, fagosit toplam hacmine göre normalize edilir. Aşama 9.1 numaralar alanları arasında oldukça değişkendir, bu 9.1 &#39;de hesaplamaya adım 9.2 verileri normalize etmek için gerekli olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Aguzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+scapegoat,+saboteur,+or+something+else.">Microglia: scapegoat, saboteur, or something else.</a> Science. 339 (6116), 156-161 (2013).</li><li>Tremblay, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain.">The role of microglia in the healthy brain.</a> J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Dheen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+and+its+implications+in+the+brain+diseases.">Microglial activation and its implications in the brain diseases.</a> Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Katz, L., Shatz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+constuction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the constuction of cortical circuits.</a> Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Hua, J. Y., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+and+the+dynamics+of+central+nervous+system+development.">Neural activity and the dynamics of central nervous system development.</a> Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li><li>Butz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+structural+plasticity.">Activity-dependent structural plasticity.</a> Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).</li><li>Bruel-Jungerman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+plasticity+mechanisms+and+memory:+a+party+of+four.">Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four.</a> Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+during+development+and+disease:+immune+molecules+take+centre+stage.">Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage.</a> Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).</li><li>Alexander, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complement+system:+an+unexpected+role+in+synaptic+pruning+during+development+and+disease.">The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).</li><li>Brown, A., Weaver, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dark+side+of+neuroplasticity.">The dark side of neuroplasticity.</a> Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li><li>Tan, A. M., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury,+dendritic+spine+remodeling,+and+spinal+memory+mechanisms.">Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms.</a> Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).</li><li>Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+spinal+cord+plasticity+in+health+and+disease.">Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;quad-partite&amp;#34;+synapse:+Microglia-synapse+interactions+in+the+developing+and+mature+CNS.">The &amp;#34;quad-partite&amp;#34; synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS.</a> Glia. 61 (1), 24-36 (2013).</li><li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-induced+trafficking+and+turnover+of+the+cis-Golgi+glycoprotein+GPP130.">Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130.</a> Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Knobloch, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+loss+and+synaptic+alterations+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease.</a> Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).</li><li>Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+synaptic+pathophysiology+in+neurodegeneration:+insights+from+Huntington's+disease.">Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease.</a> Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).</li><li>Noda, M., Suzumura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweepers+in+the+CNS:+Microglial+Migration+and+Phagocytosis+in+the+Alzheimer+Disease+Pathogenesis.">Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2012).</li><li>Rotshenker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophage+activation+and+the+regulation+of+complement-receptor-3+(CR3/MAC-1)-mediated+myelin+phagocytosis+in+injury+and+disease.">Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease.</a> J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).</li><li>Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+myelin+in+demyelinative+disease:+a+review.">Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review.</a> Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Doğru fagositoz ölçmek amacıyla, yuttu malzeme lizozomal bozulma oluştu kez araştırmacı bunu görselleştirmek şekilde etiketlenmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü görüntü tüm hücre hacmini görselleştirmek ve içeriğini ölçmek için araştırmacı sağlayacak bir yazılım kullanımı ile, ardından gereklidir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon ile birlikte yuttu malzemeyi etiketlemek için Alexa boyalar konjuge CTB kullanarak...

<html> Sinaptik devreler bir hayvanın ömrü boyunca pişmanlık. Gelişmekte olan beyindeki sinapslar aşan formu ve sinapsların bir alt kümesinin seçici çıkarılması ve 8-10 kalır bu sinapsların bakım ve güçlendirilmesini içeren sinaptik budama geçmesi gerekir. Bu işlem, yetişkin sinir sisteminin kesin bağlantı özelliği elde etmek için gereklidir. Yetişkinde, sinaps, özellikle öğrenme ve hafıza bağlamında, plastik olabilir. Bu plastisite yapısal bağıntılar dendritik dikenler ve presinaptik boutons 11-13 ve buna ek olarak ve / veya eleme düşünülmektedir. Sağlıklı bir sinir sisteminin bu rollerinin yanı sıra, aynı zamanda yeniden sinaptik sinir sistemi hastalığı / yaralanması 12,14,15 katılır. Örneğin, omurilik yaralanması sonrasında, kopmuş akson sonradan pişmanlık ve fonksiyonel iyileşme 16-19 ulaşmak için yeni sinaps oluşturmak gerekir. nt &quot;&gt; sinaptik plastisite önemli bir yönü olarak Yükselen fagositoz veya kaldırılması 3,5,20 için mukadder sinaps yutulma sürecidir. Biz son zamanlarda sağlıklı, doğum sonrası fare beyninde 7 sinaptik budama bağlamında bu olayı göstermiştir. Özellikle , mikrogliya, ikamet MSS bağışıklık hücreleri ve fagositler, bir zirve döneminde ve gelişimsel sinaptik budama, talamus doğum sonrası sırt yanal genikülat çekirdek (DLGN) bir bölgede presinaptik girdiler yutmak için gösterildi., bu yutulma genetik veya farmakolojik blokajı sinaptik bağlantı sürdürülebilir açıkları sonuçlandı. Bu protokol, biz presinaptik girişlerin phagocyte aracılı yutulmasına ölçmek için güvenilir ve yüksek kantitatif analiz tanımlamaktadırlar. Bu makalenin amaçları için, bu deney, retinada bulunan retinal ganglion hücreleri içeren gelişmekte retinogeniculate sistemi (RGCs) bağlamında sunulan olacakDLGN (Şekil 1A) presinaptik girdiler proje. Öncelikle, bir lizozomal bozulma dayanıklı ileriye etiketleme strateji DLGN RGC spesifik presinaptik giriş (Şekil 1) 7,21 görselleştirmek için kullanılan, tarif edilecektir. Bu açıklama, görüntüleme için detaylı bir yöntem izlenerek ve kantitatif olarak 3 boyutlu (3D) bir yüzey işleme hacmi ile kombine konfokal mikroskopi kullanılarak yutulmasına ölçüm verilecektir. Bu yöntem, sabit bir doku terkibi göre değil, aynı zamanda, canlı görüntüleme çalışmaları içinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Tahlil, sağlıklı, doğum sonrası retinogeniculate sistemi bağlamında doğrulandıktan ise Önemli olarak, başka bir beyin boyunca ve hastalığı sırasında fagosit-nöron etkileşimler, hem de diğer organ sistemlerinde fagosit fonksiyonunu değerlendirmek için aynı teknikler uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="533">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Vet Equip, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">965500&#160;</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:144px;">Warm water source for heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:168px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:144px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:159px;">DSC Optical</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:144px;">Sliding microtome with freezing stage</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:168px;">SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:168px;">14021607100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td style="width:159px;">Nikon</td>
			<td style="width:168px;">SMZ800 with Epi-fluorescence attachment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Spinning disk confocal microscope</td>
			<td style="width:159px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:168px;">UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">10 &#181;l Hamilton gas tight syringes</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">80030</td>
			<td style="width:144px;">Use a different syringe for each color dye/tracer</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Hamilton needles</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">7803-05, specifications: blunt, 1.5&#34;</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="54" rowspan="3" style="height:54px;width:131px;">Alexa-conjugated cholera toxin &#946; subunit (CTB)</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">488: C22841</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;">Reconstitute in sterile saline, 80 &#181;l (488), 100 &#181;l (594), 20 &#181;l (647)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">594: C22842</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">647: C34778</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Phosphate Buffered Saline&#160;(PBS)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:131px;">Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment)</td>
			<td style="width:131px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:116px;">24208-780-55</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">30.5 gauge needle</td>
			<td style="width:131px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:116px;">305106</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5630</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:116px;">23-400-125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="104" rowspan="2" style="height:104px;width:131px;">Paraformaldeyde (PFA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">15710</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use&#160; in a fume hood and wear personal protective equipment.</td>
		</tr>
		<tr height="83">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="138" rowspan="4" style="height:138px;width:131px;">Dissection tools &#8211; scissors, forceps, spatula</td>
			<td style="width:131px;">Small scissors: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">Small scissors:14370-22</td>
			<td rowspan="4" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Large scissors: Roboz</td>
			<td style="width:116px;">Large scissors: RS-6820</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">#55 forceps: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">#55 forceps: 11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Spatula: Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:116px;">Spatula: 13504</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:131px;">Sucrose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S8501-5KG</td>
			<td style="width:144px;">Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">25608-930</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Weigh boat</td>
			<td style="width:131px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:116px;">2347-1426</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">24-well plates</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:116px;">353047</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S6566-500G</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20.&#160; To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:131px;">Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48393 194</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Charged microscope slide</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48311-703</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Vectasheild</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:116px;">H-1200</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons

Fagositoz bir hücre kendi çevre hücre dışı ortamda malzeme (tüm hücre, bir hücre, kir, vb parçaları) yutar ve daha sonra genel olarak lızozomal bozulma ile, bu malzemenin sindirir edildiği bir süreçtir. Mikroglia fagositik işlevi, nörodejeneratif hastalık, sağlıklı beyin gelişimine (Alzheimer hastalığında, örneğin, beta-amiloid açıklık) (örneğin, sinaptik gelen geniş bir koşullar aralığı içinde tarif edilmiştir, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri budama) 1-6. Aşağıdaki protokol, gelişmekte olan fare retinogeniculate sisteminde 7 presinaptik girişlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirmek ve ölçmek için geliştirilmiş bir yutulma deneyidir. Bu deney, bu özel bağlamda mikroglia fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır iken, benzer bir yaklaşım, beyin (örneğin, astrositler) ve vücudun geri kalanı boyunca diğer fagositler değerlendirmek için kullanılabilirler(Örneğin, periferik makrofajlar) hem de sinaptik yeniden cereyan ettiği diğer bağlamlarda (örneğin, beyin hasarı / hastalığı).

Son zamanlarda biz, gelişmekte olan retinogeniculate sisteminde presinaptik girişlerin mikroglia aracılı yutulmasına (Şekil 1) 7 görselleştirmek ve ölçmek için bu yutulma deneyi kullanılmıştır. CX3CR1-EGFP heterozigot farelerin RGCs anterogradely sırasıyla, sol ve sağ gözlerinin içine CTB-594 ve CTB-647 ile takip edildi. Bu izleme takiben, DLGN içinde EGFP-pozitif mikrogliya görüntülendi. Bu görüntüler daha sonra hacim ölçümleri için yüzey render edildi. <p...

Watch this Scientific Journal Video about An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons at JoVE.com

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Mikroglia hücre dışı bir ortamda malzemenin fagosite veya yutmak için yüksek bir kapasitesi olan merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Burada, sinaptik bileşenlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirme ve ölçmek için, genel olarak, uygun ve güvenilir olup, kantitatif analiz tarif edilmektedir.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

an-engulfment-assay-protocol-to-assess-interactions-between-cns

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.1K Görüntüleme.  Boston Children's Hospital, Harvard Medical School.  Mikroglia hücre dışı bir ortamda malzemenin fagosite veya yutmak için yüksek bir kapasitesi olan merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Burada, sinaptik bileşenlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirme ve ölçmek için, genel olarak, uygun ve güvenilir olup, kantitatif analiz tarif edilmektedir. 

Video: An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Nörobilim

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Çizgili Deneyi Disosiye Hipokampal Nöronlar kullanarak Protein Substrat çekici veya itici Aktivite Eğitim için

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Sıçanlarda Akut İnme Sonrası Beyin İyileşmesini Değerlendiren Bir Preklinik Model

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...