Biz konfokal mikroskop erişim için teknik ve Dr. Fumi Ono s laboratuar ilk kurulum sırasında Michael Feyder ve Terrell Holloway, yardım için kabul etmek istiyorum. Bu araştırma, NIAAA ve NINDS intramural programı aracılığıyla Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından finanse edildi.

1. Hazırlanması DII / Tungsten Boncuk Bullets: DII (1 1&#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat) mermi beyin dilimleri kesme önceden hazırlanmış olmalıdır. Bu prosedür, çok sayıda mermi, bir kerede nasıl hazırlanır bağlı olarak yaklaşık 2-4 saat sürer. <ol><li> Eğer yeni bir parti tungsten boncuklar başlayarak, her biri 300 mg hacimde hazırlar. Alikot 2 ml metilen klorür 6 gram tungsten askıya tarafından hazırlanmıştır. Daha sonra, pipetle 100 ul mikrofuge&#39;de tüpler içine boncuk çözüm oda sıcaklığında saklayın alikotları 300 mg tungsten boncuk hacimde üretmek (Not: metilen klorid son derece hızlı bir şekilde buharlaşır Alkol de buharlaşmasını en aza indirmek kullanılabilir .). </li><li> Boncuk hacimde başlarken, metilen klorür 300 ul her kısım tekrar süspansiyon (300 mg tungsten boncuklar) ve buharlaşmasını önlemek için hızlı kapsayacak. Bu miktar, 3 mermi partiler için yeterli olacaktır. </li><li> Lipofilik boya DII 13.5 mg ağırlığında ve metilen klorid (son konsantrasyon = 3mg/100μl) 450 ul ekleyerek boya çözüm hazırlayın. </li><li> Kat boya ile boncuk. Bir parça cam slayt yerleştirin balmumu kaplı slayt üzerine boncuk, kağıt ve pipet 100 ul tartın. 100 ul DII çözüm boncuk hafif gri renge kadar pipet ve kuru hava ile iyice karıştırın. </li><li> Cam slayt kapalı boncuk kazıyın ve ince bir toz haline boncuk zar bir jilet kullanın (Not: birden fazla renk boyalar kontamine etmeyecek şekilde mermi yapıyor varsa, yeni bir bıçak kullanın) . </li><li> 15 ml konik bir tüp içine kağıt ve huni üzerine Pençe boncuk boncuk tartın. 3 ml su ekleyin ve oda sıcaklığında 10-30 dakika süreyle su banyosunda sonikasyon (Not: toz ve sonication dicing, bireysel nöronların seyrek etiketleme bozacak kaplı boncuklar kümeleri oluşumunu en aza indirmek için uygulanır) . </li></ol> 2. Kurşun boru (TEZFEL tüp), Polyvinylpyrrolidone (PVP) çözümü ile kaplayın boncuk eki artırmak için: Polyvinylpyrrolidone (PVP) çözümü ve tüp hazırlanması. <ol><li> 10 mg PVP / ml konsantrasyonda 10 ml su PVP çözüm hazırlayın. </li><li> Kurşun borular aracılığıyla PVP çözüm geçmek için, boru adaptörü ile 12 ml şırınga (biraz daha büyük bir çapa sahip esnek borular) kullanın ve daha sonra diğer ucunu dışarı kovmak. Yeniden, aynı anda birkaç toplu hazırlanan kat daha fazla kurşun boru çözüm. PVP çözümü kullandıktan sonra atın. </li><li> Kurşun boru boncuk eklemek için, girdap, homojen bir çözüm üretmek, boncuk eşit boru boyunca dağıtılan bu nedenle tüp aracılığıyla boncuk çözüm çekmek için şırınga kullanmak için boncuk. ((Not:) tüpün içinde hava kabarcıklarının sayısını en aza indirmek için deneyin). </li><li> Hazırlık istasyonu üzerinden boru Yem ve boncuk yerleşmek için izin. Sadece boncuk kalır, böylece suyu hafifçe kaldırmak için şırınga kullanın. </li><li> Spin hazırlık istasyonu ve kuru azot gazı boru su damlacıkları artık görünür olana kadar. Bu adım, yaklaşık 10-20 dakika sürer. </li><li> 13 mm uzunlukta ve Drierite veya susuz kalsiyum sülfat çeşit içeren sintilasyon şişeleri yer içine mermi tüp kesici ile kesin. Şişeleri ışıktan korumak için folyo ile sarın. </li></ol> 3. DII Boyama: Bu etiketleme tekniği, farklı türlerin beyin dokusunda nöronlar leke kullanılabilir; bu özel durumda, fare (3-6 ay) ve insan olmayan primatlardan (9-15 yaşında) . Dokusunun korunması, bu koşulda en iyi olması bekleniyor, çünkü dilim fiksatif çözüm transcardiac perfüzyon ile elde edilen sabit beyin dokusu hazır olduklarını tercih edilir. Ancak, perfüzyon fiksasyon her zaman mümkün değildir (maymun dokusu ile olduğu gibi) ve DiOLISTIC etiketleme hala başarılı bir doku hazırlanması için farklı prosedürler altında uygulanabilir. Burada doku hazırlanması için üç farklı prosedürler açıklanmaktadır: <ol class="lalpha"><li> Transcardiac perfüzyon beyin Fix → 10 dakika → kesilmiş dilim beyin → postfix kaldırmak → leke </li><li> Beyin → doku kesme blok → düzeltme blok → PBS → kesilmiş dilim yıkayın → leke çıkarın </li><li> Beyni Kaldır → kesilmiş dilim → düzeltme → → leke yıkayın </li></ol> Bu çalışmada, maymun beyinleri transcardially buz gibi yapay beyin omurilik beyin hasat öncesi sıvı (ACSF) kaudat içeren bir doku bloğu (4 mm kalınlığında) ile perfüze deneklerin elde edildind putamen oda sıcaklığında 60 dakika süreyle tespit edildi. Tüm prosedürler için, fiksatif çözüm,% 4 paraformaldehid ve% 4 PBS (taze olarak hazırlanır ya da 15 gün içinde kullanılmalıdır) sakaroz içerir. Fiksasyon kez başarılı boyama için kritik olduğunu not etmek önemlidir. Overfixation plazma membran bütünlüğünü bozan ve sonuçlarının altında daha fazla bilgi edinmek hücre dışına sızıntı boya neden boyama etkileyebilir. <ol><li> Prosedür için a ve b sabit beyin veya doku blok ve PBS ile 24 plaka yerleştirilir dilim, dilim (200μm) kesilir. C prosedürü için, taze akut beyin dilimleri (200 mm), soğuk kesme çözümü içeren bir vibratome (mM) 110 Kolin-Cl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl kesilir 2, 24-kuyucuğu 25 glikoz, 11.6 askorbik asit, 3.1 pirüvik asit (ozmolarite = 310 mOsmols) ve hemen dilimleri sonra yerleştirilir ve 30 dakika oda sıcaklığında fiksatif solüsyonu ile sabit. </li><li> PBS ile dilimleri, 3 kere yıkayın. </li><li> Çekim dilimleri önce PBS, kuyulardan kaldırmak ve bir fırça kullanarak, dilim iyi merkezine yerleştirmek. </li><li> DII mermi silah örnek ve varil sonunda 1,5 cm arasında bir mesafe koyarak 120-180 psi helyum gaz basıncı kullanarak bir Helios Gen Tabancası sistemi 3.0 mikron filtre kağıdı ile vur. (Önemli not: yıkar ve montaj sırasında yukarı bakacak şekilde dilim aynı tarafında tutmak için önemlidir bu yüzden bu şekilde, emin olun, bu yöntemle Sadece dilim yüzeyi 50 mm içinde nöronlar etiketli olacak bu konfokal bir mikroskop ile görüntüleme) etiketli nöronlar odak mesafesi içinde olacak. </li><li> PBS 3 kez dilim yıkayın ve DII dendritler yayılabilir izin vermek için birkaç saat için PBS içinde saklayın. </li><li> Altın Antifade uzatmak ile cam slayt üzerine dilim Dağı ve 18x18 mm No.1 lamel ile kaplayın. (Not: prosedürü c dilimleri bütünlüğünü de gecede korunmaz olarak aynı gün dilimleri monte etmek en iyisidir). </li><li> Seal yarığına sonra şeffaf tırnak cilası ile kuruduktan. </li><li> Alternatif olarak, dilim montaj aşağıda açıklandığı gibi önce antikorlar ile lekeli olabilir. (Not: 4 karanlık saklandığı takdirde, Slaytlar, bir yıl için en az 6 ay kullanılmalıdır ° C DII leke solmaya sebep olur, ışık, ışığa duyarlı ve uzun süreli maruz kalma). </li></ol> 4. Antikor Boyama: immün sonra adım 3.4 ve montaj önce yapılmalıdır. <ol><li> Permeabilization: 0.01% inkübe dilim oda sıcaklığında 15 dakika (ortalama 300-500 ul) PBS çözüm Triton X-100. NOT: Bu DII çözülür ve floresan boyama önemli ölçüde azaltacaktır yüksek konsantrasyonda deterjan kullanmayın . Geniş inkubasyon DII etiketleme azaltmak olarak deterjan süresini en aza indirmek için deneyin. Eğer uzun inkubasyon gerekli çözümü engelleme PBS dilimleri tutmak yerine. </li><li> Engelleme: inkübe dilimleri% 10 keçi serumu içeren çözüm engelleme,% 0.01 oda sıcaklığında 30 dakika süreyle PBS içinde Triton X-100. </li><li> Primer antikor: engelleme çözümü (örneğin 1:1000 dilüsyon tavşan anti-GFP antikor) istenilen seyreltme antikor ekleyin. Ortalama 300-500 ul ekleyin ve 1-2 saat boyunca inkübe edin. (Not: bir gecede inkubasyon gerekli olup olmadığını, çözüm engelleme deterjan kaldırın). </li><li> 5 için PBS ile dilimleri Yıkama - 15 dakika, 3 kez. </li><li> İkincil antikor: sekonder antikoru ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Engelleme çözümü istenilen seyreltme (örneğin 1:1000 dilüsyon Alexa Fluor 488 konjuge antikor) ikincil antikor çözüm hazırlayın. </li><li> 5-15 dakika, 4 kez dilim PBS ile yıkayın. </li><li> Mount slaytlara dilimleri Altın Antifade uzatmak ve 18x18 mm No.1 lamel ile kaplayın. Montaj medya sonra oje ile Seal kuruduktan. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <ol><li> Doğru etiketleme denetleniyor: Bölüm cıva lambası ve başarılı DiOLISTIC etiketleme onaylamak için kırmızı floresan filtre küp ile donatılmış bir floresan diseksiyon kapsamında görüntülenebilmekte. Şekil 1 örnek düşük büyütmede elde edilen güzel etiketli beyin bölümlerinin görüntüleri gösterir. Aramak için iki önemli özellikleri seyrek bir etiketleme deseni (Şekil 1A) ve bireysel hücresel bileşenleri (Şekil 1B-C) tanımlamak için yeteneği. </li&gt; <li> Sorun Giderme DiOLISTIC etiketleme: Şekil 2 DiOLISTIC etiketleme yanlış çalıştığı bölümleri örnekleri gösterir. Deneyimlerimize göre, verimsiz etiketlenmesi için üç ana nedeni vardır: <ul><li> Etiketleme çok seyrek veya yoğun: Çok az hücreleri bir durumda bölüm başına etiketli ya da çok fazla hücre, tek hücre elemanlarının izolasyonu ve çalışma önlenmesi etiketlenir . Çözüm: Tefzel kurşun borular (bölüm 1.6) için kullanılan kaplama nihai çözüm kaplı boncuklar konsantrasyon ayarlayın. Azaltın veya sırasıyla, çok seyrek ya da çok yoğun etiketleme düzeltmek için boncuk çözmek için kullanılan su (3 ml başlangıç ​​değeri) hacmini artırmak. Buna ek olarak, düşük verimlilik, etiketleme bölümleri üzerine kaplı boncuklar çekim yaparken optimum gaz basıncı daha az neden olabilir. Bu olasılık Tefzel kurşun boru kaplı boncuklar en yayımladı ve bu çekimden sonra açık göründüğünü emin yaparak ekarte edilebilir. Aksi takdirde, çekim için gaz basıncı artmış olmalıdır. </li><li> Kötü mermi mermi hazırlanması sırasında büyük öbekler veya boya kaplı tungsten boncuklar kümeleri oluşur. Bölüm Şekil 2A-B örnekler benziyor. Çözüm: bölüm 1.5 ve / veya özel dikkat yeni mermi yapmak veya bölüm 1.6 &#39;da sonication süresini uzatmak. </li><li> Aşırı fiksasyon: doku paraformaldehid çözüm sabitleme (200-300 mikron bölümler için 30 dakika, 4 mm bölümler için 1 saat) için optimal gerekli süreden daha uzun süre tutulur. Bu plazma membran bütünlüğünü tehlikeye atmakta ve etiketleme odak hücrelerinin boya dağılımı nedeniyle göründüğü Şekil 2C-D gösterilenlerden benzeyen etiketli bölümleri üretir. Çözüm: fiksasyon süresini azaltmak. </li></ul></li><li> Konfokal görüntüleme: Resim yığınları dendrit segmentleri için tüm hücre ve 63x suya daldırma hedefi için 20x objektif ile bir konfokal mikroskobu (Zeiss LSM 510 META) kullanılarak elde edilir. DII ikincil antikor DPS 561 nm lazer hattı ve yeşil floresan kullanarak 488 nm lazer hattı kullanarak heyecanlı heyecanlı oldu. Etiketli örnek konfokal mikroskobi kullanılarak elde edilen optik kesit daha örnek tek işaretli hücrelerin izolasyonu sağlar. Şekil 3A, farenin beyin ve karmaşık dendrit şube desen bir striatal orta dikenli bir nöron gösterir. Kemirgen (Şekil 3B) ve insan dışı primat (Şekil 3C) bu nöronların dendrit dalları Yüksek büyütme görüntüleri, her iki türde de bu tekniği kullanarak dendritler ve dendritik dikenler boyanma derecesi göstermektedir. Uzun, ince bir omurga orta dikenli bir nöron bu kadar bol kafaları dikkate bile Dendritler ve çıkıntılar (dikenleri), tanımlanmış görünür. DiOLISTICS immün ile birleştirirken, aynı odak düzlemi ve aynı hücrede su götürmez bir leke lokalize konfokal görüntüleme de yardımcı olur. Şekil 4 DII etiketleme ve tek kişilik bir hücrede GFP için immün ko bir örnek gösterir. Görüntü D1 dopamin reseptör organizatörü altında floresan protein, GFP ifade eden bir transgenik fare bir striatal dilim elde edilen bir yığın (0.7 mikron z-bölüm). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Insan olmayan primatlardan beyin dilimleri nöron DII etiketleme. (A) Düşük büyütme görüntü DII ile nöronların seyrek etiketleme gösteren bir Sinomolgus maymun kaudat nükleus içeren bir lekeli beyin dilim (BC) İzole orta dikenli bir nöron bir floresan diseksiyon kapsamı kullanarak kolayca tespit edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Sorun Giderme DiOLISTIC etiketleme. (AB), dorsal maymun striatum (A) ve fare Vitray dilimleri (B), boya kaplı boncuklar büyük öbekler gösteren ve bunun sonucu olarak, hiçbir bireysel olarak hücresel elementler ayırt edilebilir (CD) Görüntüler DiOLISTIC uygulanması sonucu örneklemek zaman ya da nerede dokusunun korunması, uzun süreler için sabitleştirici çözüm tutuldu bölümlerine etiketleme maymun (C) ve fare (D) doku başarısız oldu. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 DII ile boyandı striatal orta dikenli bir nöron Konfokal görüntü. (A), tüm hücre Resim yığını (BC) Dendrite segmentleri fareden. Dendritik dalların morfolojik analizi için (B) ve maymun (C) orta dikenli bir nöron dendrit ve dikenler net etiketleme göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Immün DiOLISTIC etiketleme birleştiren. (A) DII etiketli <sLee ve ark uyarlanmış yöntemler tarafından açıklandığı gibi anti-GFP antikor kullanarak Trong&gt; D1 dopamin reseptör organizatörü altında BAC transgenik fare ifade GFP striatum orta dikenli bir nöron (B) immün. (2006). Kırmızı ve yeşil floresan A. (C) Bileşik görüntü olarak aynı alanda DII-etiketli nöron GFP pozitif bir nöron olarak tanımlar.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

Bütün hayvan prosedürleri NIAAA ve Oregon Ulusal primat Araştırma Merkezi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi rehberlik takip yapıldı. Yazarlar ifşa etmek için bir şey var.

Yaştan geniş bir yelpazede, farklı türlerin doku kesitlerinde uygulanan ve doku taze veya fiksatif-perfüze hayvanlar elde edilebilir, çünkü DiOLISTIC etiketleme (aynı zamanda Gan ve ark floresan etiketleme hücreler için kullanılabilir çok yönlü teknikleri biridir , 2009). Bu süreç 1-2 gün alır gibi nispeten hızlı ve immün (Lee ve ark, 2006) gibi diğer klasik etiketleme yaklaşımları ile kombine edilebilir. Bu lipofilik membran bütünlüğünü oluşturan ve boya hücreleri dışarı sızmasına neden çünkü sabitleme ve yüksek deterjan konsantrasyonlarının inkübasyon çözümler kullanımı üzerinde özel bir dikkat önlemek için dikkat edilmelidir. Antikor penetrasyonu düşük konsantrasyonlarda kolaylaştırılabilir Triton X-100 inkübasyon çözüm (Lee ve ark, 2006) yanı sıra digitonin veya saponin (Matsubayashi ve ark, 2008). Bu teknikte uygulanan bazı değişiklikler Gan ve ark (2000) veya değişen uzunluğu ve tipi antikor maruz kalma (Neely ve ark, 2009) tarafından açıklandığı gibi birden fazla boya ile mermi kullanımını içerir . Geleneksel olarak, DII beyindeki nöronal projeksiyonları takip etmek için kullanılır olmuştur. DiOLISTIC etiketleme hücre morfolojisi incelemek için yararlı bir yöntem açıklayan uygulama genişletir. Nöronal morfolojisi, büyük ilgi nedeniyle, beyin ve hücre şekli, sinir sisteminde nöronal popülasyonlarının fonksiyonu çokluğu yansıtıyor olabilir spekülasyon içinde bulunan büyük bir çeşitlilik. Bunun bir örneği, birçok memeli sinir sistemi ekran küçük çıkıntı nöronların dendritik dikenler glutamaterjik sinaps site adını verdiği bir gerçektir. Bu şekilde, bir hücre üzerine glutamaterjik sinaps yoğunluğu dendritik dikenler yoğunluğu, burada açıklanan etiketleme tekniği kullanılarak ölçülebilir korelasyon olabilir. Ayrıca, dendrit toplam uzunluğu, dallanma deseni, dendritik omurga şekli ve yoğunluğu gibi diğer morfolojik parametreler sayısal ve incelenmelidir. Nöronal morfoloji eğitim için floresan etiketleme kullanımı, daha yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için izin verdiğinden, parlak bir alan mikroskobu (örneğin Golgi boyama) güveniyor daha geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında pek çok avantajı vardır. Morfolojisi DII dendritik omurga yoğunluk ölçüm yönelik deneylerde fluorofor olarak kullanarak ve bir başka avantajı lipofilik özellikleri. DII plazma zarı içine bölümleri ve nöronal süreçleri ve dendritik çıkıntılar iyi tanımlanmış bir anahat sağlar. Dendritik dikenler (1 femtoliter az) küçük hacim göz önüne alındığında, membran boyanması daha verimli ve daha küçük, ince çıkıntılar sitoplazmik boyanma daha iyi bir görünüm için izin verir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

DiOLISTIC boyama, beyin dilimleri (O&#39;Brien ve Lummis, 2007; Gan ve ark, 2000. Gan ve ark, 2009) nöron içine DII olarak floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanır. Burada tekniği kurarken yardımcı olacak iyi ve kötü sonuçları örnek görüntüleri ile birlikte gerekli her adımı ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Deneyimlerimize göre, bir kaç adım DiOLISTICS başarılı bir uygulama için önemli rol oynadı. Bu değerlendirmeler DII kaplı mermi kalitesi, fiksatif maruz kalma ölçüde ve inkübasyon çözümlerinde kullanılan deterjan konsantrasyonu içerir. Sık karşılaşılan sorunlar için ipuçları ve çözümler verilmektedir. Bu çok yönlü bir etiketleme tekniği yaştan geniş bir yelpazede çok sayıda hayvan türleri için uygulanabilir. Floresan transgen ifadesi güveniyor çünkü genç hayvanlarda hazırlıklarına sınırlı veya farelere sınırlıdır diğer floresan etiketleme teknikleri aksine, DiOLISTIC etiketleme, her yaştan, her tür ve genotipler hayvanlar uygulanan ve birlikte kullanılabilir belirli bir hücre ICSI&#39;nin tanımlamak için immün. Burada beyin dilimleri etiket nöronların dendrit dallanma ve dendritik omurga morfolojisi miktarının belirlenmesi amacı ile yetişkin farelerin ve yetişkin insan olmayan primatlardan DiOLISTICS kullanımı göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices at JoVE.com

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik, (Gan<em&gt; Ve ark.</emDüşük konsantrasyonda deterjan tutulur&gt;, 2000), dendritik dallanma ve dendritik omurga morfolojisi çalışma için uygundur ve geleneksel immün ile kombine edilebilir.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K Görüntüleme.  NIH. Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik, (Gan Ve ark., 2000), dendritik dallanma ve dendritik omurga morfoloj...

Video: DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Nörobilim

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...