Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the M&#252;ller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Sinir Hücre Hasat <ol><li> Mikroskopla Değerlendirme: <ol><li> Bir deney başlamadan önce, parlak alan veya faz kontrast mikroskobu ile kültür durumunu kontrol edin. NOT: disseksiyonlar elde edilen primer sinir dokusu iken, ilke olarak, eşit mükellef sitometri analizi 14,28 akış, protokolün odak in vitro nöral hücre sistemleri elde edilen hücreler üzerinde olduğuna dikkat edin. </li></ol></li><li> Hücrelerin Toplanması 7: <ol><li> Yavaşça Mg + 2 ile yapışık hücre çanak / şişe, yıkama / Ca2 + serbest fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), oda sıcaklığında (örneğin, T75 şişesinin 5 mi, 6-çukurlu plaka için oyuk başına 3 ml veya 10 mi için 10 cm çanak). NOT: PBS protokol boyunca kullanılan Mg 2+ / Ca 2+ ücretsizdir. <ol><li> Video Örneğin,% 80 birbirine karıştığında, SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin bir T75 şişesinin kullanımı. Durumlarda nerede ek yıkama adımları uygulayınönemli ölçüde çöp kabı içinde mevcuttur. </li><li> Serum albümini içeren PBS 48, Percoll, ya da Ficoll 49 santrifüj gradyanlar ve / veya ticari olarak temin edilebilen boncuklar 50,51 ile yıkama düşünün. Miyelin ve diğer lipid ya da diğer kirletici maddelerin çıkarılması yetişkin birincil doku kaynakları kullanılıyorsa, özellikle önemlidir. </li></ol></li><li> Doku kültürü kabının tüm yüzeyini kaplar, uygun bir hacminde önceden ısıtılmış (37 ° C), tripsin değiştirme ekleyin. NOT: Alternatif, Accutase veya diğer enzimatik sindirim seçenekleri göz önünde bulundurun. Bu kritik adım olumsuz (7 bakınız) yüzey epitop ifadesini etkileyebilir. </li><li> Hücreleri ayırmak için izin vermek için (hücre tipine göre), 5 dakika - 2 37 ° C &#39;de çanak / şişeyi inkübe edin. Yavaşça hücreleri çıkarmak için bir serolojik pipet ile doku kültürü gemi veya gömme dokunun. (Bu gibi daha sonraki aşamada hücre kaybı ve pıhtılaşmayı neden olabilir) sindirim üzerinde kaçının. </li><li> Siki kez akış tamponu (PBS içinde% 2 FBS) hacminin eklenmesiyle tripsin değiştirme uench ve 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere - (1.000 ul, 100) ya da bir 5 mi serolojik pipet yavaşça mikrolitre pipet kullanılarak bir hücre süspansiyonu çiğnemek. </li><li> 25 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 220 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Dikkatle geride bırakarak pelet süpernatant aspire. </li><li> Yeniden askıya pellet (boyutuna bağlı olarak, akış tamponu uygun hacimde bir pelet gibi, SH-SY5Y hücrelerinin bir T75 şişesinin birleşik için tipik bir verim, en az 10 x 10 6 hücre, bu durumda hücreler içinde Akış tamponu, 5 ml) içinde tekrar süspanse edilir. NOT: Daha büyük parçalar veya pıhtılaşma gözlenmesi halinde, 30 ile filtre - 100 mikron örgü. </li></ol></li><li> Hücre sayımı 52: <ol><li> Tr hacminde belli bir oranda bir mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu küçük bir kısım aktarın ve seyreltikypan mavi veya bir hemositometrede transfer veya otomatik hücre sayım sistemi önce alternatif bir canlılığı boya. </li><li> (CFSE etiketi ile devam ise)% 0.1 BSA ile akış tamponu veya PBS uygun hacimde eklenmesiyle, 1 x 10 6 yaşar hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda hücre süspansiyonu seyreltin. NOT: Propidyum iyodür, 7-aminoactinomycin D, anneksin V ve piyasada mevcut düzeltilebilir canlılığı tahlil kitleri hücrelerin canlılığını değerlendirmek için alternatif seçenekler temsil eder. Daha önce 53 kullanılabilir tarif edildiği gibi aynı zamanda, apoptoz deneyleri kaspaz-3 floresans kullanılmıştır. Floresan kanallar tüm örneklerin dahil halinde sonraki adımlar için seçenekleri sınırlayabilir Bu reaktiflerin tarafından &quot;işgal&quot; olacak. </li></ol></li></ol> CFSE kullanma 2. Hücre içi Boya Etiketleme (Şekil 3) <ol><li> Kolayca kullanılabilen bir arzu stok konsantrasyonu CFSE seyreltin. NOT: Bu deneylerin bir stok konsantrasyonu için0.01 mM kullanılmıştır. Ampirik KAKE optimal çalışma konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> 0,1 uM değerinde bir nihai konsantrasyona hücrelerin ml başına 0.01 mM CFSE çözeltisi (Bölüm 1.3.2, PBS +% 0.1 BSA içinde, 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda), 10 ul ekle. Kısaca girdap iyice karıştırın. Not: Burada kullanılan CFSE konsantrasyonları boyanın toksikliği hücre dolayısıyla, genel olarak çoğalma deneylerinde uygulanabilir göre daha düşük bir on-kat azdır. Biz hücre canlılığı üzerindeki olumsuz etkilerini gözlemlemek yok. </li><li> Sabit şekilde çalkalanarak (200 rpm) oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Işıktan koruyunuz. </li><li> Tüplere akış tamponu 5 hacmi eklenerek boya söndürüldü. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 94 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Geride bırakarak pelet süpernatant atın. Akış tamponu, 5 hacim ile hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 94 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 x 10 6 hücre konsantrasyonunda akış tamponu içerisinde hücrelerin yeniden askıya /<html> mi. </li><li> Lekeli hücre süspansiyonu ilgi boyanmamış hücrelerin eşit sayıda ekleyin. Antijen boyama protokolü (Bölüm 3) yüzey geçin. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> CFSE, boya etiketleme. SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri ile iki hücre hatları arasında farklı CD ​​yüzey antijeni ifade Şekil 3. Algılama önceden etiketlenmiş olan etiketlenmemiş BJ fibroblastlar ile karşılaştırıldığında daha sonra tespit edilebilmesi için CFSE ile. (; Ok uçları = BJ fibroblastlar ok = SH-SY5Y) yüzey işaretleyicileri CD24 ya da CD54 (her ikisi de APC birleşik) ile karıştırılmış numunenin (sağ panel) eş zamanlı boyama hücre çizgileri bağlı CFSE boyama kolaylıkla ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. SH-SY5Y hücrelerinin çoğunluğu CD24 fakat CD54 (ICAM-1) ifade etmektedir. Buna karşılık, BJ fibroblastlar (negatif KAKE) CD54 pozitif ama CD24 için büyük ölçüde olumsuzdur.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. 3. Hücre Yüzey Boyama <ol><li> Numunelerin ve kritik kontroller (Tablo 1) olmak üzere Etiket tüpler. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tüp hayır. </td><td> Örnek adı </td><td> Antijen-florofor </td><td> Seyreltme </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Lekesiz hücreler </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Tek lekeli </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Tek lekeli </td><td> Tuj1-Alexa fluor 488nm </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Lekeli Çift </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Tuj1-Alexa fluor 488nm </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Tek lekeli</td><td> İkincil Sadece: Alexa fluor 488nm </td><td> 1: 2000 </td></tr></tbody></table> Tüplerin Tablo 1. L ist deney sitometrisi tipik akış dahil edilecek. Tablo, bu video makalede tarif edilen bir ko-lekeleme deneyi için gerekli örnek tüplerinin en az bir setini göstermektedir. İdeal deney elde edilen sonuçların doğru yorumlanması için gerekli tüm kontrolleri (negatif, pozitif yanı sıra tazminat kontrolleri) içermesi gerekir. <ol start="2"><li> Her bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (Bölüm 2.7 veya 1.3.2 itibaren) hücre süspansiyonu 100 ul ekle. NOT: Emin 0,1 x 10 6 hücre minimum hücre süspansiyonu 100 ul başına mevcut olduğundan emin olun. </li><li> Uygun seyreltmede örnek flüorofor konjuge antikor ekleyin. NOT: deney öncesinde her antikor için seyreltme çalışma belirleyin. Bir liste için o Tablo 2 bakınızf sinir yüzey antijenleri. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antijen </td><td> Hücre Tipi </td><td> Referans </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Nöronal hücre </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> Glial hücreler </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Nöronal hücre </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Nöral kök hücreler ve glial hücreler </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Nöronal hücre </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Nöral krest kök hücreleri </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Glial hücreler </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> Dopaminerjik öncüleri </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Nöral kök hücreler (MGK) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> Glial hücreler </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Glial hücreler </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Sinir yüzey antijenlerinin Tablo 2. seçilmesi. Bu tabloda, sinir soyu karakterize etmek için kullanılan yüzey antijenleri artan paneli örnek için çeşitli sinir hücresi tipleri tarafından eksprese edildiği yüzey epitoplarının bir listesini sağlar. Bu seçim tam ve bu belirteçlerin çoğu diğer nöral ve nöral olmayan hücrelerin bir dizi ifade olduğunu olmaktan uzak olduğunu unutmayın. Sonuç olarak, çok sayıda markalama kombinasyonları için daha iyi tanımlaması ve belirtilen sinir alt kümeleri izole etmek için gerekli olacaktır. <ol stsanat = &quot;4&quot;&gt; <li> Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (200 rpm) üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Akış tampon yıkama <ol><li> Tüplere akış tamponu 1 ml ilave edilir. 4 ° C de 4 dakika boyunca 380 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Geride bırakarak pelet süpernatant atın. </li></ol></li><li> Tekrar yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, süpernatant süzün ve 100 ul son hacim olması için akış tamponu içerisinde hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Akım sitometri analizi için numune kullanın. Alternatif olarak, Bölüm 4 ve 5 ile devam edin. NOT: Hücreler sıralanır ve kültür sonrası FACS içine geri koymak için ise (yani, fiksasyon veya permeabilization olmadan canlı hücre süspansiyonu), hasat, boyama ve analitik adımlar sırasında aseptik teknikleri uygulamak. </li></ol> 4. Sabitleme ve Permeabilization 38 <ol><li> Sabitleme kullanarak paraformaldehid (PFA): <ol><li> PBS içinde% 2 PFA içeren sabitleme tamponu hazırlayın. <br/&gt; Not: PFA insanlar ve çevre için zararlıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve yerel yönetmeliklere uygun olarak atık atın. </li><li> Hücre süspansiyonunun 100 ul sabitleme tampon 500 ul ekle. </li><li> Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (100 rpm) üzerinde 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> PBS yıkama: <ol><li> Tüpüne PBS içinde 1 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 380 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tüp yaklaşık 100 ul bırakarak süpernatant süzün / atın. </li></ol></li><li> Tween-20 ile geçirgenleştirme: <ol><li> PBS içinde% 0.7 Tween-20 içeren permeabilizasyon tampon hazırlayın. </li><li> Hücre süspansiyonunun 100 ul permeabilizasyon tampon maddesi içinde 500 ul ekle. </li><li> Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (100 rpm) üzerinde 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> (Bölüm 4.2 de tarif edildiği gibi), bir kez PBS ile hücre yıkayın ve tüpler co süpernatanmpletely, geride sadece topak bırakılmıştır. </li></ol> 5. Hücre içi Antijen Boyama 38 (Şekil 4) <ol><li> Birincil antikor çözeltileri hazırlanması: <ol><li> % 1 sığır serum albümin,% 10 serum (örneğin, normal eşek veya keçi serumu) ve% 0.5 Tween-20 ile PBS içinde ihtiva eden seyreltme tamponu içinde primer antikorlar ile seyreltilir. NOT: İkincil antikorlar büyütüldüğü türe bağlı kullanılmak üzere serum seçin. </li><li> Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak primer antikorun Zenon floresan etiketleme kullanın. <ol><li> Uygun bir seyreltme (20 ul ≤ toplam hacim) PBS içinde birincil antikor 1 ug hazırlayın. </li><li> Antikor çözeltisi Zenon floresan IgG etiketleme reaktifi (Bileşen A) 5 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> Reaksiyon karışımına Zenon bloke belirteci (Bileşen B), 5 ul ekle. </li><li> Kuluçkaya yatmakOda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir karışımı. 30 dakika içinde örnek antikor uygulayın. </li></ol></li></ol></li><li> Birincil antikor boyama: <ol><li> Hücre pelet birincil antikor solüsyonu, 100 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın çiğnemek. </li><li> Seçenek olarak ise, uygun seyreltme hücre süspansiyonu Zenon fluoresein etiketli antikor ekleyin. </li><li> Işıksız bir orbital bir karıştırıcı (200 rpm) ile 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. (Bölüm 4.2 açıklar gibi) PBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve arkasında sadece pelet bırakarak, tamamen tüplerin süpernatant kaldırmak. </li></ol></li><li> (Zenon fosforla etiketlenmiş antikorlar için gerekli değildir) sekonder antikor boyama: <ol><li> Uygun bir konsantrasyonda PBS içinde sekonder antikor ile seyreltilir. </li><li> Hücre pelet sekonder antikor çözeltisi 100 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın çiğnemek. Karanlıkta bir çalkalama (200 rpm) ile 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> (Bölüm 4.2 açıklandığı gibi) PBS ile numuneleri iki kez yıkayın. </li><li> Akış tamponu ile bir kez yıkayın (Bölüm 3.5). </li><li> Akış tampon yaklaşık 150 ul hücreleri yeniden askıya ve akış sitometresinde analiz. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Yüzeyi ve hücre içi proteinlerin Şekil 4. Eş-boyama. Veri Flow sitometri ikincil + primer yüzey boyama ile birlikte Zenon floresein-tabanlı hücre içi boyama karşı antikor bazlı arasında bir karşılaştırma örneğidir. Y-ekseni (sol üst kadran) ve x-ekseni (sağ alt kadranda) üzerinde özel pozitifliği sırasıyla map2 ve CD24, lekeli hücreleri gösterir. Ko-boyama işleminden sonra ortak MAP2 ve CD24 ifadesi, üst sağ çeyrek dairesi (sağ panel) &#39;de görülebilir. Ile karşılaştırılmasıAlexa fluor 488.; MAP2-etiketleme verimleri benzer sonuçlar için Zenon floresein (alt) karşı (üst AF488) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 6. Akış Sitometrik Analizi <ol><li> Sinyal tespiti için uygun filtreler ile akış sitometresiyle boyama protokolü tamamlanmasından hemen sonra akış sitometrik analiz yapıldı. FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), ve FL-4 (675/25) bant geçiren filtreler ile 488 nm mavi ve 640 nm kırmızı lazer kullanın. </li><li> Enkaz ve ölü hücreleri hariç ileri ve yan dağılım dayalı birincil kapıları ayarlayın. </li><li> Yüzey ve tek lekeli kontrolleri kullanarak spektral örtüşme için boyanmamış örnekleri ve tazminat dayalı ≤0.5% intraselüler antijen için ayarlayın floresan kapıları. </li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest.

Burada sunulan protokol, insan kök hücrelerinden elde edilen nöral hücre kültürleri için oluşturulmuş, ancak aynı derecede birincil doku ya da nöral hücre hatları dahil olmak üzere, diğer nöral hücre kaynaklarına uygulanabilir. Embriyonik kaynaklardan ek olarak, nöral kök veya progenitor hücreler yetişkin beyin 27 nörojenik bölgelerinden elde edilebilir. Ayrıca, akım sitometri ve FACS olgun nöronlar 54, astroglial 33, mikrogliyal 55, oligodendrositle...

Akım sitometri yoğun içsel dağılım özellikleri, hücre yüzey antijeni ifade ve diğer floresan parametreleri 1-3 vasıtasıyla hücre popülasyonlarının tanımlamak için immünoloji, hematoloji ve onkoloji istismar edilmiştir. Kan soy geliştirme ve hastalık halinde bizim anlayışlar ilk uygulama 4,5&#39;ten sonra bu metodolojinin sürekli arıtma önemli ölçüde bir sonucudur. Akış nicel ve genel analitik potansiyeli artan farkındalık sitometri son zamanlarda kök hücre araştırmalarında da daha yaygın kullanımını teşvik etmiştir ve kısa bir zaman dilimi 6 benzer derin ilerleme sağlayabilir. Ancak, özellikle nöral popülasyonları analiz ve izole etmek için akış sitometri uygulaması uzun zorlu olarak algılanmıştır. Doğal olarak süspansiyonda mevcut hematopoietik hücrelerin aksine, sinir hücresi tipleri, tipik olarak glia ve çeşitli o içerebilir aşırı derecede karmaşık kaynaklardan toplanırTher çevreleyen hücreleri ve aynı zamanda işlem taşıyan nöronların karmaşık bir ağdır. Sonuç olarak, nörobiyoloji günlük araştırma rutinleri onun tam potansiyeline flow sitometri çok yönlülüğünü uygulamak için henüz. Ancak nörobiyolojisinde analitik repertuarın değerli unsuru olarak kabul edilebilir olduğu sürece uygun bir tek hücre süspansiyonu elde edilebilir (ve protokoller bu amaçla 7 için tasarlanmış ve optimize edilmiş) halinde, akış sitometrisi ve floresans ile aktive edilen hücre çeşitleme (FACS) 8-11. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Fluidik, optik ve elektronik: akım sitometri analizi ve bir akış sitometresinde bileşenlerinin Şekil 1. İlke akış sitometrelerinde üç ana sistemleri içermektedir. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin bir akıcı akış kılıf flui ile gerçekleştirilir (birincil doku ya da in vitro kültürü hazırlanmış)hidrodinamik yoluyla d merkez çekirdek örneği kısıtlayan, odaklama. Optik parçalar uygun dedektör sinyal doğrudan hücrelere ve optik filtrelerin akışı aydınlatmak lazerler oluşmaktadır. elektronik sinyaller, daha sonra bir bilgisayar tarafından işlenir ve veri analizi ve yolluk için bir monitörde görüntülenebilir dönüştürülür tespit ışık sinyalleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bir sitometresinin yapı blokları dahil altta yatan temelleri en azından temel bir anlayış akış sitometri yöntemleri kar Kullanıcılar (inceleme için 12,13 görüyorum; ayrıca bakınız Şekil 1). Bir lazer ışını da &#39;tek dosya&#39; birbiri ardına lazer ışınının geçmesine süspansiyon hücreleri içeren bir hidrodinamik odaklı akışkan akışı ile kesişir. interceptiBu sorgulama alanına ışık saçılması lazer sonuçları ile hücre (veya bu konuda herhangi bir diğer parçacık, sırasıyla) ile. (Parçacık / hücre granulosity yansıtan tarafında dağılım) Dağınık ışık, hem de dik olan doğrultu (parçacık boyutu ile ilişkili ileri dağılım, hem) lazer yönünde devamında tespit edilebilir. Bu Anılan dağılım özellikleri (aynı zamanda veya hücresel enkaz, hava kabarcıkları, vb) bir etiketsiz örnek yaygın ilk yolluk için kullanılan yan dağılım grafiği iki değişkenli ileri saçılma bir sinyal (olay) üretecektir neden özel etiketleme, gerekmez. Uygun lazerler ve karşılık gelen uyarma ve emisyon spektrumu için özel filtreler kullanılarak, bir hücrenin pozitiflik, yoğunluk seviyesinde veya flüoresan işaretler yokluğu için analiz edilebilir. Akış sitometrik uygulamalarının çoğunluğu hücre yüzey antijenleri üzerinden karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır. Hematopoietik lineag aksineE, sinir soy yüzey epitop ifade desenleri 5&#39;e göre daha az kapsamlı tanımlanmış kalmıştır. Yüzey antijenleri istismar bir avantajı, canlı hücreler, FACS gibi sıralama paradigmalar hücre tabi olmasıdır. Buna karşılık, hücre içi antijen boyama canlı hücreler gerektiren mansap uygulamaları engelleyen, epitop-antikor etkileşimi aracılık tespit ve permeabilization adımları gerektirir. Dikkat çekici bir şekilde, bu tür yaklaşımlar yine çok nicel deneyleri 14 yanı sıra, RNA ve protein ekspresyonu 15 alt baş analizler için izin verir. Hematoloji, immünoloji ve onkoloji genellikle belirli alt popülasyonlar 16 tanımlamak için birlikte bir düzineden fazla belirteçleri kullandık. Ayrıca, kitle sitometri veya CyTOF geç 30 parametreleri aynı anda 17,18 kadar analiz etmek için kullanılabilir. Nöral kök hücre uygulamaları yanı sıra birincil kültürlerin 14,19,20 hücrelerin heterojen olarak içinIn vitro ortak bir olgudur 21-23 olduğunu. ilgi hedef kitleyi temsil etmeyen hücreler deneysel okuma 24,25 için bir potansiyel karıştırıcı faktör somutlaştırmak. Uygun, heterojen bir hücre süspansiyonu içinde bulunan farklı hücresel alt kümeleri bu çeşitli popülasyonları tanımlamak için kullanılabilir farklı (bilinen veya henüz deşifre edilecek) antijen ifade profilleri, ayı. Biyomedikal uygulamaları kolaylaştırmak, dolayısıyla böylece, hücresel heterojenite çözümünde önemli bir rol oynayabilir ve Flow sitometri (in vitro deneyler, hücre tedavisi) ve en alakalı alt kümesi 24,26 odaklanarak kantitatif okuma optimize. Çeşitli yüzey antijen kombinasyonları özel nöral hücre tiplerinin kantitatif ve izole izin vermek için son birkaç yıl içinde tespit edilmiştir. Bu nöral kök hücreler 27 NSC izolasyonu için CD15 / CD24 / CD29 yüzey antijenlerinin kombinasyonu, differentia zenginleştirilmesi için CD133 içerirTed nöron ve nöral krest hücreleri 28 veya CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271, diğer imzalar 29,30 arasında nöral ve glial alt kümeleri 25, izole etmek. Nöronlar ötesinde, gliyal belirteçler A2B5 31, CD44, 25 NG2 32 ve GLAST 33 içerir. Son zamanlarda yayın Parkinson hücre nakli dopaminerjik öncüleri zenginleştirmek için orta beyin tabanının habercisi işaretleyici CORIN 34,35 36 paradigmalar istismar etmiştir. CD molekülleri sadece belirteçler değil, hücre-hücre etkileşimleri ve hücrenin yeteneği fonksiyonel ilgili arabulucular dışı matriks molekülleri ipuçlarını cevap ve büyüme faktörleri 37. Ayrıca sinir soy gelişimini karakterize etmek için kombinasyon CD antijenlerinin cephanelik arttırıcı bir strateji, söz konusu özel bir hücre tipi için bir CD antijeni kombinasyonu için taranması ve tanımlamak için bilinen hücre içi belirteçler kullanmaktır. Biz son zamanlarda böyle bir yaklaşım sömürülen ve CD4 belirledik9f - / CD200 nöral ayırt uyarılmış pluripotent kök hücre kültürü sistemleri 38 nöronal alt kümelerini zenginleştirmek için yeni bir yaklaşım olarak yüksek birleştirici ifade desenleri. Burada, içerir ve ikinci protokolü (ve bunların isteğe bağlı varyasyonlar) &#39;in yüzey boyama ve hücre içi boyama akış sitometrisi ile nöral hücre alt-popülasyonunu tanımlamak için aynı anda kullanılabilir tartışır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Deneysel protokol seçenekleri Şekil 2. akış diyagramı. Şekil protokolde yer alan önemli adımlardan şematik bir temsilini tasvir etmektedir. İsteğe bağlı adımlar (KAKE boya veya hücre içi antijen etiketleme) açık gri kutular ile gösterilir. Hasattan sonra, bu hücre yüzey boyamadan önce nöral hücre süspansiyonlarının yaşayabilirliği ve hücre sayısını belirlemek için gereklidir. Pozitif olarakde negatif kontroller olarak ilgi örneklere ek olarak dahil edilmesi gerekir. Numuneler akım sitometri ile analiz ve / veya hücre sıralama paradigmalar kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Daha önce hücre içi boyama 38 için ikincil bir antikor ile kombinasyon halinde birincil antikor kullanmış iken, şimdi, böylece hücre manipülasyonu 39 aşamaları azaltarak küçük bir değişikliği gibi floresan Fab parçaları (Zenon etiketleme) yoluyla birincil antikor kovalent olmayan etiketleme getirmektedir. Ayrıca, protokolün çok yönlü bir başka örnek olarak, antijen lekeleme yüzey önce süksinimidil ester (CFSE) karboksifloresan ile bir deney alt-grubun isteğe bağlı bir etiketleme kullanır. Böyle KAKE ön-etiketleme, iki hücre hatları ya da deneysel koşullar hemen doğrudan karşılaştırma (sağlarVs KAKE-etiketli. Tek bir örnek tüpü, değişiklik veya inkübasyon süresi ince farklılıkların azaltılması ve antikor tasarruf içinde) etiketsiz. CFSE, yaygın üreme 41,42 ve Barkod deneylerde 43,44, hücre takibi 40 için kullanılan kurulu bir floresan boya olan. Gerçek sıralama adımlar (FACS, immünomanyetik hücre ayırma veya immunopanning) Bu protokolün bir parçası değil ise Nihayet, prensip olarak, burada açıklanan hasat ve etiketleme işlemleri antijen ya da hücre içi etiketleme-tabanlı uygulamaları sıralama yüzey tabi olabilir verim örnekleri yapmak 15 25,28. Bu makale ile, biz hedefliyoruz: bir olarak hücre içi KAKE boya etiketleme adım 41,45 sunmak, bir hücre içi hedeflerin tespiti için protokol yanı sıra kombine yüzeyi ve hücre içi antijen analizi 38 özetlemek, geçerli bir yüzey antijeni boyama protokolü 25,28 özetlemek com için deneysel seçenekkarşılaştırmalı nöral hücre popülasyonlarının analizleri ve sitometrik analizi (strateji ve veri sunumu 47 yolluk uygun kontrolleri 13,46) akış yaklaşımları özetlemek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">11330057</td>
			<td style="width:149px;">www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS without Ca2+ Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MEM Non-essential amino acids (100 x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>335.3</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>PAA Laboratories, Coelbe</td>
			<td>K41-001</td>
			<td>www.gelifesciences.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tween-20 Detergent</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>655205</td>
			<td>www.merckmillipore.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-84</td>
			<td>www.ebioscience.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMSO</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1584</td>
			<td>www.applichem.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bottle top filters express plus 0.22 &#181;m, 250 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>www.millipore.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 25)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156367</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 75)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156499</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (15 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipet, glass (150 mm)</td>
			<td>STEIN Labortechnik, Remchingen</td>
			<td>S03710150</td>
			<td>www.stein-labortechnik.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (0.1-10 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4125</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4126</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4129</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 5 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4051</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 10 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4101</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 25 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (0.5 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,699</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (2.0 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,500</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0247-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0549-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">Neuronal Class III &#946;-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-435P</td>
			<td>www.covance.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>www.lifetechnologies.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Zenon&#174; Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z-25342</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neubauer-Improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0640010</td>
			<td>www.marienfeld-superior.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td>www.scientificindustries.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.001</td>
			<td>www.eppendorf.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td align="right">653118</td>
			<td>www.bdbiosciences.com/instruments/accuri</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PSPIN-24R</td>
			<td>www.peqlab.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Orbital shaker, Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td>www.heidolph-instruments.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>4480-50</td>
			<td>www.hettichlab.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class II Biological safety cabinet Safe 2020</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026640</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 Incubator, Heracell 240i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">51026331</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vacuum system, Vacusafe comfort</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td align="right">158320</td>
			<td>www.integra-biosciences.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microscope, Axiovert 40 CFL</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td align="right">451212</td>
			<td>www.zeiss.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet controller, accu-jet pro</td>
			<td>Brand</td>
			<td align="right">26303</td>
			<td>www.brand.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144563</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144566</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Burada sunulan protokol yönlü deneysel yaklaşımlar (Şekil 2) sağlar. En kısa versiyonda, yüzey antijenlerinin basit boyama için bir kılavuz olarak kabul edilebilir (1, 3 ve 6 aşamada). Bunu daha karmaşık bir formda, hücre içi antijenlere bir dizi eş-etiketleme paradigmaların bir sayısı (2 ve / veya 4-5 isteğe bağlı aşama) takip edilebilir. Ayrıca, KAKE etiketleme adım hücre-hücre etkileşimi ?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types at JoVE.com

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Sinir Hücresi Tipleri Yüzey Akış Sitometri Protokolleri ve Hücre içi Antijen Analizleri

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

flow-cytometry-protocols-for-surface-intracellular-antigen-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

51.8K Görüntüleme.  University of Freiburg. We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Video: Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Nörobilim

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...