10SDG3500034 ve UTMB-NCB SSM&#39;ye fonları başlatmak: Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Ulusal Bilim Geliştirme hibe ile desteklenmektedir. Yazarlar Sealy UTMB Structural Biyoloji Merkezi&#39;nin (en Cryo-EM ve Bilimsel Hesaplama tesisleri kabul <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ) yanı sıra, Dr. 2D ve 3D sarmal rekonstrüksiyon algoritmaları ile yardım Steve Lüdtke ve Ed Egelman.

1.. Numune Hazırlama <ol><li> Tampon değişimi, insan Faktör VIII-BDD 14 ve HBS-Ca tampon maddesine karşı domuz FVIII-BDD 15 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH = 7.4) ve 1.2 mg / ml &#39;ye konsantre edilir. -80 ° C de, protein çözeltisi Ol </li><li> 01:04 w / kloroform w oranı en galactosylceramide (GC) ve fosfatidiliserin (PS) karıştırılması ile lipid nanotüpler (LNT) hazırlayın. , Argon altında, kloroform buharlaştırın ve 1 mg / ml &#39;ye HBS tampon maddesi içinde lipitleri çözünebilir. 4 ° C&#39;de LNT çözüm tutun </li></ol> FVIII-LnT 2. Cryo-elektron Mikroskopi <ol><li> Cryo-EM Numune Hazırlama <ol><li> 300 50 W da 10 saniye boyunca 2 ve O 2 H gaz karışımı içinde Quantifoil R2 / 2 bakır ızgaralar (C tarafı) ağ akıntı Glow </li><li> 01:01 su / çimento oranı ağırlık olarak HBS-Ca tamponu içinde FVIII ve LNT çözüm karıştırınız ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 2.5 ul bir damlaVitrobot Mark IV nemlendirilmiş bir odada (% 100 nem) &#39;de hidrofil elektron mikroskobu, şebekeye FVIII-LNT numunenin. </li><li> Leke ve flaş sıvı C 2 H 6 ızgara (3,5 saniye için bir leke, leke kuvvet 1) donma, amorf buz elde etmek için sıvı N 2 ile soğutulur. </li><li> Sıvı N 2 (LN2) altında saklama kutuları saklayın ızgaraları. </li></ol></li><li> Cryo-EM Veri Toplama NOT: JEM2100-LaB6 (yıl 2010) elektron mikroskobu, vakum sistemi, aydınlatma sistemi, HT, lens akımları ve böylece-okuma pencereleri ile bir ekrana, ve iki bağlı bir bilgisayardan oluşan bir TEMCON işletim sistemi ile donatılmıştır paneller: SOL ve SAĞ, sütunun her iki tarafına yerleştirilir. Kiriş vardiya X, Y düğmeleri (SHIFT Y, ELEMEK Y) ve çok fonksiyonlu (DEF / Stig) topuzlar hem paneller vardır. SOL panelinde aydınlatma (Lümen Parlaklık) topuzu. SAĞ panelde bulunmaktadır: büyütme (MAG / CAM BOYU) ve odaklama (FOCUS) topuzlar ve üç IMAGing (MAG1, MAG2, LOWMAG) ve kırılma (FARK) modları düğmeleri. Biz alfa 2 de MAG1 bizim veri elde. Cryo-EM veri toplama için gerekli minimum doz aydınlatma koşulları (MDS) SAĞ panelde F6 düğmeleri, üst satır ile F1 ile ayarlanır. Bu protokolde genel ayarları kullanılır: F1 - yükseltmek / düşük ekran, F2 - ARAMA modu, F3 - FOCUS modu, F4 - FOTO modu, F5 - MDS ON / OFF ve F6 - LEVENT BOŞ, radyasyon örneği korumak için kullanılan ışın saptırma tarafından zarar. <ol><li> Cryo-istasyonuna Cryo-tutucu yerleştirin ve tutucu ve LN2 ile kriyo-istasyonunun Dewar doldurun. Sıcaklık -192 ° C, tutucu ucu açık deklanşöre ulaştığında, yeri önceden belirlenmiş yerine Cryo-EM ızgara dondurulmuş ve bir halka kelepçe ile sabitleyin. </li><li> Elektron mikroskobu içine cryo-tutucu yerleştirin. Cryo-tutucu ve LN2 ile, anti-contaminator odasının Dewar doldurun. Tutucu, 30-60 dakika boyunca stabilize etmek için bekleyin. Basın üzerinde F6 vefilamanı açın. ızgara görüntülemek için tutucuya filaman doymuş, F6 tuşuna basın kapalı ve açık deklanşör. </li><li> Basın Low Mag / alfa 1 (200X kadir ayarlanır) ve ızgara üzerinde ince buz alanları bulun. </li><li> Minimum doz (MDS) modu ayarlayabilir ve numune zarar vermeden, düşük elektron dozlarda Cryo-EM veri elde etmek MAG 1/alpha 2&#39;ye geçmek. <ol><li> F2 tuşuna basın arama modunu ayarlamak için. 40.000 x at büyütme ayarlayın. / Å 2 · s - minimal elektron doz brigtness topuzu ~ 0.04 e kirişi büyütün. Basın FARK kırılma moduna geçmek için. MAG / CAM BOYU topuzu ile 120 cm&#39;ye kadar kamera uzunluğunu ayarlayın. Karbon film delikleri lipid nanotüpler var LOWMAG olarak önceden seçilmiş alanlarda ızgara üzerinde alanları bulun. </li><li> F4 tuşuna basın 40,000 X büyütmede Fotoğraf modunu ayarlayın ve 16-25 e dozlarda PARLAKLIK topuzu ile aydınlatma ayarlamak için - / Å 2 · s. Z-yüksekliğini ayarlayarak odak koşullarını ayarlamak için basın Standart Odak butonunaZ YUKARI / AŞAĞI düğmeleri (SAĞ kontrol paneli) ile numune. -1.5 Ile -2.5 um arasında ayarlayın odaksızlık. </li><li> FOTO modunda yansıması için alana gelen ARAMA modunda dijital kamera monitörde LIVE VIEW penceresinde bir kare çizerek ARAMA ve FOTO modu hizalayın. </li><li> F3 tuşuna basın 100.000 X büyütmede Odak modunu ayarlamak için. FOTO modunda yansıması için bölgeyi ışın değil - (5 cm yarıçap ~ 4) ve eksen dışı CCD çipi kapsayacak şekilde aydınlatma odaklanın. FOCUS düğmesi ve DEF / STIG düğme ile görüntü astigmatizma için doğru olan ~ -1.5 ve -2.5 um bulanıklaştırma ayarlayın. </li></ol></li><li> Dijital kamera monitörde LIVE VIEW penceresinde canlı görüntü elde ARAMA modunda yansıması için FVIII-LNT seçin. LIVE VIEW penceresinde çizilen meydanında FVIII-LNT merkezle. </li><li> Fotoğraf moduna geçiş ve Acquir tıklayarak 52.000 X etkin büyütme ve 0.5 sn pozlama CCD kamera, bir dijital görüntü kayıtDijital mikrograf kamera monitörde E düğmesine basın. Görüntü elde etme koşulları gibi görüntü FOTO modunda satın yalnızca açık ışın boş (KEPENK) olarak ayarlanır. </li><li> Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) elde etmek için CTRL-F tuşlarına basarak elde edilen görüntünün kalitesini ve bulanıklaştırma edin. </li></ol></li></ol> 3.. 3D İmar NOT: 2D ve 3D analiz için kullanılan görüntü analiz yazılımı: EMAN2 ve IHRSR serbestçe kullanılabilir. EMAN2 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install indirebilirsiniz. Egelman@virginia.edu: IHRSR Yazılım Profesör Egelman elde edilebilir. Nihai IHRSR iyileştirmeler Teksas üzerinde çalıştırılan merkezi cluster computing gelişmiş: http://www.tacc.utexas.edu/ Texas Üniversitesi, Austin. Şekil 1&#39;de gösterilen 3 boyutlu rekonstrüksiyon algoritması iki ana adımdan oluşur: Birinci 2D referans ücretsiz alignme ile sarmal kesimleri (partiküller) homojen bir dizi seçerkennt (RFA) algoritmaları ikinci IHRSR dahil sarmal parametreleri ve arka projeksiyon algoritmalara dayalı bir 3D yeniden elde, Eman 2. uygulanmaktadır. Http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2: İlk adım Tek Parçacık SPA EMAN2 özel olarak geliştirilen ve dağıtılan edildiği için (algoritmalar) ile 3 boyutlu rekonstrüksiyon için homojen partikül kümelerinin seçilmesi için geliştirilen programlar kullanır. Bu adım, Cryo-EM verilerine adapte edilmiştir. İkinci adım, özellikle yeniden birleştirme Faktörü VIII formları ile elde edilen sarmal düzeneklerinin tipi için tasarlanmıştır IHRSR algoritması ile elde edilir. Bu algoritma, bilimsel literatürde kapsamlı olarak 12 ile belgelenmiştir. <ol><li> Homojen parçacık sarmal yeniden inşası için (sarmal segment) takımları seçmek için http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16: EMAN2 bilimsel görüntü-işleme suite ile 2D görüntü analizi yapın. <ol><li> Straig ile Cryo-EM mikrograflannı seçinht ve dijital kamera yazılımı ve görselleştirme araçları ile helezonik tüpler iyi organize. </li><li> Invert, normalleştirmek ve e2workflow.py GUI X-ray piksel, tek parçacık rekonstrüksiyonu (SPR) seçeneği için filtre: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> E2helixboxer.py GUI, ters normalize ve X-ışını piksel filtreli görüntüleri içe. Kullanılarak% 90 örtüşme ile 256 x 256 piksel (2.9 Å / pix) de FVIII-LNT sarmal tüpler ve segmentini seçin: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Orijinal mikrografiklerinden bulanıklaştırma değerlendirmek ve e2workflow.py dahil e2ctf.py seçeneği ile aynı mikrografiklerinden sarmal kesimleri kontrast transfer fonksiyonunu (CTF) düzeltme (sadece faz düzeltme) geçerlidir: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> İlk parçacıklar (sarmal kesimleri) oluşturmak e2workflow.py GUI setleri - SPR seçeneği: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Iter = 8 - &#39;e2refine2d.py: e2refine2d.py algoritması komut aşağıdaki, aynı çap LnT ve sarmal düzenin derecesi (Şekil 2) ile homojen veri setleri seçmek için referans ücretsiz k-ortalama sınıflandırma uygulayarak 2D sınıf ortalamaları hesaplamak - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - yolu = r2d_001 - input = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = nokta - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = nokta - classraligncmp = faz - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = ortalama - normproj-classkeepsig &#39;, buna göre ncls değerinin değiştirilmesi. <ol><li> Sınıf ortalamasının daha az% 80 benzerliği ile parçacıkların belirli bir sınıfın dışındadır, yani &#39;classkeep = 0,8&#39; 8 yineleme üzerinde 150 sınıfların &#39;= 151 NCIS&#39; ayarlanan ilk verileri sınıflandırmak. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Sınıf ortalamaları partikülleri birleştirmeara veri kümesi oluşturmak için e2display.py içinde belirgin sarmal sapması ile. </li><li> Düzenin aynı çap ve derecesi ile sınıfları ayırt etmek için 50 sınıfların &#39;= 51 NCIS&#39;e&#39; ayarlanan ara veri sınıflandırır. </li><li> Http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector: üç boyutlu rekonstrüksiyon için nihai veri seti oluşturmak için e2display.py düzenin aynı çap ve derecesi ile sınıflardan parçacıkları birleştirme. </li></ol></li></ol></li><li> Egelman 17, 18 anlatıldığı gibi, iteratif Helisel Gerçek Uzay Rekonstrüksiyon (IHRSR) algoritması ile sarmal yeniden gerçekleştirin. <ol><li> Yükselişi tahmin, birleştirilen Fourier FVIII-LNT sarmalın Δz (A), son veri setinde parçacıkların dönüşümü. </li><li> 5 ila ΔΦ artan, sabit Δz ile paralel IHRSR refinements çalıştırarak azimuthal açısını ΔΦ (º) tanımlayın76; 5 ° artışlarla 60 °. </li><li> Bir başlangıç ​​hacminin bir özelliği olmayan silindir ve 3.2.1 &#39;de tarif edildiği gibi başlangıç ​​parametreleri sarmal Δz ve ΔΦ seti, her son veri 100 ardışık IHRSR döngüleri çalıştırın. ve 3.2.2. </li><li> Sınıf nihai veri setinin 2D sınıflandırmadan ortalamalar ve nihai IHRSR yeniden gelen projeksiyonlar arasındaki sarmal parametreleri ve yazışma yakınsama için son hacimleri kontrol edin. </li><li> Nihai asimetrik 3B hacminde görülen asimetrik birim dağılımına karşılık gelen nihai 3B rekonstrüksiyon simetri empoze: insan FVIII-Int 4-kat ve domuz FVIII-Int boyunca 5 kat. Son bir simetriklestirilir 3D yeniden oluşturmak için başka bir 100 arıtma döngüleri çalıştırın. </li><li> &#39;E2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfil: ilk, hatta tek ve belirlenen ilgili veri ayırarak hem hacimleri için Fourier Shell korelasyon eğrisini hesaplamake&gt; - bölünmüş = 2 &#39;. 3.2.3 &#39;de tarif edildiği gibi O 100 IHRSR ardışık iyileştirmeler çalıştırın. Tek ve çift veri setlerinden oluşturulan 3D hacimlerinin FSC hesaplayın: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> Ucsf kimerada FVIII-LNT hacimleri görselleştirmek ve Segment. </li><li><ol><li> Adım 3.2.5 den son hacimleri açın. UCSF Chimera ve ARAÇLAR&gt; SES DATA&gt; SES İZLEYİCİ seçeneğinde 0.005 kontur seviyesini ayarlayın. </li><li> ARAÇLAR&gt; SES DATA&gt; BÖLÜMLERE MAP, MAP BÖLÜMLERE sekmesinde seçin hacmi ve segmentinde ses segment tıklayın. </li><li> Grup kesimleri CTRL + SHIFT ve tıklayarak grup ile seçerek bir birim hücreye karşılık. </li><li> Birim hücre tarafından segmentleri renk ve yapısal özelliklerini vurgulamak için EYLEMLER&gt; RENK seçeneği ile helix. </li></ol></li></ol> 4. Elektron Tomografi <ol><li> Olumsuz Vitray FVIII-LNT Numune Hazırlama <ol> &lt;li&gt; Cryo-EM deneyler gibi FVIII-LNT örnekleri hazırlayın. </li><li> Kriyo-EM deneyleri için 50 ° W olarak, O, 2 ila 10 saniye boyunca 2 H gaz karışımı içinde, karbon kaplı 300 meşlik bakır ızgara (C tarafı üstte) tahliye Glow. </li><li> Şebekeye 6-nm koloidal altın nano partiküller ile 2.5 ul FVIII-LNT süspansiyonu bir damla, fazla sıvıyı leke ve negatif 2 dakika boyunca 5 ul% 1 uranil asetat çözeltisi uygulayarak leke. Izgara kuru aşırı sıvı ve havayı kurulayın. </li></ol></li><li> Elektron Tomografi Veri Toplama <ol><li> Tek eğim tutucu içine ızgara aktarın. </li><li> Elektron mikroskobunda tutucu aktarın. </li><li> 52.000 X etkili büyütmede bir CCD kamera ile +60 ° ve kayıt görüntüleri -60 ° &#39;lik bir açı aralığında 2 ° artışlarla SerialEM yazılımı 19 otomatik eğim serisi toplamak, -6 -10 mikron flulaştırmayla ve 150 elektron doz - 170 electrons / Å 2 · s tomografisinde başına. </li></ol></li><li> FVIII-LnT Elektron Tomografi İmar Not: 4.2 edinilen pFVIII-LNT ve hFVIII-LNT eğik serisini yeniden yapılandırma. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html: öğretici aşağıdaki IMOD yazılımın ETomo seçeneği ile <ol><li> Bir terminal penceresini kullanarak, 3DMOD yılında tomogram açın. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin IMOD BINVOL ile 4 ile tomogram tomografisinde boyutunu azaltmak için emrediyorum. </li><li> IMOD ROTATEVOL komutunu kullanarak binned tomografisinde Y-ekseni boyunca lipid nanotüp döndürmek için doğru açıyı seçin. </li><li> IMOD ROTATEVOL komutu ile tam tomogram döndürün. </li><li> IMOD CLIP RESIZE komutu ile Y-ekseni boyunca yönlendirilmiş seçilen lipid nanotüp kırpın. </li><li> 3DMOD ile kırpılmış alt tomogram açın. </li><li> Boyunca Faktör VIII moleküllerin düzenleme görselleştirmek için tomografisinde tıklayınZ-ekseninde ve alt tomogram hacminde Y ekseni boyunca dilimleri. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy.">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).</li><li>Fujiyoshi, Y., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+proteins+in+membranes.">Electron crystallography of proteins in membranes.</a> Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).</li><li>Toole, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+cDNA+encoding+human+antihaemophilic+factor.">Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor.</a> Nature. 312, 342-347 (1984).</li><li>Fay, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+structure+and+function.">Factor VIII structure and function.</a> International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).</li><li>Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+membrane-bound+factor+VIII.">Domain organization of membrane-bound factor VIII.</a> Biopolymers. , (2013).</li><li>Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophilia:+new+protein+therapeutics.">Hemophilia: new protein therapeutics.</a> Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).</li><li>Gatti, L., Mannucci, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+porcine+factor+VIII+in+the+management+of+seventeen+patients+with+factor+VIII+antibodies.">Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies.</a> Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).</li><li>Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+coagulation+Factor+VIII+bound+to+lipid+nanotubes.">Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes.</a> Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).</li><li>Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+recombinant+human+coagulation+factor+VIII+to+lipid+nanotubes.">Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes.</a> FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).</li><li>Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+urease+activates+blood+platelets+through+a+lipoxygenase-mediated+pathway.">Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).</li><li>Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+crystallization+of+soluble+and+membrane+binding+proteins.">Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins.</a> Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+helical+filaments+and+tubes.">Reconstruction of helical filaments and tubes.</a> Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).</li><li>Lusher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+introduction+of+recombinant+factor+VIII--a+clinician's+experience.">Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience.</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).</li><li>Thim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+new+recombinant+factor+VIII+(N8).">Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8).</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).</li><li>Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+recombinant+porcine+coagulation+factor+VIII.">High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+structure+of+membrane-bound+coagulation+factor+VIII:+modeling+of+the+factor+VIII+heterodimer+within+a+3-dimensional+density+map+derived+by+electron+crystallography.">3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography.</a> Blood. 99, 1215-1223 (2002).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali ilgi var ve onlar bu yazının yayınlanmış işlemlerin herhangi ilgili olarak doğrudan temasa geçilebilir beyan.

Bu çalışmada, bir yöntem son derece homolog proteinlerin iki zara bağlı kuruluşlar arasında ayırt etmek için sunulmuştur: İnsan ve domuz FVIII kendini monte insan vücudunda karşılaşılan koşullarda lipid nanotupler on. Açıklanan prosedür, insan ve domuz FVIII başarıyla en kritik adımdır, lipid nanotüpler helozonik düzenlenmektedir. Sonraki kritik adım yakınındaki sıvı N 2 sıcaklıkta flaş donma sonucu ince amorf buz örn...

Kan pıhtılaşması, Faktör VIII (FVIII) altı alanda düzenlenmiş 2332 amino asitlerin büyük bir glikoproteindir: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Trombin aktivasyon FVIII zara bağlı Tenase kompleksi içinde faktör IXa kofaktörünün olarak hareket üzerine. Bir zar-bağlı şekilde aktive FIXa FVIII (FVIIIa) bağlanması, FIXa proteolitik verimliliği etkili kan pıhtılaşmasının 4 için çok önemlidir 10&#39;dan fazla 5 kez, geliştirir. FVIII koagülasyon ve Tenase kompleks oluşumunda oynadığı önemli rolüne rağmen, fonksiyonel membran-bağlı FVIII yapı çözülecek henüz. Bu adres için, yüksek afiniteli 8, 9, FVIII bağlayıcı ve aktif trombosit yüzeyi benzeyen edebilen fosfatidilserin (PS) zengin bir lipid iki katmanlı nanotüpler (LNT), 10 geliştirilmiştir. LnT bağlı FVIII&#39;ünün Ardıl sarmal örgütü effecti olduğu kanıtlanmıştırCryo-EM 5 ile FVIII membran bağlı devlet yapısının belirlenmesi için ettik. Fonksiyonel LNT Cryo-EM, 11, 12 yolu ile protein-protein ve helisel şekilde düzenlenmiş zara bağlı proteinler, protein-membran etkileşimi incelemek için ideal bir sistem bulunmaktadır. Numune fizyolojik bir ortamda (tampon, membran, pH) en yakın olarak korunur gibi Cryo-EM katkı maddeleri ve izotoplar olmadan, örneğin X-ışını kristalografisi ve NMR yapı gibi geleneksel yöntemlere göre bir avantaja sahiptir. LNT boyut, şekil ve bileşimin Tenase kompleksler in vivo monte aktif trombositlerin pseudopodia yakından benzer olarak FVIII durumunda, bu teknik ile zara-bağlı yapısını inceleyerek daha da daha fazla fizyolojik olarak önemlidir. Kusur ve FVIII neden Hemofili A, insan nüfusu 4, 6 1 5,000 erkekleri etkileyen ciddi bir kanama bozukluğu eksikliği. Çoğu eHemofili A için etkili oldukları tedavi rekombinant insan FVIII&#39;ünün (hFVIII) yaşam boyu uygulanmasıdır. Rekombinant FVIII Hemofili A tedavisinin önemli bir komplikasyon Hemofili A hastalarının 13 yaklaşık% 30 etkileyen insan formuna engelleyici antikorların gelişmedir. Bu durumda, domuz FVIII (pFVIII) konsantre FVIII insan ve insan FIXa 7 ile form fonksiyonel kompleksleri karşı inhibitör antikorlar ile domuz FVIII görüntüler, düşük çapraz reaktiflik olarak kullanılır. Domuz ve insan FVIII formları hem de zara bağlı örgüt kurma FVIII kofaktör fonksiyon ve kan hemostaz için etkileri yapısal temelini anlamak önemlidir. Bu çalışmada, lipid nanoteknoloji, Cryo-EM, ve iki son derece homolog FVIII formlarının zara bağlı organizasyon çözmek için tasarlanmış bir yapı analizi bir arada tarif eder. Helezonik organize porci için sunulan Cryo-EM veri ve 3D yapılarınegatif yüklü Int üzerinde ne ve insan FVIII FVIII yapı tayini ve zara bağlı pıhtılaşma faktörleri ve fizyolojik bir ortamda zar kompleksleri için temel olarak kullanmak için önerilen nanoteknoloji potansiyelini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">JEM2100 with LaB6&#160;</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">JEM-2100</td>
			<td style="width:447px;">operated at 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">with TEMCON software</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan626 Cryo-holder</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">626.DH</td>
			<td style="width:447px;">cooled to -175 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">with temperature controler unit</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan 4K x 4K CCD camera</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">US4000</td>
			<td style="width:447px;">4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Solarus Model 950 plasma cleaner</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:205px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Materials</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">01821</td>
			<td style="width:447px;">plasma cleaned for 10 s on high power</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">Quantifoil R2/2 300 mesh</td>
			<td style="width:205px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Q225-CR2</td>
			<td style="width:447px;">Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">19481</td>
			<td style="width:447px;">1% solution, filtered</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:239px;">Galactosyl ceramide</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">860546</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840035</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Software</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">EM software Digital Micrograph</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">EM software EMAN</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">EM software Spider</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">EM software IHRSR</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;">Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (IMOD)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (SerialEM)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">UCSF-Chimera</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes

<html> Kriyo-elektron mikroskobu (Cryo-EM) 1 bir hidratlı eyalet ve zar ortamı 2 protein ve komplekslerinin fonksiyonel yapısını araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır. Pıhtılaşma Faktör VIII (FVIII) 3 bir çok etki alanı, kan plazma glikoproteinidir. Ciddi bir kanama hastalığıdır - kusur veya FVIII eksikliği Hemofili A tipi için nedenidir. Proteolitik aktivasyonu üzerine, Faktör VIII, normal kan pıhtılaşması 4 için kritik olan, negatif yüklü trombosit membran ilgili serin proteaz Faktör IXa bağlanır. FVIII koagülasyon oynadığı önemli rolüne rağmen, zar bağlı devlet için yapısal bilgiler eksik 5&#39;tir. Yeniden birleştirici FVIII konsantre Hemofili A tipi karşı en etkili bir ilaçtır ve ticari olarak temin edilebilen FVIII insan ya da domuz, insan Faktör IXa 6,7 ile her oluşturan işlevsel kompleksleri olarak ifade edilebilir. &quot;&gt; Bu çalışmada, Cryo-elektron mikroskopisi (Cryo-EM) oluşan bir kombinasyon mevcut, lipid nanoteknoloji ve yapı analizleri, iki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek başvuran. İnsan ve domuz laboratuarımızda gelişmiş metodoloji Sarmal olarak negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerindeki iki fonksiyonel yeniden birleştirici FVIII formları düzenlemek için tarif edilmektedir. temsil eden sonuçlar yaklaşım sırası de yüksek ölçüde homolog iki (% 86 sekans özdeşliği arasındaki sarmal kuruluşta farklılıkları tanımlamak için yeteri kadar hassas olduğunu göstermektedir ) proteinleri. helezoni örgüt, Cryo-EM ve elektron tomografi (ET) veri toplama için ayrıntılı protokolleri., iki boyutlu (2B verilir) ve üç boyutlu (3D) yapı analizleri, insan ve domuz 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için uygulanır FVIII-LNT tartışılmaktadır. sunulan insan ve domuz FVIII-LNT yapılar önerilen yöntemin potansiyel calculat göstermekYüksek çözünürlükte kan pıhtılaşma faktörü VIII e fonksiyonel, zara bağlı organizasyonu.

Rekombinant insan ve domuz FVIII başarılı bir şekilde negatif olarak aktive edilmiş trombosit yüzeyi benzeyen, bir iki-tabaka LNT şarj helezon şeklinde düzenlenmiştir., Insan ve domuz-FVIII Int sarmal düzenleme (Şekil 2), toplanan dijital mikrograflar ile tutarlıdır. Kontrol LNT ve insan ve domuz-FVIII LNT sarmal borular seçilir ve e2helixboxer.py GUI ve e2workflow.py GUI, tek parçacık seçeneği (Tablo 1) ile oluşturulan ilk veri setleri ile sınıfla...

Watch this Scientific Journal Video about Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes at JoVE.com

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

İnsan ve domuz: İki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek için uygulanan Cryo-elektron mikroskobu, lipid nanoteknoloji, ve yapı analizleri bir arada mevcut. Helezonik negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerine iki fonksiyonel rekombinant FVIII formları düzenlemek için laboratuvarda geliştirilen metodoloji açıklanmıştır.

Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch.  İnsan ve domuz: İki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek için uygulanan Cryo-elektron mikroskobu, lipid nanoteknoloji, ve yapı analizleri bir arada mevcut. Helezonik negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerine iki fonksiyonel rekombinant FVIII formları düzenlemek için laboratuvarda geliştirilen metodoloji açıklanmıştır. 

Video: Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very promising application for molecular sensors, field effect transistor and super thin and flexible electronic devices1-4. Anodic arc discharge supported by the erosion of the anode material is one of the most practical and efficient methods, which can provide specific non-equilibrium processes and a high influx of carbon material to the developing structures at relatively higher temperature, and consequently the as-synthesized products have few structural defects and better crystallinity.
 To further improve the controllability and flexibility of the synthesis of carbon nanostructures in arc discharge, magnetic fields can be applied during the synthesis process according to the strong magnetic responses of arc plasmas. It was demonstrated that the magnetically-enhanced arc discharge can increase the average length of SWCNT 5, narrow the diameter distribution of metallic catalyst particles and carbon nanotubes 6, and change the ratio of metallic and semiconducting carbon nanotubes 7, as well as lead to graphene synthesis 8. 
 Furthermore, it is worthwhile to remark that when we introduce a non-uniform magnetic field with the component normal to the current in arc, the Lorentz force along the J&times;B direction can generate the plasmas jet and make effective delivery of carbon ion particles and heat flux to samples. As a result, large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes were simultaneously generated by such new magnetically-enhanced anodic arc method. Arc imaging, scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM) and Raman spectroscopy were employed to analyze the characterization of carbon nanostructures. These findings indicate a wide spectrum of opportunities to manipulate with the properties of nanostructures produced in plasmas by means of controlling the arc conditions.

Anodic arc discharge is one of the most practical and efficient methods to synthesize various carbon nanostructures. To increase the arc controllability and flexibility, a non-uniform magnetic field was introduced to process the one-step synthesis of large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes.

Tek duvarlı Karbon Nanotüpler Eşzamanlı Sentezi ve Manyetik geliştirilmiş Arc Plazma Grafen

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Biyomühendislik

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Fiber Teşkilatı geçişleri ile electrospun Nanolif iskeleleri

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Gümüş nano tanecikleri ve onların antibakteriyel faaliyetleri ve sitotoksik özellikleri değerlendirilmesi ile modifiye çok duvarlı karbon nanotüpler sentezi

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&amp;#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...