Biz finansman DFG (1116/17-1) ve Leipzig doğal bilimler "BuildMoNa" (GSC 185) tarafından kabul. Bu eser Fraunhofer çekin projeye 601 683 desteklemiştir. T. H. Avrupa Sosyal Fonu (ESF-100077106) finansman kabul eder.

1. n HTs hazırlanması Not: Burada, n farklı tek DNA iplikçiklerin helix tüpler belirli bir boyuttaki oluşumunda yer gösterir. N = 8, sekiz farklı tek DNA dizilerini bir birim yüzüğü olun.
<ol><li>Satın alma DNA dizileri (HPLC saflık sınıf veya daha yüksek) uygun bir DNA sentezi üzerinden hizmet veya yüksek kaliteli sentez ve arıtma (Tablo 1 ' de verilen örnek dizileri) gerçekleştirmek.</li>
	<li>Liyofilize resuspend oligonucleotides arıtılmış su ve takip daha fazla resuspension adımları şirketten ilgili kılavuzda verilen. 200 µM son bir konsantrasyon elde etmek için su miktarını ayarlamak.</li>
	<li>Belirleme konsantrasyonları tek DNA iplikçikleri dağıtıcısı tarafından verilen değerleri doğrulamak için (Örneğin, UV-Vis spektroskopisi 260 ile nm) tam stoichiometry derleme işlemi için çok önemli olduğu için. Belirli molar ağırlık ve her tek iplikçikli DNA Oligonükleotid tükenme katsayısı dikkate alarak oligonucleotides, konsantrasyonu hesaplayın. 
	Not: Extinction katsayısı değerleri doğal olarak farklı ard arda geliş için değişir ve ticari olarak satın alınan DNA belgelerinde belirtilen. Onlar da serbestçe kullanılabilir çevrimiçi araçlar bir dizi kullanarak en yakın komşu modeline göre hesaplanır. Spektrometre doğrusal aralığı ile uyum sağlamak için konsantrasyon belirlenmesi için kullanılan örnek sulandrarak göz önünde bulundurun.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak bir kapsayıcı istenen n HTs oluşturmak thermocycler için (Örneğin, bir 200 µL PCR tüp) uygun DNA iplikçikleri-aynı anda toplama-in her mix (son arabellek koşulları: 1xTE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8) ve 12,5 mM MgCl 2). 
	Not: Son DNA n HT örnekleri n oluşur - 1 iplikçikleri, U 1 &#8722; U n &#8722; 1 ve bir T n strand. Konsantrasyon strand başına kullanıcı gereksinimlerine bağlı olarak alt-micromolar için 10'dan fazla µM farklı (Örneğin, &#60; strand tek filamentler gözlemlemek sonraki seyreltme için veya daha yüksek konsantrasyonlarda incelenmesi için başına 1 µm yoğun ağ mekanik).</li>
	<li>N HTs bir thermocycler (bir sonraki hızlı damla ila 65 ° C ile 90 ° C'de 10 dakika denatürasyon; yavaş sıcaklık 65 ° C -0,5 K 20 sıcaklık adımlarla 30 dk için tamamlayıcı baz eşleşmesi ile 55 ° C için azaltın melezlemek Her; ve bir hızlı bırak 55 ° c ila 20 ° C); şekil 2A bkz. 
	Not: Yavaş azalma adımları 65 ° c ortalama üretim boyu artırmak için uzamış; Ancak, sonraki hızlı açılan 20 ° c polimerli tüpler toplama önlemek çok önemlidir.</li>
	<li>İçin 3 hafta tespit düşüşü olmaksızın 4 ° C'de melezleşmiştir n HTs depolamak. 
	Not: floresan için n HTs etiketli mikroskobu, melezleşmiştir U1 ile değiştirilmiş U1-Cy3 (Tablo 1) (kısmen) yerine kullanarak. Uzun gözlem süreleri için kurulan anti-beyazlatma ajanlar eklenmesi tavsiye edilir.</li>
	<li>Dikkatle seyreltik örnek istenen son konsantrasyonu (Örneğin, 4 µM ağlar veya 20 nM tek-filament gözlemler için) örnek arabellek kullanarak. Olası hata kaynaklarını en aza indirmek için istenen son toplama örnekleri montajı.</li>
</ol> 2. Reolojisi kesme <ol><li>Seç uygun bir geometri (tabak tabak ya da koni-plaka) dinamik kesme rheometer için. Küçük birimler (Yani, 200 µL aşağıda), kullanmak için koni-plaka geometri.</li>
	<li>Örnek dinamik kesme rheometer üzerinde yük.</li>
	<li>Hava-su arabirimi örnek ve potansiyel buharlaşma etkileri önlemek için aşağıdaki adımları kullanarak çevre passivate.
	<ol><li>Örnek örnek arabellek Bath 2.5 mL ile surround.</li>
		<li>Yüzey aktif hemen altında micelle konsantrasyon ekleyin.</li>
		<li>Örnek hava ile doğrudan temas önlemek için bir lipid ile örnek için Hamilton şırınga kullanılır.</li>
	</ol></li> <li>Islak sünger ile donatılmış bir kap ile örnek odası mühür ve mümkünse, daha fazla (örnek) temas değil bir ek su banyosu ile buharlaşma bastırmak.</li>
	<li>Oda sıcaklığında rheometer özel yazılım kullanarak ölçüm Başlat; (fizyolojik şartlarda gerekiyorsa) alternatif olarak, ölçüm 37 ° C gibi farklı sıcaklıklarda gerçekleştirmek. 
	Not: Isıtma için geliştirilmiş buharlaşma açar iken örnek soğutma kez su buharı yoğunlaşma tarafından çevredeki havadan eşlik ediyor. Tüm ölçümler bir dizi sabit bir sıcaklıkta gerçekleştirilmesi gereken her iki etkileri kontrol edilemez bir şekilde örnek konsantrasyonu değiştirebilirsiniz.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2 h için equilibrate örnek sağlar. Zaman evrim zaman süpürme ile takip edilebilir (bir veri noktası dakikada; γ zorlanma %5; = frekans f 1 Hz =).</li>
	<li>İstenen test protokolleri ile mekanik özelliklerini ölçmek. Başlatma sıklığı piyango bir dizi (f-piyango) çünkü onlar örnek olduğu gibi bırakmak ve daha fazla ölçülerini izin. 
	Not: Ayrıca, kısa f-piyango taşınan dışarı önce ve sonra uzun ölçümleri (uzun f gibi-piyango ile daha yüksek çözünürlük) örnek boyunca tam ölçüm protokolünün değişmemiştir doğrulamak için.
	<ol><li>Gerçekleştir kısa bir f-süpürme (Örneğin, γ = %5; f = 0.01 Hz ila 30 Hz; yılda 5 veri noktaları).</li>
		<li>Gerçekleştirmek uzun f-süpürme (Örneğin, γ = %5; f = 0,001 Hz ila 30 Hz; 21 veri noktaları yılda); düşük frekanslı rejim değil gerekli ölçüm süresini azaltmak atlanabilir.</li>
		<li>Kısa f gerçekleştirmek-süpürme.</li>
		<li>Bir γ-tarama gerçekleştirmek (Örneğin, f = 1 Hz; γ = %0.0125 %100 için; yılda 20 veri noktaları). 
		Not: kısa f kullanın - ilk olarak, genellikle önceki f ile tutarsız olduğu gibi süpürme - ağlar genellikle rüptürü γ-tarama sırasında veya plakalar bağlantısını kesin çünkü süpürür. Alternatif olarak, γ-rampa kullanın (Örneğin, 0.025 s -1, t = 60 = s); Ancak, rampaları gerektirir genellikle değişen motor modu, yani sonraki kısa f-piyango sahte.</li>
	</ol></li> <li>Bin ve/veya pürüzsüz bir Gauss çekirdek ile ham veri.</li></ol>
 3. tavlama DNA Floresans destekli analiz, <ol><li>8 hazırlamak aliquots 12 µL 1-4 µM kullanarak her örnek için DNA strand, TE arabellek x 12.5 mM MgCl 2 1 ve 1 x nükleik asit jel başına leke 10.000 x DMSO hisse senedi. Hiçbir DNA negatif bir denetimle olun ama nükleik asit jel leke içerir.</li>
	<li>Aliquots bir gerçek zamanlı PCR tabağa aktarın ve tutkal yapıştırıcı film ile (Örneğin, bir 96-iyi tepki plaka). 
	Not: kullanılan protokolleri tavlama termal yüksek sıcaklıklarda örnekleri buharlaşır. Böylece, kuyuları sıkı su buharlaşma ve konsantrasyon artış, özellikle uzun süreli deneyler sırasında önlemek için yapıştırıcı film ile kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>100 x g gaz kabarcıkları kaldırmak için oda sıcaklığında 1 dk. için plaka santrifüj kapasitesi; gaz kabarcıkları genişletirseniz, kuyuları analiz olamaz.</li>
	<li>Kapalı plaka bir gerçek zamanlı kantitatif PCR sisteme yük.</li>
	<li>Bir tavlama programını çalıştırın. DNA için 10 dk. damla hızlı bir şekilde ile 72 ° c sıcaklık 90 ° C'de denatüre O zaman, sıcaklık yavaş yavaş 0.5 ° C tarafından her 30 dk azaltın. Sinyal çürüdü sonra sıcaklık rampa hızlandırmak. 
	Not: 72 ° C yeterince gerçek hibridizasyon sıcaklığı olduğunu; Böylece, sinyal gerekli sıcaklık aralığı belirlemek için uygun bir geniş sıcaklık aralığında kaydedilir.</li>
	<li>Cycler kapak en az 100 ° buharlaştırılmış örnek yapıştırıcı film üzerinde yoğunlaşma önlemek için c ısıtır emin olun.</li>
	<li>Derleme sırasında örnekleri ile bir argon-iyon lazer 488, heyecanlandırmak nm ve 550, Floresans algılamak bir nükleik asit jel leke kullanırken nm (veya hayalice benzer). Diğer boyaları bir uygun uyarma/emisyon kombinasyonu seçmek. Floresans sinyal genel artırmak için mümkün olduğunca sık ölçmek dahili kamerayı kullanarak sinyal kalitesini. 
	Not: Burada, her 9 ölçümleri alınmıştır s.</li>
	Önceden ayarlanmış erime ve programları tavlama uygulandığında, <li>verileri çözümlemek için sağlanan yazılım kullanır. Aksi takdirde, floresan sinyal göreceli değişiklik elde etmek her sıcaklık adımı için ortalama değeri önceki ortalama değerden çıkarma.</li>
</ol> 4. AFM Imaging <ol><li>Mika ayırmak (Örneğin, Mika &#34; V1 &#34;) ticari olarak mevcut yapışkan bant ekleme ve sökük uzakta; tarafından Mika en üst tabakası kaldırılmalıdır.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak önceden oluşturulmuş n HT için 10 dk. yerleşmek izin ve taze cleaved Mika üzerinde katlanır arabellek içeren Mg 2 + mevduat</li>
	<li>, Geri kalan sıvı kaldırmak için küçük masa santrifüj 2.000 x g aralıklarla kısa 3 sn içinde örnekleri spin. Birkaç n HTs hala Mika yüzeye eklenmelidir.</li>
	<li>Yüksek sertlik (Örneğin, 54 Nm -1) ile bir konsol ipucu kullanın ve iç AFM yazılım ile rezonans frekansı belirlemek.</li>
	<li>Kayıt modu zarar veya n sözkonusu yerinden önlemek için düşük tarama hesaplı (Örneğin, 1 satır/s) dokunarak havada AFM ile yükseklik profili</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Uygun şekilde oluşturulmuş ağlar elde etmek için DNA nanotüpler montaj önemli bir adımdır. Sentez işlemi sırasında hatalar tüp kalite olumsuz; Bu nedenle, HPLC veya daha sıkı bir süreç oligonucleotides arındırmak için kullanılması önerilir. N kurucu oligonucleotides kümesi içinde ekimolar stoichiometry üzerine toplanan DNA nanotüpler yanı sıra kendi uzunluğu dağıtım yerine ayrık oluşumu bağlı olduğundan, konsantrasyonları remeasure gereklidir satın alınan ipliklerini beri...

Kendi benzersiz mekanik özellikleri tarafından etkin karmaşık davranışları nedeniyle semiflexible polimerler yaşam maddenin temel yapı taşları vardır. Esnek polimerler aksine semiflexible polimerler hala güçlü termal dalgalanmaları1tabi kalarak uzanmış bir yapılandırma onların sigara ufuk omurga sertlik nedeniyle evlat. Böylece, tamamen Stokastik Modeller ile tam esnek veya rijit polimerler gibi aşırı davranışları için uygulanamaz. Sözde solucan benzeri zinciri modeli2,3,4 lp, üzerinden bu sertlik çürümesine sabit boyunca filaman4tanjant-teğet korelasyon olduğu ölçmek için geliştirilmiştir. Lp filaman kontur uzunluğu (lc) karşılaştırılabilir ise, polimer semiflexible1kabul edilir. Benzer bir çadır direkleri, kendi düzenlemeleri ağlar veya demetleri tüm toplu sistem düşük hacimli kesirler, sıradışı visko elastik özellikleri5,6,7' yelider, stabilize, 8,9. Bu yapıların yüksek elasticities geniş boyutları10hala diffusive kolaylaştırılması ve aktif taşıma işlemleri sırasında mekanik bütünlüğünü korumak, kafes sağlamak. Bu özellik özellikle sitoiskeleti veya hücre dışı matriks gibi biyolojik sistemleri için uygundur, ancak Gıda Mühendisliği1,11,12' de yaygın olarak kullanılır.
Bunların önemini yaşayan konuya gidiyor, kapsamlı bir şekilde biomimetic malzeme veya roman hydrogels geliştirmek için araçlar için bu yapıların fiziksel özelliklerini incelemek önemlidir. Semiflexible polimerler açısından bu lp ve açıklayıcı bir Kuramsal çerçeve geliştirilmesi gibi tek-filament özelliklerinden kaynaklanan ağlarının toplu özelliklerini sistematik olarak belirlenmesi anlamına gelir. Öncü çalışmalar, hücresel biyopolimer aktin semiflexible polimerler için bir model sistem olarak kurulmuş ve hala yaygın olarak altın standart5,13,14,15 olarak kabul edilir , 16 , 17. bu proteinin doğal özelliklerine bağlıdır beri Ancak, ayrıntılı çalışmalar bu sistemi ile sınırlıdır. Çeşitli teorik yaklaşımlar tek-filament düzeyinde olmayan önemsiz mekanik davranışları açıklamasını binasında nişan ve özellikle farklı ölçekleme öngörüleri doğrusal elastik Yaylası kesme modülü, G için bağımlılığı için yol açmıştır 0 (Yani, ağ "esneklik"), konsantrasyon (c) ve lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Konsantrasyon ölçekleme aktin esaslı ile deneyler veya diğer model sistemleri kolayca erişilebilir olmakla ve teorik Öngörüler titizlikle olmuştur iken13,16,24, doğrulanmadı 25, lp ile ilgili olarak ölçekleme deneysel olarak erişilemeyen kalmıştır. Ayrıca semiflexible polimerler belirleyici miktarıdır bağımsız bir değişken olduğu için lp bu, ancak, büyük bir sınırlama var.
Bu Merkez, doğal sınırlama aktin sabit lp veya diğer biyolojik kaynaklı polimerler kollajen gibi son zamanlarda mekanik özelliklerini tunable kiremit tabanlı DNA tüpler, istihdam ederek çözümlenmiş 9 , 26 , 27 , 28. mimarileri hafif değişimler (örn., farklı sayıda kurucu DNA iplikçikleri birim halka içinde) tüplerin verim lpFloresans mikroskobu ile değerlendirilebilir, için farklı değerler olarak bir dalgalanan tüp analiz veya birkaç yapıştırılır tüpler eğri yapılandırmaları değerlendirilmesi,9,28daha önce açıklanan. Bu analizler lp değerleri farklı tüp nüfusun birden fazla büyüklük üzerinde değişiklik ve farklı değerlendirme teknikleri tutarlı sonuçlar9,28verim saptandı.
Doğal olarak, konsantrasyon ve lp doğrusal elastik Yaylası kesme modül G0 genel ölçeklendirme tüm önceki teorik yaklaşımlar ile tutarsız olarak bildirilmiştir özellikle bir çok gösteren 9, lptahmin edilen bağımlı daha güçlü. Bu bulgular semiflexible polimerler Merkezi özelliklerini incelemek için yeni bir modeli sistem değerini vurgulamak. Nistihdam-sarmal DNA tüpler önemli ölçüde bu soruşturmalar kapsamını genişletiyor. Sadece lp temel malzeme değiştirmeden serbestçe değiştirilebilir, ancak DNA'ın doğasında programlanabilir doğa Glossar veya Kinetik anahtarlama işlemleri gibi ek öğeleri sistematik incelenmesi etkinleştirebilirsiniz. Ayrıca, bu tüpler suda çözünür ve yeterli pH ve algılanabilir bozulması9olmadan birkaç hafta iyonik koşullarında çoğu proteinler aksine, istikrarlı.
Bu tüpler birleştirmek için kullanılan DNA oligonucleotides ayrı bir kümesi, her biri iki komşu iplikçik için tamamlayıcı temel sıraları paylaşan iki etki alanı içeren (belirli dizileri nedeniyle, bir tek tel saç pins gibi yapıların oluşamıyor). Tamamlayıcı dizileri birbirine bağlı n çift sarmallı kesimleri kapalı, yarı üst üste halkaları oluşturan bir döngüsel şekilde melezlemek (şekil 1A ve B). Bu yüzük form Kesikli çapı (şekil 1 c) ve yarı üst üste yapılandırmalarını Aksiyel yapışkan uçlar başka bir yüzük yapışkan sonuna kadar tamamlayıcı gösterir. Oligonucleotides eşleşen bu seçmeli ek Yüzüklerin ipliksi DNA sarmalı tüpler boyutu n (nHT) etkili polimerizasyon için önde gelen bir istifleme tetikler. Kontur onların uzunlukları genellikle birkaç mikron uzunluğunda ölçmek ve onların uzunluğu dağıtım aktin filamentleri9,26,27,28karşılaştırılabilir. Onlar gerçekten de polimerizasyon Kinetik bu aktin filamentleri ve mikrotübüller benzer sergilemek için benzer DNA nanotüpler gösterilmiştir<su></su>p sınıf "xref" = > 29. Sayı n temel halka yapısı kadar yapma bireysel DNA iplikçiklerinin bağlı olarak, nHT mimari, hem de circumference ve diameter, controllably değiştirilebilir. Yüzük/tüpler çevresi artırır daha fazla DNA dizilerini kullanarak ve daha yüksek rijidite için karşılık gelen yüksek lp değerleri (şekil 1 c), mekanik özelliklerine karşılık gelen mimari değişikliği kaydırır. Mezoskopik ölçekte daha yüksek sertlik nedeniyle daha az bükülmüş biçimler bu büyük lp değerleri çevirmek (şekil 1 d ve E).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">AFM cantilever ACTA</td>
			<td style="width:196px;">AppNano</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">AFM - NanoWizard 3</td>
			<td style="width:196px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">CCD camera</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:123px;">iXon DV887</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">DNA oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequences see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:169px;">DNA Cy3-labeled oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequence see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E-9884</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Epi-fluorescence micro-scope</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">DM-IRB</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:169px;">MgCl2</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M-8266</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Mica &#34;V1&#34;, 12 mm round</td>
			<td style="width:196px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:123px;">50-12</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4306311</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">100x objective</td>
			<td style="width:196px;">Leica5</td>
			<td style="width:123px;">506168</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Purified water</td>
			<td style="width:196px;">Merk Millipore - Milli-Q &#38; Elix</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Sapphire PCR tubes</td>
			<td style="width:196px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">683271</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">TProfessional Standard PCR Thermocycler</td>
			<td style="width:196px;">Core Life Sciences Inc.</td>
			<td style="width:123px;">070- Standard</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">4351405</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Rheometer</td>
			<td style="width:196px;">TA Instruments</td>
			<td style="width:123px;">ARES</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">SYBR&#174; Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">S7567</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Tris</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T4661</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:169px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:123px;">X-100</td>
			<td style="width:180px;">Suppresses evaporation of sample at air-water interface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers

Mekanik özellikleri maddenin karmaşık, polimer esaslı yumuşak hücreleri veya biyopolimer ağlar, gibi ben de klasik çerçevede esnek polimerlerin ne de katı çubuklar anlaşılabilir. Temel filamentler hangi sebat uzunluğu (lp) sayısal, onların sigara ufuk omurga sertlik nedeniyle, uzanmış kalır ama onlar da güçlü termal dalgalanmalara tabidir. Onların sonlu bükme sertlik büyük kafes boyutları sağlarken, düşük hacimli kesirler istikrarlı iskele oluşumunu sağlayan toplu ağlarını, benzersiz, önemsiz olmayan toplu mekaniği yol açar. Bu temel prensip yüksek moleküler içeriği ve böylece diffusive kolaylaştırmak veya aktif taşıma en aza indirme (Örneğin, hücreleri veya doku), doğada yaygındır. Onların biyolojik etkileri ve Biyouyumlu hydrogels potansiyel teknolojik uygulamalar nedeniyle, semiflexible polimerler tabi önemli çalışma olmuştur. Ancak, ondan beri onlar gibi serbestçe ayarlanabilir değildir aktin filamentleri doğal polimerler dayanıyordu anlaşılır araştırmalar zorlu kaldı. Bu sınırlamalar rağmen ve sentetik, mekanik olarak ayarlanabilir ve semiflexible polimerler eksikliği nedeniyle aktin filamentleri ortak modeli sistem olarak kurulmuştur. Merkezi miktar lp serbestçe makroskopik toplu yapıları üzerindeki etkisini incelemek için ayarlı değil bir büyük kısıtlamadır. Bu sınırlama ile kontrollü filaman sertlik İLETİMLERİNİZE etkinleştirme yapısal olarak programlanabilir DNA nanotüpler istihdam ederek giderilmiştir. Onlar nerede kısmen tamamlayıcı iplikçikleri ayrı bir dizi melezlemek ayrı bir çevresi ile bir yüzük yapıda kiremit tabanlı tasarımlar meydana gelir. Bu halkalar yapışkan biter, etkili polimerizasyon filamentler içine birkaç mikron uzunluğunda, etkinleştirme özelliği ve benzer polimerizasyon Kinetik doğal biyopolimer görüntüler. Onların programlanabilir mekaniği nedeniyle bu tüpler lp tek molekül yanı sıra toplu ölçek etkisini incelemek için çok yönlü, yeni araçlardır. Aktin filamentleri, aksine onlar olmadan önemli dejenerasyon, hafta boyunca istikrarlı kalır ve kullandıklarında daha nispeten kolaydır.

DNA nanotüpler (Şekil 2) bir sıcaklık rampa üzerinden Meclisi bu yapay semiflexible polimerler oluşturmak için çok güvenilir bir yöntemdir. Bu polimerler gibi aktin filamentleri, doğal olarak meydana gelen karşılıkları için benzer özelliklere sahip ama mekanik özelliklerini controllably olabilir bu yana çok daha geniş bir deneysel çerçeve9,27 değişmiş sağlamak . Biyopolimer g...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers at JoVE.com

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Semiflexible polimerler canlı sistemler tarafından yaygın olarak uygulanan benzersiz mekanik özellikler görüntüler. Ancak, polimer sertlik gibi özellikleri erişilemez olduğundan biyopolimer sistematik çalışmalar sınırlıdır. Bu müsvedde filaman sertlik etkisi üzerinde deneysel çalışmalar etkinleştirme programlanabilir DNA nanotüpler tarafından bu sınırlama nasıl hile açıklar.

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

dna-nanotubes-as-a-versatile-tool-to-study-semiflexible-polymers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K Görüntüleme.  Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology. Semiflexible polimerler canlı sistemler tarafından yaygın olarak uygulanan benzersiz mekanik özellikler görüntüler. Ancak, polimer sertlik gibi özellikleri erişilemez olduğundan biyopolimer sistematik çalışmalar sınırlıdır. Bu müsvedde filaman sertlik etkisi üzerinde deneysel çalışmalar etkinleştirme programlanabilir DNA nanotüpler tarafından bu sınırlama nasıl hile açıklar.

Video: DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Aktif Hücre Kültürü Şekil Bellek Polimerler

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Biyomühendislik

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Cilt DNA Aşı Teslim İçin Yeni Bir Yaklaşım olarak Dövme

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...