Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (hibe # 606658) den RLM verilen hibe tarafından finanse edildi.

1.. Hücre Kültürü (Önceki BBB Kurul&#39;a 3-7 Gün) 1.1. İlköğretim İnsan Beyninin Mikrovasküler Endotel Hücreleri (BECS) BECS ticari olarak elde edildi. Hücreler, normal insan beyni korteks dokusu dispase ayrışma tarafından üretilen ve geçit 3 (&lt;12 nüfus ikiye katlama) de donduruldu sağlandı. <ol><li> Taban: üreticinin talimatlarına göre &quot;Ek Factor&quot; ile Coat doku kültürü gemiler. </li><li> Hücre bakım: serum-içeren komple ortam içinde BECS koruyun. Komple serum serbest ortamda deney, kültür BECS için. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 hücrelerin bakımı, 37 ° C&#39;de% 21 O 2 inkübatör Not: DMEM/F-12 15 mM HEPES,% 10 (v / v) cenin dana serumu (FCS) ile desteklenmiş iken özel bir tepkin bir alternatif olarak,% 0.1 (a / h) jelatin çözeltisi, bir kaplama maddesi olarak hizmet edebilir; 2 mM L-glutamin, 50 ug/ Ml gentamisin, 20 ug / ml heparin ve 20 ug / ml endotelyal hücre büyüme takviyesi BEC bakımı için de kullanılabilir. </li><li> Bir sonraki kullanım için amaçlanan süre (3-7 gün) bağlı olarak, 1:03-1:06 arasında bir oranda Bölünmüş birleşik BECS: deney için alt-kültürlenmesi. Her 3 günde bir bakım ortamı değiştirin. 15 geçitlerine BECS kullanın. </li></ol> 1.2. SVG İnsan Fetal astroglial hücre hattı SVG insan fetal astroglial hücreler, 22 orijinal olarak replikasyon-eksikli simian virüs 40 ile transforme edilmiş, insan fetal beyin primer kültürlerden elde edilmiştir. <ol><li> Bakım:% 20 (v / v) FCS (ebeveyn birincil hücreler 22 korumak için kullanılan aynı serum yüzde), 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin ve ilave edilmiş Earle dengeli tuz çözeltisi ile en az temel ortam içinde kültür SVG hücrelerin 50 ug / ml streptomisin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2,% 21 O2 hücreleri korumak </37 ° C&#39;de alt&gt; inkübatör </li><li> Bir sonraki kullanım için amaçlanan süre (3-7 gün) bağlı olarak, 1:05-1:10 arasında bir oranda Bölünmüş birleşik SVG lezyonu: deney için alt-kültürlenmesi. Tripsin çıkarılması nedeniyle ortam içinde yüksek serum içeriği gerekli değildir. Her 3 günde bir orta değiştirin. Kadar 20 pasajlara SVG lezyonu kullanın. </li></ol> 2. İnsan In vitro BBB Modelin Montaj ve Coculturing (Gün 0) Yorum: vitro temas BBB modelinde insan modifikasyonlarla, 13,23 yayınlanmış protokollere göre hazırlanır. 2.1. Eklemelerin Kaplama <ol><li> Birlikte 24 oyuklu plakanın kuyularda doku kültür ekleri (polyester gözenekli zar ile, çapı 6.5 mm, 3 um gözenek boyutlu) yerleştirin. Ekler Coat luminal yüzeyi <s> </s> gece boyunca fare kolajeni ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör I (20 ug / cm 2, 132 ug, 50 ul/ Ml kolajen Milli-Q su içinde% 0.02 asetik asit l (MQH 2 O)). Kalıntı asidi çıkarmak için MQH 2 O (abluminal ve luminal taraftan her ikisi birden) bir kez ekler yıkayın. Not: beyin kılcal damarların bazal membran hiçbir kollajen içeren ben ama esas laminins, kollajen tip IV isoformları, nidogens ve heparan sülfat proteoglikan 9. Bu nedenle, bazı araştırmacılar, kolajen IV, fibronektin 13 ya da daha gerçekçi bir Matrigel BBB modelleme (BD Biosciences) 16 gibi kaplama maddeleri kullanmaktadır. </li></ol> 2.2. Alt tarafı (abluminal) Membran Yüzey üzerinde tohumlama SVG lezyonu <ol><li> Ekleme ters çevirin ve yavaşça gözenekli membran elastik silikon boru kısa bir parça jantı etrafında uygun; de ablüminal yüzeyi üzerinde esas olarak yeni bir tane oluşturmak (&quot;dış boru&quot; yaklaşık 10 mm uzunluğunda, 8 mm iç çap, 1.6 mm duvar) (Şekil 2A). </li><li> Insert nee en altds medya kaçağı önlemek için kapalı olması. Plastik bir sızdırmazlık koni ile bir ucunda kapalı, ilk (Şekil 2B;, ~ 8 mm uzunluk, 3.2 mm iç çap, 1.6 mm duvar &quot;iç boru&quot; olarak adlandırılır), bir silikon boru yapılmış bir fiş (Şekil 2A ve 2B) hazırlanması (~ 3 mm uzunluğunda, bir 0.2 ml, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp alt kesim tarafından hazırlandı; Şekil 2B). bu koni iç boru lümen keçe, aynı zamanda ucun içine sıkı montaj için kenar genişletmektedir değil. Bu zardan up-~ 1-2 mm (Şekil 2A) ulaşana kadar Sonraki steril bir forseps kullanarak, lümen boşluğu ve önceden, içine silikon fişini takın. </li><li> Daha sonra, 200 ul SVG bakım ortamı içinde 4 x 10 4 SVG hücreler (tohum seşeklinde gösterilmektedir yukarıda 1.2.2) doğrudan de abluminal zar yüzeyi üzerinde silikon (Şekil 2A) içine. SVG lezyonu inkübatör içinde en az 4 saat boyunca yapışmaya izin verin. Not: sterilite iki adet 6 oyuklu plakalar içinde (diğer üzerinden ters bir plaka, Şekil 2C) arasında monte ekler taşıma muhafaza etmek için filtre işlemi sırasında havaya maruz kalmasını en aza indirmek için. Silikon borular ve prizler etanol içinde yıkandı ve daha sonra kullanılmak üzere otoklavlanır. Not: Kullanım fişleri sadece membran gözenek olan uçlar için (bölüm 2.2.2) 1 mikron daha büyük boyutları. 1 mikron ≤ gözenek çaplı membranlar nadiren sızıntı ve dış silikon tüp (bölüm 2.2.1) sadece montaj gerektirir. Buna ek olarak, kollajen dışındaki bazı kaplama maddeleri I (bölüm 2.1 nota bakınız) hatta 3 mikron gözenekleri sayesinde sızmaları engelleyebilir. Ampirik Bu belirleyin. </li><li> Da astrositlerin yapışması durumunu izlemek amacıyla, içine paralel olarak tohumastrosit hücre süspansiyonu standart 96 oyuklu özdeş bir hacim. Bu da 6.5 mm uç ile aynı yüzey alanına (0.33 cm 2) sahiptir ve membran çanağının daha faz-kontrast mikroskobu ile görselleştirme hücreleri daha kolay izin verir. Eğer kontrol astrosit yeterli yapışmasını gözlendiğinde 96-kuyu, astrositler yeterince insert zarı da yapıştırılır var. </li><li> Astrocytes yeterince 96-iyi kontrol yapıştığı zaman, (yukarıdaki nota bakınız) doku kültürü kaputu insert derlemeleri aktarmak ve hafifçe dış silikon tüp ve tıpaları çıkarın. 800 ul / oyuk BEC bakım ortamı (yukarıdaki bölüm 1.1.2) ihtiva eden birlikte kuyu içine normal (yani dikey) yöne ekler dönün. </li></ol> 2.3. Astrositler yukarıdaki Lüminal Odası&#39;na BECS ekme Kollajen kaplı lümen yüzeyi üzerine 200 ul ve böcek ö geri Seed 2x10 4 BECSinkübatör içine rts. 2.4. Coculturing Deney öncesi medya değişim olmadan BEC ortamda 3 gün boyunca SVG / BEC seribaşı ekler Coculture. 3. İnsan BBB Modeli ile Deneme (Gün 3) <ol><li> Sırasıyla 600 ul ve serumsuz BECS ortamın 100 ul ile abluminal ve luminal ortam değiştirerek in vitro BBB birinci yıkama hücrelerini teşvik etmek. </li><li> Yine orta luminal aspire ve uyarıcı maddeler ile serumsuz ortamın 100 ul ile değiştirin. Not: abluminal odasının uyarılması (astrositik bölmesinden in vitro aktive etmek için BBB) gerekli ise, abluminal ortam aspire ve uyarıcı maddeler bulunan serumsuz ortamın 600 ul ile değiştirin. </li><li> Lümen stimülasyon 3 x 100 ul gerektiren, yapılırsa, dolayısıyla (üç nüsha, her deney grubu test, biz yeniden seyreltilmesi tavsiye<html> kuyular arasında pipetleme hataları en aza indirmek için, grup başına, serum içermeyen ortam içinde 350 ul) içinde nihai konsantrasyonlara ajanlar. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi ve / veya TEER 13,16,25 ölçümü (ikincisi için biz floresein izotiosiyanat (FITC)-konjügeli albumin kullanın) standart paraselüler ve / ya da etiketlenmiş izleyici 16,24 arasında transsellüler geçirgenlik deneyleri yapın. </li></ol> Geçirgenliği (maksimum%) = (: taban geçirgenlik dalgalanmalara hesaba katılması için deneyler arasında, (maksimum geçirgenlik için bir referans olarak hizmet eder) hücreler olmaksızın kaplanmış bir ekleme için ve aşağıdaki formül kullanılarak araçla tedavi edilen gruba geçirgenliği nispetle değişiklikleri analiz araç grubunun ortalama geçirgenlik değeri) X 100 - araç grubu boş ucu) / (geçirgenlik değeri ortalama geçirgenlik değeri - geçirgenlik deneysel ekin değeri. 4. Gözenekli zarlara Hücrelerinin görselleştirme nt &quot;&gt; Yorum: insert zarlar üzerinde boyanmamış hücrelerin zar oldukça opak ve ışık iletimi engelleyen beri faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ile gözlemlemek zor olan biz hücrelerin çeşitli boyama yöntemleri geliştirmiştir bu konu ile ilgilenmek için. büyük zar üzerinde hücre görünümünü güçlendirmektedir. hala kuyularda, ekin bağlı iken. Zarlar, sadece montaj amaçlar için boyama işlemi sonunda çıkarılmalıdır Genel olarak, uç membranlar leke ekler. 4.1. Hematoksilen Boyama <ol><li> 20 dakika için, fosfat-tamponlu salin (130 mM NaCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7.2 PBS) (w / v) paraformaldehit (PFA), buz soğukluğunda% 4 ile ekler düzeltildi. PBS içinde bir kez yıkayın. </li><li> 2 dakika boyunca% 0.1 Mayer hematoksilin çözelti içinde ekleme daldırın. </li><li> Yavaşça ins daldırarak (musluk suyu ile yıkayın elemanınıBir kabı içeren musluk suyunda ert ve hafifçe) fazla suyu dışarı pipetleme. İstenilen mavi renk gelişene kadar 20 sn ~ için Scott&#39;ın musluk suyu çözeltisi (2 g / L NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) için ekleme aktarın. Musluk suyu (bölüm 4.1.3) ile tekrar insert yıkayın. İsteğe bağlı bir eozin boyama, bir musluk suyu yıkama, ardından 10 saniye boyunca% 1 çözeltisi içinde eosin ekleme daldırılarak burada dahil edilebilir. </li><li> Insert membran hava-kurutun. (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak ve aydınlık alan görüntüleme için bir cam slayt üzerine monte Not: di-N-butylphthalateinxylene (DPX) montaj orta kullanıldığı takdirde membran ayrılması ve monte etmeden önce, ksilen, ardından% 100 etanol ile ekleme yıkayın. </li></ol> 4.2. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) <ol><li> Buz soğukluğunda% 4 ile uçlar saptamak (ağırlık / hacim) 20 dakika boyunca PBS içerisinde PFA. PBS içinde üç kez yıkayın. </li><li> 30% 1 dakika (w / v için membranlar Post-fixMQH 2 O&#39;da) ozmiyum tetroksit </li><li> , Su (bölüm 4.1.3) içinde uçlar yıkayıp (zaman birimi için 10 dakika boyunca% 100 etanol ile 3 kez daha sonra% 50,% 70, her biri 5 dakika için% 90) giderek artan bir etanol gradyanı içinde kurutmak. </li><li> Etanol (01:02 sonra 02:01 5 dakika boyunca) heksametildisilazan (HMDS) içeren bir karışım ile susuz tedavi ekler. </li><li> 5 dakika, kurutulmuş koşullarında hava-kuru ve mağaza için 100% HMDS&#39;nin ile ekler davranın. </li><li> (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak. Taramalı elektron mikroskobu ile membranlar inceleyin. </li></ol> 4.3. İmmünofloresan <ol><li> (W / v) PBS içinde 20 dakika boyunca PFA, (, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 154 mM NaCl, 0.22 um filtre TBS) Tris-tamponlu tuzlu su içinde bir kez yıkayın buz soğukluğunda% 4 ile uçları düzeltildi. </li><li> 26, daha önce tarif edildiği gibi uç zar üzerinde hücrelerin immün yapın. </li><li> (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak ve ag üzerine montefloresan montaj ortamına ile kız slayt. Floresan mikroskop ile membran inceleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.</a> Neuron. 57, 178-201 (2008).</li><li>Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+plasminogen+activator+on+the+neurovascular+unit:+from+clinical+data+to+experimental+evidence.">Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).</li><li>Stewart, P. A., Wiley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+nervous+tissue+induces+formation+of+blood-brain+barrier+characteristics+in+invading+endothelial+cells:+a+study+using+quail--chick+transplantation+chimeras.">Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras.</a> Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).</li><li>Janzer, R. C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells.">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325, 253-257 (1987).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).</li><li>Girouard, H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+coupling+in+the+normal+brain+and+in+hypertension,+stroke,+and+Alzheimer+disease.">Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease.</a> J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+physiology,+pathology,+and+pharmacology.">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(muBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB).</a> Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).</li><li>Gaillard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+functional+characterization+of+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier,+comprising+a+co-culture+of+brain+capillary+endothelial+cells+and+astrocytes.">Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes.</a> Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).</li><li>Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+astrocytes+induce+the+expression+of+blood-brain+barrier+specific+proteins+by+autologous+endothelial+cells.">Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells.</a> Brain Res. 625, 238-243 (1993).</li><li>Demeuse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+coculture+of+rat+brain+endothelial+cells+and+astrocytes:+a+syngenic+model+to+study+the+blood-brain+barrier.">Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier.</a> J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).</li><li>Coisne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+syngenic+in+vitro+blood-brain+barrier+model:+a+new+tool+to+examine+inflammatory+events+in+cerebral+endothelium.">Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.</a> Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).</li><li>Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap+between+the+in+vivo+and+in+vitro+blood-brain+barrier+tightness.">Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness.</a> Brain Res. 1284, 12-21 (2009).</li><li>Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+blood-brain+barrier+by+glucocorticoids+and+the+cells+of+the+neurovascular+unit.">Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+endothelial+and+astrocyte+cocultures:+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+delivery+studies.">Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).</li><li>Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+In+Vitro+Models+of+Ischaemic+Stroke:+a+Test+Bed+for+Translation.">Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation.</a> Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).</li><li>Major, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+line+of+human+fetal+glial+cells+that+supports+JC+virus+multiplication.">Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).</li><li>Eugenin, E. A., Berman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-dependent+mechanisms+of+leukocyte+trafficking+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier.">Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier.</a> Methods. 29, 351-361 (2003).</li><li>Dehouck, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier:+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+models.">Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models.</a> J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin-induced+activation+of+astrocytes+in+mixed+rat+hippocampal+cultures+is+inhibited+by+soluble+thrombomodulin.">Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin.</a> Brain Res. 1381, 38-51 (2011).</li><li>Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endothelial+and+astrocyte+co-culture+model+of+the+blood-brain+barrier+utilizing+an+ultra-thin,+nanofabricated+silicon+nitride+membrane.">An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane.</a> Lab Chip. 5, 74-85 (2005).</li><li>Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=t-PA-specific+modulation+of+a+human+BBB+model+involves+plasmin-mediated+activation+of+the+Rho-kinase+pathway+in+astrocytes.">t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes.</a> Blood. , (2012).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine+increases+the+permeability+of+primary+mouse+cerebral+endothelial+cell+monolayers.">N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers.</a> Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nat. Med. 14, 731-737 (2008).</li><li>Yepes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+induces+opening+of+the+blood-brain+barrier+via+the+LDL+receptor-related+protein.">Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein.</a> J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke.">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li><li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke:+an+update.">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Beyin patolojileri içine Tıbbi araştırma çok öteleme zorluk çekiyor. Akut iskemik inme alanında, örneğin, hayvan modellerinde büyük söz gösterdi birçok ilaç klinikte 38,39 başarısız oldu. Bu hayal kırıklığı yaratan sonuçlar için nedenleri çeşitlidir ve insan inme senaryo ve hayvan çalışmaları 21 elde edilen sonuçların abartı için klinik öncesi test sistemleri aldatma içerir. Klinik faz klinik öncesi bulgular öngörü değerini artırmak için bir strateji ek ...

BBB periferik kan dolaşımı ve beyin hemostazın korunması için hayati sorumlu olan merkezi sinir sistemi arasındaki özel bir arabirimdir. Bu işlevsel beyin içine sıkı ve dinamik bir ağ geçidi oluşturmak için (aşağıda) birkaç hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından etkilenmektedir ki farklı beyin mikrovasküler endotelyal hücreler (BECS) içerir. Fizyolojik koşullar altında, BBB beyin içine, kan hücreleri, plazma komponentleri ve zararlı maddelerin, tüm potansiyel nörotoksik geçişini sınırlandırır. Buna paralel olarak, seçici olarak BBB tam beyin ortamı 1,2 korumak için, beyin ve dolaşım arasında önemli iyonları ve besin (glikoz ve amino asitler) ve metabolik atık ürünler değiştirir. Son yıllarda BBB yetmezliği gibi nörodejeneratif veya enflamatuar ile ilgili hastalıklar (örneğin, Alzheimer hastalığı ve multipl gibi kronik patolojiler beyin, çeşitli oluşur belirgin hale gelmektedire iskemik inme 4 gibi akut koşullarda yanı sıra), sırasıyla, 3, skleroz. Beyin endotel hücreleri (BECS) benzersiz BBB özellikleri büyük ölçüde onların beyin ortamında 5 ile oluşturulan ve özellikle de 6,7 ile astrositler edilir. Gibi diğer perisitlerin 8, nöronlar ve mikroglia 1,3 gibi hücre tipleri, hem de bazal membran 9, BECS desteklemek ve bir işlevsel birim &quot;nörovasküler birimi&quot; (NVU) olarak adlandırılan, birlikte giderek artan bir anlayış var ki aynı anda çiftler temin kılcal 10 metabolik ihtiyaçları nöronal. Patolojik durumlarda BBB katılımı BBB-ile ilgili araştırma 11,12 yardımcı vitro BBB modelleri geliştirmek için sayısız girişimde yatmaktadır. Bu modeller NVU prensibine göre vivo BBB özellikleri mümkün olduğu kadar yakın bir taklit eden ve. In vitro </em&gt; BBB modelleri genellikle (bir (çoğunlukla sığır 13, 14 insan, sıçan 15, fare 16, ve domuz 17,18 kökenleri) sıkı kavşak oluşturan BECS tek tabaka gözenekli bir zar üzerinde kültüre birlikte destek astrositlerde ile güveniyor yoğun ) Deli vd. 2005 11 tarafından incelendi. Astrositler kültür ortamı, yine çözünebilir faktörleri ile BECS 16 ile iletişim kurarak (membran üst yüzeyi üzerinde yetiştirilen) BECS ayrılan iyi bir doku kültürü, altındaki temassız şartlarında yetiştirilebilir. Daha iyi in vivo BBB anatomik yapısının benzer daha gelişmiş modellerde, astrositler temas koşulları ve doğrudan BECS 13,15,17 yakın (Şekil 1) &#39;de zarın karşı tarafında kültürlenir içinde muhafaza edilmiştir. Bu yapılandırma kurulmuş, BECS ve astrositlere arasındaki fiziksel temas sağlar zaman astrocytes projegözenekli membran yoluyla işler. Astrositik sonu-ayak küçük gözenek boyutları (yani 0,4 mikron) 14,15 geçemez beri önemlisi, ortaya gerçek bir temas için gözenekler, çapı 1uM ≥ edilmelidir. Özellikle, iletişim BBB sistemleri, trans-endotel elektriksel direnç (TEER) ve çeşitli izleyiciler 13,17,18 endotel geçirgenliği değerleri konusundaki temassız meslektaşları üstün olduğu bazı çalışmalarda gösterilmiştir. Ortam akımının ilave bir boyut yakın beyin damar 12,19 arasında yakın bir simülasyon için endotele kesme kuvvetleri uygulamak için in vitro BBB model bir dizi ilave edildi. Bir kişi BBB modeli oluşturulurken üstesinden gelmek için bir teknik engel gözenekli membranın ablüminal yüzeyinde yer çekimine karşı astrositlerin tohumlama olan. Astrocytes sadece bir in üstüne medyanın bir damla ekildi Önceki protokolleri 13,20,verted insert, izin, sadece kısa tohumlama kez doğru hücre eki için yetersiz olması bizim ellerde bulundu (yani 10 dk 13 ya da 2 saat 20). Bu temel yöntemi kullanılarak, daha uzun bir astrosit bağlantı süresi (sıcaklık, pH ve nem dalgalanmalara yol açması) inkübatör sık ​​açılması ile insertlerin sürekli izlenmesi gerekir ve nedeniyle gözeneklerden medya sızıntıya da düzensiz hücre ekimi eğilimli, özellikle 1 um &#39;den daha büyük gözenekler kullanılması durumunda. Burada, bir temas BBB modelinin hazırlanması için genel bir protokol açıklar. Bizim prosedür, yukarıda belirtilen sınırlamaları çözen ters ekler, on hücre tohumlama için alternatif bir yöntemi içerir. Bu yöntem uzun bir zaman süresi için, dengelenmiş bir inkübatör içinde, abluminal zar yüzeyi üzerine astrositlerin rahatsız yapışmasını sağlar. Bunun bir sonucu olarak, astrositlerin muntazam bir tohumlama bariyer kalitesini arttırır elde edilirve ekler arasında bazal geçirgenliği varyasyonlar en aza indirir. İnsan hücrelerinin kullanımı insan ilgili araştırmalar 21 için önemli olduğu için, ilave olarak bu makalede primer insan BECS yeni bir kombinasyonunun özel kullanımını göstermek ve bir yüksek veri akışı tarama kapasiteli bir temas insan BBB Model kurulması için insan astrositler ölümsüzleştirilmiş . Gözenekli membran üzerinde hücrelerin görüntüleme gözenekli membranlar üzerinde birleştiği ve hücre morfolojisi belirlenmesinde yardımcı olabilir zor, daha da ayrıntılı boyama teknikleri olabilir beri. BBB - Akut iskemik inme için bir tek tedavi seçeneği olarak hizmet veren bir pıhtı avı enzim - Nihayet, bizim insan BBB modeli doku tipi plazminojen aktivatörü etkisi (t-PA) incelemek için kullanılabilir nasıl örneklemektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

Kan-beyin bariyeri (KBB) sıkıca beyin ortamı kontrol geçirmeyen ama uyarlanabilir beyin kılcal damarları oluşur. BBB başarısızlık klinik ile ilgili araştırma yardımcı vitro BBB modellerinde insan gelişimi için bir ihtiyaç yaratarak, birçok beyin patolojilerin etiyolojisinde ima edilmiştir. Şimdiye kadar tarif edilen çok sayıda BBB modelleri arasında, (akış olmadan) statik, astrositler ve beyin endotel hücreleri (BECS) gözenekli zarın karşı tarafında kültüre edilir BBB modeli, iletişim, bir basitleştirilmiş simüle etmek için henüz otantik bir sistem olarak ortaya yüksek veri akışı tarama kapasiteli BBB. Yine bu modelin üretimi birkaç teknik zorluklar sunuyor. Burada, primer insan BECS ve ölümsüzleştirilmiş insan astrosit yeni bir kombinasyonunu kullanan bir kişi insan BBB modelinin hazırlanması için bir protokol açıklar. Özellikle, biz detay ters ekler üzerinde hücre tohumlama için yenilikçi bir yöntem olarak inser belirtmekt boyama teknikleri ve biz BBB-ilgili araştırmalar için bir model kullanmak nasıl örneklemektedir.

Bu endotel hücreleri 14,15,27,28 ile temas için astrosit uç feet geçişine izin vermek için gösterilen 3 mikron gözenek büyüklüğü ile gözenekli zarlar üzerinde SVG açıklığı ve BECS yetiştirmek için olan bir insan, temas BBB model kurmak için. Tam temas modelinin şematik bir temsili, Şekil 1 (resim sol) &#39;de gösterilmiştir. Bir iletişim sistemi tarafından sunulan temel teknik sorun, zarın ablüminal yüzeyinde yer çekimine karşı astrositler tohum ihtiyacıdı...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier at JoVE.com

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K Görüntüleme.  Monash University.  Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar. 

Video: Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Biyomühendislik

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Miyokard Enfarktüsü'nün Murine Modelinde 3Boyutlu Biyobaskılı Yama Transplantasyonu

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Doku hasarını azaltmak için yeni bir minimal invaziv yavaş enjeksiyon yöntemi

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Yazar Spotlight: Minimum İstila ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Minimum İnvazyon ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...