Bu çalışma CPF Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO) bir VIDI hibe sayısı H64.09.016 tarafından finanse edilmiştir. CPF onun eleştirel yorumlar ve taslakla ilgili düzeltmeler için Dr Silvina A. Fratantoni minnettardır. GMRDL / Emmm Hollandalı Teknoloji Vakfı NWO parçasıdır STW (proje 12151 ve 11350), ve hangi kısmen Ekonomik İşler Bakanlığı tarafından finanse edilmektedir tarafından desteklenmektedir. Biz yardım ve destek için Nikon Instruments Europe BV Catherine Kitts ve Peter Drent teşekkür ederim. HX hibe Bilimsel araştırma için Hollanda Örgütü (hibe 820.02.006) tarafından desteklenen Royal Dutch Sanatları ve Bilimleri Akademisi (hibe 11CDP10) ve WT tarafından desteklenmiştir.

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürleri hayvan acı azaltmak için optimize edildi ve Hayvan Deneyleri, Amsterdam Üniversitesi, Aralık protokol # DED204 ve DED250 için Komisyon tarafından onaylanmıştır. 1.. Lamel hazırlanması <ol><li> Bir 12-yuvalı plakanın yuvaları içine uyacak şekilde, bir karbür veya elmas bir çubuk kullanarak 15 mm x 15 mm&#39;lik bir boyuta lamelleri azaltın. </li><li> Bir çeker ocak içinde, çalışma sırasında tam bir cam kap içerisinde konsantre edilmiş nitrik asit solüsyonu (% 70 ağırlık / ağırlık) lamelleri daldırarak kaplama lamel başlar. Hatta dağıtım titremesini sağlamak için, daha sonra 4 saat arasında, en az inkübe edin. Bu yaklaşık 2 kere konsantre edilmiş nitrik asit çözeltisi tekrar kullanılması mümkündür, ama ışığa maruz kalma ile renk gevşek olabilir. </li><li> Konsantre nitrik asit çözeltisi dikkatli bir şekilde çıkarın ve her bir yıkamadan sonra çalkalanarak, 30 dakika için damıtılmış su içinde lamelleri dört kez yıkayın. </li><li> Dikkatli kaldırsu. Not: Bir sonraki üç adım steril bir laminer akış kabininde gerçekleştirilir. </li><li> % 96 EtOH lamelleri bekletin. EtOH çözümden lamelleri çıkarın ve kurumaya bırakın. </li><li> Lamelleri alev ve bir cam kaba koyun. Lamelleri (örneğin Dumont tarzı No.5 forseps) işlemek için ince forseps kullanın. </li><li> 180 ° C de 12-16 saat için bir kuru ısı fırın içinde alüminyum folyo ve fırında ile konteyner Kapak Sıkıca kapalı ise pişmiş lamelleri 1 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> 2.. Lamel Kaplama Lamel kaplama işlemi, cam yüzey ve dendritik arborization 14 nöron eki yanadır. <ol><li> Steril bir laminer başlık olarak, 12 oyuklu bir plakanın bir gözü içindeki tek tek lamelleri yerleştirmek için küçük steril bir forseps kullanır. </li><li> (Lamelleri daldırın ya da yeterli miktarda) 500 Poli-L-lisin çözeltisinin ul ekleyin. </li><li> T Wrapo buharlaşmasını önlemek ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakmak için alüminyum folyo ile plaka. </li><li> Kültür başlamadan önce, steril bir laminer kaputu dikkatlice Poli-L-lisin solüsyonu aspire. </li><li> Kurumasına engel iken, iki kez steril su ile 1 ml her bir oyuğa yıkayın. </li><li> Aspire su, tamamen orta kaplama 1 ml ekleyin ve hücreleri plaka hazır kadar doku kültürü inkübatör lamelleri bırakın. Bu, 24 saat içindeki hücreler, plaka önerilir. </li></ol> E16-E19 Rat embriyoların Brain 3.. Kaldırma <ol><li> Gece boyunca, kuru bir sterilizatör ısıtılarak veya% 70 EtOH ile yıkanarak cerrahi aletler sterilize edin. EtOH kullanıldığında iyice kurulayın. </li><li> 1x HBSS tamponu ile birkaç 30 mm yemekleri hazırlamak ve buz üzerinde saklayın. </li><li> (± 0.4 ml&#39;lik bir hacim içinde 160 mg / kg Euthasol) Euthasol bir intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçan baraj Euthanize. </li><li> Reflekslerin yokluğu kontrol edin. </li><li> % 70 EtOH ile baraj karın püskürtün. </li><li> Karın boyunca bir kesi yapmak ve rahim kaldırmak. </li><li> Rahim embriyolar çıkarın ve 100 mm çaplı petri koyun. </li><li> Büyük makas ile embriyoların başkanları çıkarın ve soğuk 1x HBSS tampon içeren yeni bir petri kafaları yerleştirin. Not: buradan prosedür, düzgün akış kabininde, steril koşullar altında gerçekleştirilir 7.1 adıma. </li><li> Büyük forseps ile kenarları boyunca başlarını basılı tutun. </li><li> Küçük bir makas ile, daha sonra yanal büyük bir forseps ile cilt soyma aşağı, baş üstüne deri bir sagital kesim yapmak. </li><li> Kafatası kaldırmak için adım 3.10 olarak aynı yaklaşımı kullanın. Kaudal sonunda başlayan bir sagital kesim olun; yavaşça beyin dokusuna zarar vermeden kafatasını açmadan. Uzak yanal beyin açığa kafatasının iki yarısını katlayın. </li><li> Künt spatula ile, beyin oymak ve taze soğuk 1x HBSS&#39;de yerleştirin. </li></ol&gt; Hipokamplardan 4. Diseksiyon Bu diseksiyon hücre canlılığı sağlamak için steril şartlarda mümkün olduğunca çabuk yapılır çok önemlidir. Buz üzerinde soğuk örnekleri tutun. <ol><li> Çıkarın ve ince makas ile beyincik atın. </li><li> Orta hat boyunca bir sagital kesim yaparak beynin iki hemisfer ayırın. </li><li> Her yarımkürede alın ve taze soğuk 1x HBSS içeren yeni bir 30 mm çanak hem yerleştirin. </li><li> Temporal lob yemeğin dibini bakacak biçimde her yarımkürede yerleştirin. NOT: Burada itibaren, bir mikroskop kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Yavaşça küçük bir forseps kullanarak Ortabeyin tutun ve forseps başka bir çift ile Ortabeyin çıkarın. Korteks ve hipokampus içeren sağlam hemisfer kalanını bırakın. </li><li> Hipokampus artık çanağın tabanı bakacak şekilde, doku ters çevirin. </li><li> Yavaşça p yarımkürede tutunince bir pens ile dantel. Başka bir ince forseps kullanarak, dikkatli ve yavaşça meninks çıkarın. Bu koku ampul başlamak daha kolaydır. Hipokampus zarar vermemek için dikkatli kullanın. </li><li> Hipokampus şimdi yukarı bakacak şekilde doku yönlendirin. Hipokampus şimdi karakteristik C-şekilli bir yapı ile görülebilir. </li><li> Ince forseps kullanarak, hipokampus teşrih. Taze soğuk 1x HBSS içeren yeni bir 30 mm çanak toplamak. </li></ol> 5.. Hücre Ayrılma ve Kaplama <ol><li> Küçük parçalar halinde doğrayın, sonra hippocampi toplam sayısını. </li><li> 3 ml 1 x HBSS içeren bir 15 ml santrifüj tüpüne parçalarını toplamak. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve dikkatlice süpernatant kaldırmak. </li><li> Hipokampus başına tripsin 6 ul ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de maksimum 20 dakika boyunca inkübe 3 dakika sonra çalkalanır. </li><li> Taze soğuk 1x HBSS&#39;de 5 ml ile iki kez yıkayın ve süpernatant atın. </li><li> Seco sonrand, yıkama, 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış kaplama ortamın 1.5 ml, ekleme Kaplama ortamdaki serum tripsin aktivitesi etkisiz olacaktır. </li><li> Doku bütün parçaları homojen bir hücre içine dağılmış kadar yavaşça bir ateş cilalı Pastör pipeti ile 30x çiğnemek. Herhangi köpüren kaçının. </li><li> Kaplama ve 5 ml ortam 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış </li><li> Bir Trypan mavi hayati lekeleme kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Bölüm 2 (toplam hacim 2 ml) içinde, orta kaplama 1 ml, 12-çukurlu plaka içinde çukur başına 50,000 hücre, tohum. </li><li> Yavaşça eşit hücrelerini dağıtmak için plakayı sallayın. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edilir,% 5 CO2. 2-3 gün sonra, 10 uM FUDR ihtiva eden kültür ortamı ile kaplama ortamın yarısı (0.5 mi) değiştirin. Not: dendritik omurga görüntüleme 16-17 gün sonra kaplama yapılır (in vitro 16-17 gün, DIV). </li></ol> Lipofektamin 6 kullanarak. Rat hipokampus İlköğretim Nöron Transfection <ol><li> GFP ve inkübasyon ortamı (Glutamax, 100 ul, Neuro temelli ortam 10 ml) ifade eden plasmid DNA hazırlanması. </li><li> 37 ° C&#39;ye ön-kuluçka ortamı sıcak </li><li> DNA karışımı (Tüp A) hazırlayın. Her bir lamel için düz Neurobasal ortamın 100 ul içinde 1 ug DNA ekleyin. Hafifçe karıştırın. </li><li> Lipofektamin karışımı (Tüp B) hazırlayın. Her bir lamel için düz Neurobasal ortamın 100 ul 2 ul Lipofektamin ekleyin. Hafifçe karıştırın. </li><li> DNA karışımı damla damla Lipofectamine karışımını ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için laminar akış başlığı içinde inkübe edin. </li><li> 1 plaka önceden ısıtılmış inkübasyon ortamının 1 ml ilave edilir. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca deposu plakası 2,% 5 CO2. </li><li> Yavaşça DNA / Lipofectamine 200 ul her bir göze karıştırın ve 37 ° C,% 5 CO2 &#39;de 45 dakika boyunca inkübe damla damla ekleyin. </li><li> Küçük forseps kullanımı coversli asansör ileps nöron içeren ve taze sıcak Neurobasal ortamı içeren bir 3 cm çanak onları daldırma ile durulayın ve 2 plaka taşıyın. </li><li> 37 ° C, 48 saat boyunca% 5 CO2 de transfekte nöronlar inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon etkinliği için transfeksiyondan 24 saat sonra kontrol edin. </li></ol> 7. İmmünoboyama ve Montaj Sıçan Hipokampal İlköğretim Nöronlar Transfekte hücrelerde fluoresans yoğunluğu geliştirmek için, GFP algılamasını, transfeksiyondan 48 saat sonra geliştirmek için bir immüno-boyama protokolü gerçekleştirin. <ol><li> % 4 PFA ve 0.05 M TBS hazırlayın. </li><li> 37 ° C&#39;ye% 4 PFA çözeltisi Sıcak </li><li> Yavaşça lamelleri içeren kuyulardan ortam aspire. </li><li> Dendrite zarar görmesini önlemek için dikkatli bir şekilde sıcak% 4 PFA 500 ul ekleyin. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 1 x HBSS ile 3 kez yıkayın. Not: bu noktada numune, 4 ° C&#39;de 3 haftaya kadar depolanabilirveya İmmünbüyanmanın hemen başlamış olabilir. </li><li> Numuneler saklanmıştır ise, 5 dakika boyunca 0.05 M TBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında TBS-BSA (% 1) çözeltisi ile bloke edin. </li><li> 5 dakika için 0.05 M TBS ile 3 kez yıka. </li><li> Kuluçka karışımı içinde seyreltilmiş birincil antikor ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Bundan başka, bir gece boyunca inkübe nazik çalkalama ile 4 ° C&#39;de. </li><li> Birincil antikoru çıkarın. </li><li> 5 dakika için 0.05 M TBS 3x ile yıkayınız. NOT: Bu noktadan itibaren, ışıktan korumalı lamelleri tutmak. </li><li> Kuluçka karışımı içinde seyreltilmiş ikincil floresan-konjuge antikor ekleyin. </li><li> 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Ikincil antikor çıkarın. </li><li> 5 dakika için 0.05 M TBS ile 3 kez yıka. </li><li> 5 dakika için 1X TB ile 2 kez yıkayın. </li><li> Kuyulardan lamelleri kaldırmak için ince cımbız kullanın. </li><li> Bir doku ile TB fazlalıkları kurulayın ve cov montemontaj orta kullanarak erslips. </li><li> Montaj orta buharlaşmasını önlemek için tırnak cilası ile mühür. </li></ol> 8. Dentritik Omurga Görüntüleme Yapı Aydınlatma Mikroskopi kullanarak Karşılaştırıldığında çözünürlükte 2 kez iyileşme faktörü sağlayarak, 250 nm - materyallerde tarif SIM sistemini kullanarak dendritik omurga görüntüleme yanal çözünürlük yaklaşık 85-110 nm (XY) değer ve 200 arasındaki eksenel (Z) çözünürlük değeri vardır geniş alan mikroskobu. NOT: SIM kullanarak dendritik omurga görüntüleme 2 gün adım 7.22 sonra genellikle yapılır, ancak numuneler karanlıkta ve 22 kontrollü bir sıcaklık altında tutulur eğer daha sonra 3 hafta kadar yapılabilir - 23 ° C <ol><li> 488 nm lazer, civa lamba, sahne denetleyicisi, piezo kontrolör, iletilen ışık için halojen lamba ve bilgisayarı açın ve &quot;ANDOR N-SIM için&quot; modunda SIM yazılımını başlatın. </li><li> 100x TIRF nesne temizlemek% 95 etanol ile üç kez ive ve petrol eter ile gerekirse. </li><li> 488 dikroik ile 520 LP: Aşağıdaki filtre ayarlarını kullanın. </li><li> Amaç üzerinde daldırma bir damla yağ koyun. Petrol-açılan hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Yağ örneği değene kadar yukarı hedefi taşıyın. Not: yerleştirin ortam ışıktan örnek korumak ve mümkün olduğunca odasında ışıkları loş sahne üzerinde bir kapak. </li><li> PSF en iyi simetrisini elde etmek üzere, 37 ° C, 200 um objektif düzeltme yaka ayarlayın. Doğru yaka pozisyonunu, ilk pozisyonunu optimum nominal konumda objektif halka ayarlayın ve sonra 100 nm boncuk örneği kontrol etmek için. Iyi PSF en simetri göre, hafifçe anma birinin etrafında yaka pozisyonunu değiştirin. </li><li> Aydınlatma, 3D-SIM ızgara (100X/1.49 tüm dalga boylarında 1layer 3D) kullanın. 1 ile, SIM aydınlatıcı içine ızgara hizalama yerde seçilen ızgara bloğu başlamak içinYerine 00X 1.49 objektif. Görüntüsü (FOV) bir alan için 10-15 boncuk izole izin veren bir konsantrasyon ile, ortam içinde monte edilmiş bir 100 nm boncuk örnek kullanın. Istenilen konuma objektif düzeltme yaka ayarladıktan sonra, 3D-SIM aydınlatma seçin ve yazılım güdümlü hizalama işlemini başlatmak. Bu (1 yönü) x (100 z-düzlemleri) bu boncuklar ile FOV&#39;yi yeniden hangi görüntüleri, x (5 evrelerini) çalışacaktır. Out-of-odak bulanık ışık da dahil olmak üzere tüm boncuk kapsayan, uygun bir yatırım getirisi üzerinden tek bir boncuk seçtikten sonra, yazılım uydurma bir otomatik PSF başlayacak ve sonuca göre ızgara konumunu ayarlamak olacaktır. </li><li> Mikroskop performansını kontrol etmek, çünkü tablo hareketleri ve / veya sıcaklık sürüklenen kaynaklanan olası karışmalar arasında ızgara uyum her 2 haftada bir tekrarlayın. Dahası, aynı zamanda üreticinin önerilerine göre lazer yoğunluğunu ve stabilite kontrol. </li><li> % 95 ETH ile numune yüzeyini temizleyinüç kez Anole. Not: Sonraki adımlar, kontrol panelleri ve SIM yazılım içinde doğru ayarlara genel bir bakış için Şekil 3&#39;e bakın. </li><li> SIM yazılım, optik Yapılandırma Göz FITC seçin ve beyaz ışık ile görsel inceleme için taret 1 boş bir filtre bloğu seçin. </li><li> Odaklama hızını ve XY masaya &quot;Güzel&quot; seyahat hızını ayarlayın. </li><li> Deklanşörü açın ve hızlı bir örnek üzerinde odaklanmak. </li><li> Tekrar deklanşöre kapatın ve ayarlamak sıfıra Z-koordinat. </li><li> Yeşil kanalı kullanılarak görsel inceleme için taret 1 yeşil filtresini seçin. </li><li> Düşük ayara cıva lamba yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Nesnel dolgu macunu temas etmez emin, dikkatli numunenin sınırına taşıyın. </li><li> Deklanşörü açın ve hızlı bir şekilde mümkün olan en düşük yoğunluğu ile numune boyunca tarama. </li><li> Ilgi yeterince aydınlık dendrit karşılaşma ve ilgi bir segment merkezleme Upongörüş alanında, deklanşör kapatın. </li><li> , Mod EM-okumak 1 MHz 16-bit kazanmak, pozlama süresi 100 msn, lazer güç% 5 ve EM 200 kazanmak için Optik Yapılandırma 3D-SIM 488 ve kamera ayarları için yazılım ayarlayın. NOT: Ayna üzerindeki 2 yeşil filtre seçili olduğunu kontrol edin ve Kule 1 boş olduğunu. </li><li> Izgara &#39;taşıma&#39; olarak ayarlanmış olduğundan emin olun ve lazer ışığı ve kamera ile örnek görmek için tıklayın Canlı. </li><li> Yukarı Bak Tablo etkinleştirin. </li><li> Gerekirse ilgi nesneyi ortalamak ve Ekstra İnce ayarında odaklama hızı ile odak. NOT: okuma-out modda EM 1 MHz 16-bit kazanmak, iyi bir SIM görüntü için hedef yoğunluk 30,000-45,000 arasında. </li><li> Çabuk EM 1 MHz 16-bit kazanç Okuması modda 30,000-45,000 arasında bir yoğunluk değeri elde etmek için kamera ayarlarını. İlk olarak kullanımı: <ol><li> Lazer gücü:% 0 - 20% (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan numuneler,% 5 ya da 2.6 mW ile yeterlidir) </li><li> Pozlama süresi:50 msn-2 sec </li><li> Oku-out modu: EM 1 MHz 16-bit kazanmak </li><li> EM kazanç: 0-300 </li><li> Dönüşüm kazanç: 1x - 5.1x </li><li> Live için Format: Hayır binning </li><li> Yakalama için Format: Hayır binning NOT: Bu ayarlar ile% 1,3 beyazlatma ± 6.3% rutin önemli ölçüde görüntü kalitesini 15 etkileyecek kabul edilebilir maksimum beyazlatma,% 10 sınırı içinde elde edilir. </li></ol></li><li> Canlı görünümü kapatmak için Durdur tıklayın. </li><li> ND Sıra panelinde 3B Z yığının ayarlarını yapılandırın: <ol><li> Menzil: 2 mikron </li><li> Boyut: 120 nm </li><li> Z düzlemi </li><li> Ev konumunu tıklayın </li><li> Lambda bölümünde Optik Yapılandırma 3D-SIM 488 seçin </li></ol></li><li> N-SIM pedi edinim mod olarak 3D-SIM seçeneğini seçin. </li><li> ND Dizi edinimi çalıştırın ve ham verileri kaydetmek. </li><li> Tekrar Optik Yapılandırma Göz FITC seçin ve tüm numune görüntülenmiştir kadar tekrar 8,15-8,27 adımları</li><li> 3D Görüntü rekonstrüksiyonu: adım 8.23 ​​edinilen veriler ya hemen ya da daha sonra yeniden inşa edilebilir. Yeniden İnşa Dilim veya Yeniden İnşa Yığın modunda varsayılan ayarlarla yeniden Z yığını yeniden başlayın ve gerekirse ayarlayın. NOT: En iyi sonuçlar için, Z yığınlarının belirtilen adım büyüklüğü ile yapılmalı ve Yeniden İnşa Stack modunda yeniden. Her ham veri, veya tercihen, bir geniş alan görüntüye karşılaştırarak yeniden oluşturulan görüntünün geçerliliğini kontrol edin. Yeniden yapılanma süreci için ayarlanabilir parametreler kontrast ve yüksek frekanslı gürültü bastırma vardır. İkisi farklı ham görüntü özelliklerini yeniden yapılanma sürecinde dikkate alınır nasıl etkilemektedir. Düşük modülasyon derinliği ham veri durumunda, kontrast parametre önemli bir rol oynar. Kullanıcının düşük sinyal-gürültü oranı ile veri setlerini varsa, yüksek frekanslı gürültü bastırma parametre çatılmayı etkileyebilir severely. </li><li> Ne zaman bitmiş, merkezi XY aşamasında görüntüleme ve tüm yol aşağı dinlenme pozisyonuna amacı taşıyın. </li><li> Örnek çözün ve% 95 etanol ile ve örnek amacı hem temizleyin. </li><li> Yazılım ve PC kapatın ve diğer tüm cihazları kapatın. </li><li> Elde edilen görüntü 3d imar ve omurga sınıflandırma NeuronStudio yazılımı kullanmadan önce açıklandığı gibi 16 (bkz. Şekil 4) TIFF dosya dönüştürme sonra yapılabilir. </li><li> NeuronStudios yazılım rekonstrüksiyon için aşağıdaki parametreleri kullanın: <ol><li> Hacim: Voxel ölçüleri: X: 0.03 mikron; Y: 0,03 um; Z: 0.120 mikron. </li><li> Dendrite algılama:; 1.3: oranını takın Minimum uzunluğu: 5 mm; Discretization Oranı: 1; Kavşaklar realign: Evet. </li><li> Minimum yükseklik: algılamayı Sırta 0.2 mikron; Maksimum yükseklik: 5.001 mikron; Maksimum genişlik: 3 mikron; Minimum güdük boyutu: 10 vokselin; Asgari olmayan güdük boyutu: 5 voxels. </li><li> Boyun oranı (baş-boyun oranı): Sınıflandırıcı Omurga 1.1; İnce Oranı: 2.5; Mantar boyutu: 0.35 mikron; </li></ol></li><li> Neurite köşe şekli: render için kullanılan NeuronStudio parametreler katı eclipse; Nörit köşe renk: türüne göre; Nörit kenar şekli: çizgi; Nörit kenar color: tek renk; Şekil Omurga: katı eclipse; Omurga color: türüne göre. Not: 3D rekonstrüksiyon o ses işlemek ayarlamak da mümkündür sonra. Varsayılan eşik aktif &#39;Regenerate volume rendering&#39; seçeneği ile 20 kurulmuştur. Saydamlık kontrol &#39;Otomatik Şiddeti&#39; tarafından kuruldu. &#39;Yüzey sadece&#39; ve &#39;Use Nokta Pre-Rendering&#39; seçenekleri de aktifti </li></ol>

<ol>
	<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).</li><li>Dailey, M. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+dendritic+structure+in+developing+hippocampal+slices.">The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices.</a> J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li><li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity.">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61, 85-100 (2009).</li><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitr&#228;ge+zur+Theorie+des+Mikroskops+und+der+mikroskopischen+Wahrnehmung.">Beitr&#228;ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.</a> Archiv f&#252;r mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .</li><li>Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I5M:+3D+widefield+light+microscopy+with+better+than+100+nm+axial+resolution.">I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution.</a> J Microsc. 195, 10-16 (1999).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+modulated+excitation+microscopy:+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).</li><li>Karadagli&#402;&#225;, D., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+formation+in+structured+illumination+wide-field+fluorescence+microscopy.">Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy.</a> Micron. 39, 808-818 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).</li><li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy.">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat Methods. 6, 339-342 (2009).</li><li>James, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+microcontact+printing+of+micrometer-scale+poly-L-lysine+structures+for+controlled+growth+of+cultured+neurons+on+planar+microelectrode+arrays.">Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).</li><li>Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+detailed,+cell-specific+neuroanatomy+of+dendritic+spines+using+microinjection+and+confocal+microscopy.">High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).</li><li>Fitzsimons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+the+glucocorticoid+receptor+alters+functional+integration+of+newborn+neurons+in+the+adult+hippocampus+and+impairs+fear-motivated+behavior.">Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior.</a> Mol Psychiatry. , (2012).</li><li>van Hooijdonk, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transgene+delivery+to+the+hippocampus+reveals+sub-field+specific+differences+in+expression.">Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression.</a> BMC Neurosci. , (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li><li>Izeddin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dynamic+imaging+of+dendritic+spines+using+a+low-affinity+photoconvertible+actin+probe.">Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda SIM kartını kullanarak, in vitro olarak kültürlenen fare birincil hippokampal nöronlar görüntü dendritik dikenler için bir çalışma protokolü tarif edilmektedir. Primer hipokampal nöron kültürü yöntemi KAECH ve Banker 18 tarafından açıklanan orijinal yönteminin bir uyarlamasıdır. Brewer ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 19 ana fark, Neurobasal/B27 kültür astroglial besleyici kültürlerin ortam gereksinimini ortadan kaldırır, ve g...

Bir dendritik omurga nöron zarın küçük bir çıkıntı olduğu. Bu karakteristik yapı, genellikle tek bir sinaps giriş almak için uzman ve iki nöronlar arasındaki fiziksel temas alanını temsil eder. En çok işlevsel olgun dendritik dikenleri bir küresel ucu, kafa olarak adlandırılan ve dendritik mile baş bağlayan ince bir boyun içerir. Ancak, dikenler statik değildir ve aktif hareket ve hatta yetişkin beyninde 2 sürekli kendi morfolojisi değiştirin. Bir zaman 2 haftalık süre içinde, geç embriyonik ya da erken doğum sonrası zaman türetilmiş sıçan primer hipokampal nöron kültürleri omurga benzeri yapıların 3 erken filipodia gelişmeye çok sayıda membran çıkıntılar ile karmaşık dendritik milleri gelişir. Bu dinamik davranış ve diğer özelliklerine göre, dendritik dikenler bellek depolama ve sinaptik transmisyon 4,5 &#39;için anatomik bir alt-tabaka temin ettiği düşünülmektedir. Inci göz önüne alındığındadendritik omurga boyutu ve şekli sinaptik fonksiyon, doğru boyutlarını ölçmek için önemli olduğunu e kritik rolü. Dikenler uzunluğu yaklaşık 200 ile 2000 nanometre arasında değişir ve hali hazırda konfokal lazer tarama floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Ancak, uzunluğu dışındaki omurga boyutları genellikle teorik 200 nanometre yaklaşık 6 difraksiyonu ile sabit geleneksel optik sistemlerinin çözünürlük, aşağıda belirtilmiştir. Bu çözme güçler, omurga boyunları ve kafaların genişliği gibi ince ayrıntıları, görüntüleme için yetersizdir. Çok iş bu sorunu çözmek için tahsis edilmiştir ve birçok nispeten yeni süper çözünürlük mikroskopi teknikleri önemli bir ilerleme sağladı. Özellikle, bir geniş alan, non-konfokal mikroskop 7-10 yanal olarak yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanarak herhangi bir ışık emisyon göz ardı etmeden, klasik sınırı aşan bir çözünürlük elde etmek mümkündür. Non-linea ile birlikte bu teknik kullanılarak,r mikroskopi teknikleri, sınırsız bir faktör 11 ile optik mikroskop yanal çözünürlüğü artırmak için teorik olarak mümkündür. Bununla birlikte, pek çok deneysel koşullar altında, iki 1 SIM bir faktör ile çözünürlük limiti aşmak için izin verir. Böyle uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi 12 ve foto-aktivasyon yerelleştirme mikroskobu (PALM) 12 gibi diğer süper çözünürlüklü optik mikroskopi teknikleri dendritik dikenler görüntüleme uygulandı. Palmiye gibi yerelleştirme-tabanlı yöntemler süper çözünürlük elde etmek için ham görüntülerin çok sayıda gerektirir ve bu nedenle hız sınırlıdır. Öte yandan, STED&#39;in, yüksek görüntüleme hızı elde edebilirsiniz nispeten düşük foton sayıları ve SIM 13 için böyle olmayabilir bakış küçük alanlarda, rağmen. Bu yazıda amacı, in vitro kültürlenmiş fare birincil hippokampal nöronlar görüntü dendritik dikenler için çalışan bir protokol sunmaktır </em&gt; SIM kullanarak. Kurulması, geliştirilmesi, transfeksiyonla ve sıçan primer hipokampal nöron kültürlerin imünohistokimyası ve görüntüleme örnek adanmış bir geç fazda oluşan bir ilk bir: Protokol, iki ayırt aşamadan oluşmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with illumination</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature dry-oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator (5% CO2, 37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon structured illumination microscope setup consisting of:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Stage Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCL Nano-Drive piezo controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Microscope Enclosure temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor EM-CCD Camera iXon DU897</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with Microsoft Windows 7 Home Edition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon&#8217;s NiS Elements 6.14 SIM software package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon type A immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy

Dentritik dikenler bir nöronun dendrit çıkan çıkıntılar ve beyinde uyarıcı girdilerin birincil postsinaptik hedeflerini temsil eder. Teknolojik gelişmeler nöron bağlantısı ve sinaptik plastisite kilit unsurlar olarak bu yapıları belirledik. Işık mikroskopisi kullanılarak omurga morfolojisi kantitatif analiz dolayı ışığın intrinsik kırılma limitli ilgili teknik sınırlamalara önemli bir problem olmaya devam etmektedir. Dentritik dikenler kolayca konfokal lazer tarama floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Uzunluğundan daha başka omurga boyutları genellikle 200 nm ışık mikroskobu teorik çözünürlük limiti ile sabit bir geleneksel optik çözünürlük daha küçüktür Ancak, dikenler şekil ve boyut olarak ince değişiklikleri ölçmek zordur. Yakın zamanda geliştirilen birçok süper çözünürlük teknikleri dendritik dikenler de dahil olmak üzere 200 nm &#39;den daha küçük bir görüntü hücresel yapılara kullanılmıştır. THese teknikleri klasik uzak alan işlemlere dayalı ve bu nedenle bir numunenin yüzeyinin ötesine mevcut numune hazırlama yöntemlerinin ve görüntü kullanımına izin verir. Burada anlatılan primer hipokampal nöron kültürlerinde dendritik dikenler görüntüleme süper çözünürlük yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) uygulamak için bir çalışma protokoldür. SIM Olası uygulamalar konfokal mikroskopi olanlar ile örtüşmektedir. Ancak, iki teknik farklı uygulanabilirliğini sunmak. Konfokal mikroskopi nedeniyle fiziksel bir iğne deliği kullanımına, odak ışığın dışarı çıkarılma pahasına çözünürlük iyileşme elde ederken SIM, daha etkin yanal çözünürlük sunuyor. Bu protokol, birincil nöronlar DNA plasmidleri floresan proteinleri kodlayan ve SIM kartını kullanarak görüntülü ile transfekte edilmiş bir standart protokol kullanılarak cam lameller üzerinde kültürlenmiştir. Dendritik dikenler, in vitro olarak 16-17 gün sonra, ne zaman görüntülü, çünkü burada tarif edilen tüm protokol, yaklaşık olarak 2 hafta sürerdendritik gelişim uygunudur. Protokolünün tamamlanmasından sonra, dendritik dikenler özel yazılımlar kullanarak, SIM görüntü yığınlarının serisinin 3D olarak yeniden inşa edilebilir.

Burada tarif SIM kullanılarak in vitro fare birincil hippokampal nöronların dendritik dikenler görüntülenmesi için standart bir çalışma protokoldür. Protokol akışı ve önemli aşamalar, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Genel olarak, iletişim kuralı Kültür, gelişim ve fare birincil hippokampal nöronlar ve immünohistokimya transfeksiyonu da dahil olmak üzere örnek hazırlama bir birinci faz, ayrılmış deneysel çalışma, yaklaşık 2 hafta sürer ve ikinci aşama SIM k...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy at JoVE.com

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

imaging-dendritic-spines-rat-primary-hippocampal-neurons-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K Görüntüleme.  University of Amsterdam.  Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar. 

Video: Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Nörobilim

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the mechanisms of synaptic plasticity in dendritic spines. In this protocol, the detailed 3D structure of the dendrites and dendritic spines is modeled with meshes on the software Blender with CellBlender. The synaptic and extrasynaptic regions are defined on the mesh. Next, the synaptic receptor and synaptic anchor molecules are defined with their diffusion constants. Finally, the chemical reactions between synaptic receptors and synaptic anchors are included and the computational model is solved numerically with the software MCell. This method describes the spatiotemporal path of every single molecule in a 3D geometrical structure. Thus, it is very useful to study the trafficking of synaptic receptors in and out of the dendritic spines during the occurrence of synaptic plasticity. A limitation of this method is that the high number of molecules slows the speed of the simulations. Modeling of dendritic spines with this method allows the study of homosynaptic potentiation and depression within single spines and heterosynaptic plasticity between neighbor dendritic spines.

The protocol develops a three-dimensional (3D) model of a dendritic segment with dendritic spines for modeling synaptic plasticity. The constructed mesh can be used for computational modeling of AMPA receptor trafficking in the long-term synaptic plasticity using the software program Blender with CellBlender and MCell.

Sinaptik Plastisite ile Dendritik Dikenlerin 3D Modellemesi

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...