Bu protokol, C.elegans nöronlarındaki dendritik omurga morfolojilerini ve kalsiyum geçicilerini görselleştirmek için yöntemleri açıklar. Yaklaşımımız, omurga morfogenezi ve fonksiyonunun belirleyicilerini keşfetmek için genetik yaklaşımları kolaylaştırmalıdır. Protokolümüz GABAerjik nöronlarda dendritik dikenlere sahiptir.
C.elegans nöronlarının diğer sınıflarındaki dikenler de bu yöntemlerle araştırılabilir. Protokolümüz canlı C.elegans'ı hareketsiz hale getirme yöntemlerini açıklamaktadır. Görüntü elde etme sırasında hayvan hareketini önlemek ve nöronal aktiviteyi heyecanlandırmak ve kaydetmek için doğru lazer konfigürasyonlarını seçmek özellikle önemlidir.
Yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için, üç mikrolitre anestezik çözelti ekleyin ve% 10 agaroz pedleri üzerinde 15 ila 20 genç yetişkin solucan miktarı. Daha sonra solucanları hareketsiz hale getirmek için kapak kaymasını uygulayın ve kapak kayma kenarlarını erimiş bir yapışkan sızdırmazlık maddesi karışımı ile kapatın. Süper çözünürlüklü bir elde etmek için, süper çözünürlüklü mikroskopi ile donatılmış bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın.
Üreticinin yazılımı tarafından önerilen adım boyutunu kullanarak Z yığınları edinin. Dorsal D veya DD ventral işleminin toplam hacmini kapsayan bir dizi optik bölüm toplayın. Üreticinin yazılımını kullanarak görüntü işleme için Z-yığınlarını gönderin ve yediden yüksek puan alan görüntüleri analiz edin.
Nyquist alımı için, bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın ve ışığın dalga boyu ve objektif lensin sayısal açıklığı için en uygun piksel boyutunu seçin. Ardından, otomatik bir algoritma kullanarak yığını 3B dekonvolüsyon için gönderin. Görüntü analizi için, Z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonlarını oluşturmak için uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanın.
DD dendrit üzerindeki çıkıntıları manuel olarak sayın. Ardından, 10 mikrometre DD dendrit başına dikenlerin yoğunluğunu hesaplamak için puanlanan DD dendritin uzunluğunu belirleyin. Daha sonra dikenleri ince veya mantar, filopodial, inatçı veya dallı olarak sınıflandırın.
Mikroenjeksiyon gibi geleneksel teknikleri kullanarak, DD nöronlarında kalsiyum sensörü GCaMP'yi eksprese eden transgenik solucanlar ve presinaptik VA nöronlarında kırmızıya kaymış bir kanal rodopsi olan Chrimson oluşturun. Daha sonra, laminer bir başlık altında, her 60 milimetre nematod büyüme ortamı besin agar plakasına 300 mikrolitre gece boyunca yetiştirilen OP50 bakteri kültürü ve 0.25 mikrolitre ATR ekleyerek tüm trans-retinal veya ATR plakalarını hazırlayın. Sonra kültürü steril bir cam çubukla yayın.
Kontrol plakaları için 300 mikrolitre OP50 bakteri ve 0.25 mikrolitre etanol ekleyin. Bakteri üremesine izin vermek için, plakaları ortam ışığından korunarak 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Deneyi kurmak için, OP50 tohumlu ATR veya kontrol plakalarına beş L4 aşaması larvası yerleştirin ve plakaları karanlıkta 23 santigrat derecede inkübe edin.
Üç gün sonra, vulva gelişimini doğrulamak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın ve görüntüleme için ATR'den L4 evre soyu ve kontrol plakalarını seçin. Daha sonra, bir mikroskop slaytına iki mikrolitre 0.05 mikrometre poliboncuk yerleştirin. Ve çözeltiye yaklaşık 10 L4 larva yerleştirin.
Bir platin tel kullanarak, çözeltiye küçük bir süper yapıştırıcı küresi ekleyin. Filamentli tutkal iplikçikleri oluşturmak için çözeltiyi yavaşça döndürün. Ardından üç mikrolitre M9 tamponu ekleyin.
Ardından bir kapak kayması uygulayın ve daha önce gösterildiği gibi kenarlarını kapatın. Dendritik dikenlerde uyarılan kalsiyum geçicilerini kaydetmek için, dönen bir disk konfokal mikroskop kullanın ve DD dikenlerini odak düzleminde konumlandırmak için mikroskop aşamasını ayarlayın. Ardından, GCaMP floresansını tespit etmek için her karede 488 nanometrelik bir lazer çizgisi ve Chrimson uyarımı için periyodik aralıklarla 561 nanometrelik bir lazer hattı ile numuneyi aydınlatmak için hızlandırılmış alım ayarlayın.
İn vivo kalsiyum görüntüleme için, elde etme sırasında solucan hareketinden küçük sapmaları düzeltmek için 2D dekonvolüsyon ve görüntü hizalaması kullanın. Daha sonra DD dendritik omurgayı ilgi alanı veya ROI olarak tanımlayın. YG'yi çoğaltın ve arka plan sinyalini toplamak için solucanın içindeki komşu bir bölgeye gidin.
Ardından, uygun yazılımı kullanarak, GFP yoğunluklarını her zaman noktası için Excel'e aktarın ve arka plan floresanını omurga ROI floresansından çıkarın. 561 nanometre uyarılmasından hemen önce çerçevedeki GFP floresansını çıkararak veya uyarımdan sonra her zaman noktasından sıfırda çıkararak floresandaki değişimi belirleyin veya Delta F.Daha sonra Delta F'yi F sıfırı üzerinden belirlemek için F sıfıra bölün. Ve normalleştirilmiş izlerin grafiğini çıkarın.
İlk olarak, verilerin normalde bir Shapiro-Wilk testi kullanılarak dağıtılıp dağıtılmadığını belirleyin. Normalde dağıtılmayan veriler için, çoklu test için post-hoc düzeltmeye sahip parametrik olmayan bir ANOVA kullanın. Alternatif olarak, normal veya Gauss dağılımını gösteren ölçümler için, her 561 nanometre darbeden önce ve sonra her GCaMP floresan ölçümü için eşleştirilmiş bir parametrik ANOVA testi gerçekleştirin.
Ve iki grubun her birinde birden fazla karşılaştırma için doğru. DD dendritik dikenlerinin üç bağımsız belirteç, sitozolik mCherry, MYR: mRuby ve LifeAct: GFP ile etiketlenmesi, vahşi tip genç yetişkinlerde 10 mikron DD dendrit başına ortalama 3.4 DD dendritik diken yoğunluğu vermiştir. GFP: Utrophin belirteci bu analizden çıkarıldı, çünkü potansiyel olarak ütrofinin omurga morfogenezini yönlendiren aktin sitoiskeleti ile etkileşimleri nedeniyle önemli ölçüde daha düşük bir omurga yoğunluğu verdi.
Canlı hücre görüntüleme yaklaşımı, DD dikenlerinin ince mantar şeklindeki morfolojisinin, filopodial, inatçı ve dallı gibi alternatif omurga şekillerine kıyasla yetişkinlerde baskın olduğunu doğruladı. DD dendritik dikenlerinin aktivasyonu, DD nöronlarında GCaMP eksprese eden transgenik solucanlarda presinaptik kolinerjik sinyalizasyon ve presinaptik VA nöronlarında Chrimson ile değerlendirildi. Presinaptik VA nöronlarında Chrimson'un optogenetik aktivasyonundan hemen sonra DD dikenlerinde GCaMP sinyalinin geçici patlamaları tespit edildi.
ATR'nin yokluğunda yapılan bir kontrol deneyi, GCaMP sinyalinin ölçüsünün, kesinlikle ATR'ye bağımlı olan Chrimson'un optogenetik aktivasyonuna bağlı olduğunu doğruladı. DD dikenlerini görselleştirmek için, çıkıntı yapan dikenler ışık yoluna dik açılarda olduğu gibi yanlarında yatan hayvanları görüntülemek en iyisidir. Bu yöntemle, bilim adamları DD dikenlerinde kalsiyum geçicilerini yönlendiren mekanizmaları anlamak için farmakolojik manipülasyonları da kullanabilirler.
