Yazarlar bu işi desteklenen finansman Akron Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

1.. Hedef Protein Tasarımı <ol><li> Biyoteknoloji Bilgi sitesi için Ulusal Merkezi&#39;ni kullanma (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dikkate ilgi ve herhangi bir ek yeri varyantları tür alarak hedef protein için bir amino dizisini elde. Proteinin ilgi aktif bölgesine karşılık gelen amino asit dizisini seçin. Not: Sema3A için, amino asitler 21-747 seçilmiştir. Bir füzyon proteini barstarın, bir amino asit, 1-90 dizisi, NGF amino asitler 122-241 &#39;e eklendi NGF ile tasarlanmıştır. </li><li> N-terminal dizileri takip eklemek için: arıtma için 6X His etiketi (HHHHHH), Tütün Etch Virüsü His etiketinin çıkarılması için (TEV) proteaz kesme bölgesi (ENLYFQG), biotin K (GLNDIFEAQKIEWHE) de protein biyotinilasyon için dizisi etiketli ve uygun protein refolding (EFPKPSTPPGSSGGAP) için oda sağlayacak boşluklar esnek menteşe. Not: Bu sekanslar, arzu edilen füzyon prot bağlı olarak değişebilirein. </li><li> , Arzu edilen alıcı türleri ve sentezi için gen tasarım / optimizasyonu için bir şirket için tam bir amino asit sekansı gönder. Bir kit kullanılarak BamHI-Notl ile tercih edilen bir vektör içine veya ticari hizmetleri kullanılarak alt-klonlanmıştır. </li></ol> 2. Agar Tabaklar Yapımı Not: Bu antibiyotiklerin, levhalar, tamponlar, tüm hisse senetleri (sıcaklık ve süre) düzgün saklanan çok önemli olduğunu ve (steril) Proteazların serbest kalır. <ol><li> Bir cam şişe içinde ortam, 20 g / L ve yerde 1,5 ağırlık% ve lizojeni suyu (LB) agar tartılır. Bir 500 ml şişe yaklaşık 15 plakaları hale getirir. </li><li> Hacimsel, ultra saf su ekleyin, iyice karıştırın, ve otoklav. </li><li> Dokunmak şişe soğuması ve uygun antibiyotik ekleyin. Şişe çok soğur ve çözelti donmak başlarsa, ancak, mikrodalga içinde tekrar ısıtılmakta, agar erken katılaşmasını önlemek. Not: Bizim plazmid bir ampisilin direnç gen içerire. Bu nedenle, tüm adımlar 100 ug / ml &#39;de ampisilin içermelidir. E. E. coli K12 suşu klonlama tetrasiklin (12.5 ug / ml) antibiyotik gerektirir. BL21 bakteri hücreleri herhangi bir ek antibiyotik gerekmez. </li><li> 90 mm Petri kapları içine solüsyonu 25-30 ml dökün ve kurumasını zaman tanıyın. </li><li> Uygun antibiyotik ve Parafilm ile 4 ° C, veya sıkıca kapanabilen bir torbada mağaza baş aşağı ile etiket çanak. Not: Tabaklar yaklaşık bir ay boyunca iyi. </li></ol> 3. Biotin Tagged Plazmid klonlanması Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Pelet etmek için 3 dakika boyunca 6,000 x g de plazmid vektörü Spin ve steril aşırı saf su içinde 10 ul ekle. </li><li> Kimyasal olarak, yetkili E. 50 ul kaldır -80 ° C ve hemen coli hücreleri, yüksek dönüşüm etkinliği 5-10 dakika için buz üzerine yerleştirin. </li><li> 0,5-1 ng/50 vektörü çözeltisi 1 ul ekle56, 50 ul E. l hücrelerin coli hücreleri ve -80 ° C &#39;de kalan plazmid yerleştirin </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde vektör içeren bakteri hücreleri yerleştirin. </li><li> Isı şok geri 2 dakika boyunca buz üzerinde 42 ° C su banyosu ve yer hücrelerde 30-45 saniye boyunca hücre ve vektör karışım. </li><li> Katabolik baskı (SOC) ortamı (% 2 v bakto-tripton / w,% 0.5 w / v bakto-maya ekstresi, 8.56 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 20 mM MgSO 4, 20 mM glukoz ile süper uygun suyu 250 ul ekle , ultra saf su, pH = 7.0) ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 250 rpm&#39;de çalkalanır. Not: SOC otoklava olmamalı, filtre, bir 0.22 um filtre ile sterilize edilebilir. </li><li> Kuru plakalar önce hücreleri kaplama için 10-15 dk. </li><li> Pipet 25, 50, ve ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden antibiyotikler ayrı agar plakaları üzerine hücre çözeltisinin 100 ul. Ağar plakalar üzerinde eşit çözümü dağıtmak için cam boncuk kullanın. </li> &lt;li&gt; 15-18 saat boyunca 37 ° C&#39;de plakaları baş aşağı inkübe edin. </li><li> Tabakalarına küçük bireysel koloniler bakteri için kontrol ve kullanım (Şekil 2A) kadar 4 ° C de ters olarak depolar. <ol><li> Koloniler varsa: <ol><li> Tamponlar ve malzemelerin tazeliği ve sterilite kontrol edin. </li><li> E &#39;e eklendi plazmid miktarını artırmak coli K12 suşu. </li></ol></li><li> Büyük koloniler mevcut olan ya da koloniler (Şekil 2B ve 2C) bir büyüme varsa, düşük ses steril bir aşılama döngü veya tabak hücreleri kullanarak yeni bir agar plaka restreak. </li></ol></li><li> Inoküle 5 ml dönüştürülmüş E. tek bir koloni ile ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden LB antibiyotikler coli hücreleri. Büyüme-up hücreler gece boyunca 250-300 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de. </li><li> Sonraki gün, bir gece boyunca Gro gelen hedef vektör izole etmek için bir plazmid izolasyon kiti kullanmakw-up sonraki kullanıma kadar -80 ° C &#39;de ve mağaza plazmid saflaştırılmıştır. <ol><li> İsteğe bağlı: 260 ve 280 nm &#39;de elde edilen absorbans ölçümleri kullanılarak plazmid saflık ve konsantrasyon kontrol edin. </li></ol></li></ol> 4. İfade Plazmidi konakçıya transformasyonu Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Tekrar E. için 3,2-3,10 adımları aşağıdaki değişikliklerle coli BL21 hücreleri: Not: BL21 hücreleri, bu nedenle sadece ampisilin dönüşüm için agar plakalarına ilave edilir, herhangi bir ek antibiyotik gerekmez. <ol><li> 50 ul E. adım 3.12 den 0,5-2 ng/50 ul hücre olacak şekilde izole edilmiş plazmid 2-5 ul ekle E. coli ekspresyon konakçı hücreler. </li><li> 60-90 saniye ısıl şok hücreler. </li><li> 60 dakika yerine 30 dakika boyunca 250 rpm&#39;de çözelti ihtiva eden SOC ortam çalkalayın. </li></ol></li><li> Ster ile bir Petri kabı dönüştürülmüş bakteri hücrelerinin tek bir koloni PluckIle uygulama çubuk ve yeri ampisilin uygun konsantrasyona (100 ug / ml) ile birlikte 5 ml LB et suyu ihtiva eden bir deney tüpü içinde. </li><li> 250 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de gece boyunca çalkalayıcıda test tüpleri yerleştirin. </li><li> Ertesi sabah, gece boyunca büyümeye-up 200 ul almak ve 100 ug / ml ampisilin içeren 5 ml LB ekleyin. </li><li> 750 ul kültür (steril) 250 ul% 50 gliserol ile kalan hücreleri aşağı dondurma ve -80 ° C&#39;de tutmak Not: Yeni bir test ifade ve ölçek-up işlemleri donmuş hücrelerin bir kazıma elde etmek için steril bir aplikatör çubuk kullanarak ve uygun antibiyotik ile LB aşılayarak yapılabilir. </li><li> Optik yoğunluk (OD) 600 nm &#39;lik bir emişteki 0,7-0,8 arasında ölçülmektedir kadar 37 ° C&#39; de 250-300 rpm&#39;de çalkalayıcı test tüpü yerleştirin. </li><li> 1 mM nihai konsantrasyonunda IPTG ile hücrelerin neden. </li><li> 300 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de ek bir 4 saat boyunca çalkalanır. Alternatif hücreler de yapabilirsiniz250-300 rpm&#39;de 18 ° C&#39;de gece boyunca çalkalanır. Bu, hedef proteine ​​bağlı olarak plazmid daha yüksek bir verim üretebilir. </li><li> Testi İfade Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Analizi <ol><li> 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 500 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg&#39;de aşağı spin. Üstteki likit dökün ve etiket &quot;çözünür.&quot; Yükleme boyası (50 ul 2-merkaptoetanol, 950 ul Laemmli numune tampon maddesi) 200 ul vorteks ile süspanse pelet. Not: Çözünür bakteri granül birleştirici protein bakteri hücrelerinin sitoplazmik bölgelerinde olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Peletler, gerekli olana kadar bir boya yükleme olmadan -80 ° C&#39;de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünür hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir. </li><li> 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 1.000 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg&#39;de aşağı spin.Üstteki likit dökün ve etiket &quot;çözünmez.&quot; Not: Çözülmez pelet bakteri hücrelerinin dahil vücutlarında bulunan proteinlerin serbest bırakmak için aşağıda denaturasyonu prosedür uygulanır. Peletler, gerekli olana kadar -80 ° C&#39;de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünmeyen hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir. <ol><li> 200 ul BugBuster içinde çözünmeyen pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> 5 dakika boyunca 13-15 xg&#39;de tekrar numune aşağı Spin ve üstte 50 ul alır ve yeni &quot;Çözünmeyen&quot; 1.5 ml tüp ekleyin. </li><li> Sonra bu yeni örneğe yükleme boyası 50 ul ekleyin. </li></ol></li><li> SDS-PAGE analizi için proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca hem de çözünür ve çözünmez örnekleri kaynatın. </li><li> Standart merdiven ile elektroforez jel halinde her bir numune yükleyin. </li><li> Görselleştirmek amacıyla protein numuneler bir lekelenme kullanımıg reaktif ve şirketin protokolünü uygulayın. </li><li> Protein, SDS-PAGE jel (Şekil on (Not 4.9.1 ve 4.9.2), bu iki şerit karşılaştırma hem de çözünür ve çözünür olmayan kontrol şeride şerit karşılaştırarak çözünür ve / veya çözünmez fraksiyonlar içinde eksprese edip etmediğini belirlemek 2). Koyu bant çözünür veya çözünmez şeritlerde proteinin molekül ağırlığı yaklaşık görünmelidir. Bu, izolasyon prosedürü Protokol 6 kullanılacak belirleyecektir. Not: bir grup izolasyon yöntemi rekombinant proteinin daha yüksek bir verim (Şekil 3) üretir belirlemek için Protokol 6 da kullanılan izolasyon altında gerçekleştirilebilir, ya da her iki yönde protein izole edilebilir, ya da çok bu bölgelerin her ikisinde de varsa . </li><li> 4 saat ve gece boyunca indüksiyon yapıldı ise, ölçek-up işlemi için yüksek protein üretimini (Şekil 2) sahip olan tümevarım metodu belirler. </li></ol></li></ol&gt; 5. Ölçek-up Usul ve Ana Kültür <ol><li> Terrific Broth 85.7 g ve 1.8 L saf su ve 1 saat süre ile sıvı döngüsünde otoklav içinde% 50 gliserol, 28.8 ml büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Adım 4.5 oluşturulan donmuş hücre stok kültürü bir gece boyunca başlatın. Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Steril bir 125 ml Erlenmeyer şişesi içinde 100 ug / ml &#39;de 20 ml LB ve ampisilin bir son konsantrasyon ile karıştırın. </li><li> Steril bir aplikatör kullanarak dönüştürülmüş E. bir hurdaya almak coli hücreleri ve şişeye damla aplikatörü. Köpük stoper ya da pamuk ile aplikatör sopa ve fiş şişeyi çıkarın ve sterilite korumak için alüminyum folyo ile kaplayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 250 rpm&#39;de gece boyunca çalkalayın </li></ol></li><li> Ana Kültür Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Steril büyüme ortamı içinde 1.8 L kültür içine dökün ve bir gece boyunca 10 ° ampisilin eklemek0 ug / ml ve bir Pasteur pipeti kullanılarak steril köpük önleyici 204 6-8 damla. </li><li> Havalandırma taş aracılığıyla kültürler içine sıkıştırılmış hava kabarcıkları, süzüldü 0,2 mm olan bir 37 ° C su banyosu içinde yer kültürler. </li><li> OD 600 nm 0,7-0,8 ulaştığında, IPTG (1 mM) ile teşvik ve indüksiyon aşama 4.9 SDS-PAGE çözünür / çözünmeyen sonuçlarına bağlı olarak 18 ° C &#39;de 37 ° C&#39;de ya da gece boyunca 4 saat için ya da oluşmasına izin verir. </li></ol></li><li> E. Toplama Hücreler coli <ol><li> 4 ° C&#39;de 14,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj 1 L şişe (2 şişe / kültür) hücre kültürü aşağı Spin </li><li> Süpernatantı dökün ve ince bir spatula kullanılarak, bakterilerin iki adet 50 ml tüplere pelet kepçe. Hücreler, bir kaç dakika için santrifüjleme ile tane haline tekrar edilebilir. Not: her bir 1.8 L kültür iki bakteri topaklar, her bir 50 ml santrifüj tüpüne bir neden olur. </li><li> Protein izolasyonu kadar -80 ° saklayın peletler. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 6. Rekombinant Protein izolasyonu ve saflaştırılması Protein aşama 4.9 SDS-PAGE Analizi göre çözünür bölgesinde yer almaktadır, o zaman &quot;yerel yalıtım&quot; olarak kullanılacaktır, ancak çözünmeyen proteinler &quot;Özgün olmayan Isolation&quot; işlemleri için gerçekleştirilir: edin. <ol><li> Cell Lysis <ol><li> Özgün olmayan <ol><li> Kaldır E. dönüştürdü coli topak -80 ° C dondurucu ve her bir santrifüj tüpüne 20 ml Lysis / Wash Buffer (Tablo 1) ekleyin. </li><li> Vortex ve özer ve herhangi bir büyük boyutta olmadan tampon çözeltisi içine çözen kadar donmuş pelet sallayın. Gecede nutator kuluçkaya yatmaktadır. Ertesi sabah, topak artık tamponundan proteinin denatürasyon nedeniyle yapışkan bir harç madde olmalıdır. </li><li> 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında 20,500 x g&#39;de santrifüje bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın. </li></ol></li><li&gt; Yerli <ol><li> Elde transforme edilmiş E. -80 ° C dondurucu coli pelet. </li><li> 30 ml&#39;lik bir son hacme ulaşmak için santrifüj tüpüne Lysis Buffer (Tablo 1) ekleyin ve karıştırın ve sıkı bir şekilde çalkalanarak dondurulmuş pelet çıkarmak. Buz üzerinde pelet yerleştirin. </li><li> 1-2 dakika boyunca% 100 genliğinde% 70 etanol ile sonikatör probu yıkayın. Sonra saf su ile tekrarlayın. </li><li> Sonicate bakteriler 5 dakika (10 dakika toplam geçen süre) için buz üzerinde ise pelet. <ol><li> Sn kapalı on/30 30 saniye darbesi ile% 30 genlikte selenleyicisi ayarlayın. </li><li> Bob santrifüj tüpü ve tamamen hücre pelet kadar kırmak için Sonication aralıkta aşağı. Toplam sürenin sonunda görünür bir bakteri, bir tel, viskoz bir bulamaç kaldı pelet olmalıdır. </li><li> Farklı protein izolasyonların arasındaki sonikatör probu temizleme hem de aşama 6.1.2.3 de tarif edildiği gibi% 70 etanol ve ultra saf su ile depolama için. </li></ol></li&gt; <li> 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 20,500 x g&#39;de santrifüjleyin bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın. </li></ol></li></ol></li><li> Ni-NTA Afinite Kromatografisi <ol><li> Özgün olmayan <ol><li> 1 ekleyin ml Ni2 +-NTA her santrifüj tüpünün (1.8 L kültür boyunca 2 ml reçine toplam) hazırlandı reçine çözeltisi ve nutator en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Afinite sütuna şerbeti dökün ve çözüm atık behere tamamen musluk vana aracılığıyla akmasına izin. </li><li> Her bir yıkama için Lizis / Yıkama Tamponu 10 ml ile 10 yıkama yapın. <ol><li> İlk iki yıkama, ek reçine kaldırmak ve daha sonra kolon içine dökmek için santrifüj tüpüne 10 ml. Ek yıkama kolonuna doğrudan ilave edilebilir. </li><li> Her yıkamadan sonra, cam bir çubuk ile karıştırma, reçineyi karıştırın. Yıkama atık beher içine damlar, bir sonraki 10 mi ilave edilebilir. </li></ol></li><li> Sonra tamamen dr yıkayınyoluyla ips, valfli yakın vana, atık beher kaldırmak ve protein toplama için 50 ml santrifüj tüpü ile değiştirin. </li><li> Seyreltme Tampon maddesi (Tablo 1) 15 ml eklenir ve karışmaya-up reçine, solüsyon 5 dakika boyunca oturmak için izin verir. Açık musluk vana ve toplamak yıkama. Ilave bir 15 ml &#39;si ile tekrar tekrar edin. </li></ol></li><li> Yerli <ol><li> Aşağıdaki parametreleri ayarlamak dışında (Adımda 6.2.1.1-6.2.1.4) Yukarıdaki Özgün olmayan Affinity Kromatografisi izleyin: <ol><li> Ni 2 nutator en az 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de +-NTA reçine solüsyonu inkübe edin. </li><li> Uygun Wash Buffer (Tablo 1) kullanarak. </li></ol></li><li> Elüsyon Tamponu (Tablo 1) 5 ml ve 5 dakika için reçine ile inkübe edin. <ol><li> Açık musluk vanası ve çözeltinin çok kadar elüsyonu toplanması yoluyla damlatılır gelmiştir. </li><li> 96 oyuklu plaka temizlemek için 90 ul / oyuk Bradford reaktifı ilave edin. Her yıkama izin sonra yani 10 ulde 90 ul Bradford reaktifi içeren içine sütundan damla devrim sisi. </li><li> Bradford tahlil artık protein (renk temizlemek için açık mavi, koyu mavi gider) tespit kadar bir seferde 5 ml sıyrılması Tampon eklemeye devam edin. Bu genellikle 4-5 elüsyon hacimleri alır. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Diyaliz / Renatürasyon <ol><li> 4 ° C. Özgün olmayan (renatürasyonunu) ve yerli diyaliz tamponlar (Tablo 1) ve mağaza olun Not: diyaliz tampon pH&#39;ı, hedef proteinin izoelektrik noktasının (pl) ile tespit edilir. Başparmak proteinlerin bir kural kendi pl değerlerin üstünde veya altında en az bir tam nokta tamponlu gerektiği gibi. </li><li> Uygun molekül ağırlığı kesme (Sema3A için NGF ve 50,000 MWCO için 25,000 MWCO) ile diyaliz boru yerli ve yerli olmayan elüsyonları aktarın. 4 ° C&#39;de 4 saat boyunca, ilgili diyaliz tampon maddesi içinde 1 her bir protein numunesi yerleştirin ve daha sonra söz konusu tampon 2 fazla ile değiştirin4 ° C&#39;de gece Not: Protein doğru ve tekrar katlanmadan gerçekleşmesi için tampon değişimi için en az 4 saat süreyle her bir tampon içinde diyaliz edilmiş olması gerekir. </li><li> Santrifüj sıkma konsantre edici kullanılarak en az 5 ml diyaliz edilmiş protein elüsyonları konsantre edin. Not: Proteinler daha hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) kullanılarak saflaştırılabilir ve yeniden konsantre edildi olabilir. </li></ol></li><li> Dondurularak önceden tartılmış bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 10-50 ml bir numuneyi kurutmak suretiyle protein konsantrasyonu (mg / ml) belirler. <ol><li> Isteğe bağlı c: l yol uzunluğu olan bir 280nm / εl,: = sönüm katsayısı belirlemek, ε, protein yoğunlaşma Beer-Lambert Yasasına kullanılarak 280 nm &#39;de bir numunenin absorbansı ölçülerek gelecek izolasyon belirlenebilir, böylece. </li></ol></li></ol> 7. Saflaştırılmış protein Biyotinilasyon <ol><li> 10,000 MWCO diyaliz kaseti ag proteinleri Dialyze10 mM Tris ainst (pH = 8.0), 6 değişikliklerin toplam tampon her 4 saat değiştirilmesi. </li><li> Biyotinilasyon için 2 ml mikro santrifüj tüplerine (şimdi 10 mM Tris tamponu içinde) yeniden birleştirici proteinleri aktarın. </li><li> Bir biotin protein ligaz kiti kullanılarak Biotinylate proteinleri. </li><li> 3 tamponu ile 10,000 MWCO diyaliz kaseti kullanılarak PBS (pH = 7.4) karşı proteinleri Dialyze 2 gün boyunca bir gün değişir. </li><li> Bir miktar analiz kiti kullanılarak protein yüzde biyotinilasyonunu belirler. </li><li> 4 ° C&#39;de veya uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de alikot ve mağazada 6.4 ve mağaza de tarif edildiği gibi yeniden konsantrasyonunun belirlenmesi. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Rekombinant protein mühendisliği birçok disiplinin yayılan çok güçlü bir tekniktir. Bu, özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verimle üretimini sağlayan, düşük maliyetli, ayarlanabilir ve nispeten basit bir işlemdir. Bu tasarımı ve hedef proteinleri ifade her zaman kolay değildir dikkat etmek önemlidir. Bazal ve rekombinant protein ekspresyon vektörü kararlılık, E. belirli seçenekler bağlıdır coli hücre suşları, peptit etiketi eklemeler ve yetiştirme parametreler...

Proteinler sonuçta uygun doku oluşumu ve organizasyon açan, birçok biyolojik fonksiyon için sorumlu biyomoleküllerin geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. Bu moleküller, insan vücudu içinde bir denge sağlamak, düzenleme-yukarı ve / veya aşağı-regülasyonu gen ve proteinlerin kontrol sinyal yollarının binlerce başlatır. Tek bir protein bozulması yıkıcı bozukluklar ya da hastalıkların başlangıcı yol açabilir sinyallerin tüm bu ağ-etkiler. Laboratuarda bireysel protein mühendislik bu olumsuz etkileri ile mücadele için tek bir çözüm sunar ve küçük moleküllü ilaçlar için bir alternatif sunuyor. 1977 yılında, 14 amino asit sekansını kodlayan bir somatostatin gen E. kullanılarak oluşturulan birinci işlenmiş polipeptitlerin biri coli 1. Kısa bir süre sonra, 1979 yılında, insülin, plasmid pBR322 klonlanmıştır dönüştürülmüş, ifade edildi ve 2 saflaştırılmıştır. O zamandan beri, rekombinant proteinleri res birden alanlara nüfuzlarını genişlettikearch vb biyomalzeme, ilaç dağıtım, doku mühendisliği, biyofarmösetiklerinin, tarım, endüstriyel enzimler, biyoyakıt gibi (yorumlar için başvuruları 3-8). Bu durum da dahil olmak üzere teknik amaçlı uygulamaya özel kimyasal kısımların ve protein dizilerinin eklenmesi ile içerir, ancak, hedef protein tanımlama, stabilizasyon ve arıtma için bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla çok yönlülüğünü ölçüde kaynaklanmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi ile, memeli rekombinant proteinleri, bitki, böcek, maya, mantar veya bakteriler dahil olmak üzere ökaryotik ve prokaryotik konak sistemleri çeşitli ifade edilebilir. Her ev sahibi farklı avantajlar sunar ve genellikle iyi sistem protein fonksiyonu, verim, stabilite, genel maliyet ve ölçeklenebilirlik göre belirlenir. Bakteriler ökaryot hücreleri genellikle ana (yani glikosilasyonu disülfit köprü, e sağlamak sonrası modifikasyon mekanizmaları eksikliği<html> tc). 5.. Ancak, bu ana genellikle daha pahalı ve zaman alıcı 9 olan, bir sonucu olarak, memeli ve böcek sistemleri genellikle, ökaryotik proteinlerin daha iyi uyum ve tanımına neden olur. Bu nedenle, E. Hücreler ucuz büyüme koşulları hızla genişletmek ve genetik mekanizmaları ifade de 5,9 anlaşılmıştır çünkü coli ekspresyon sistemi için tercih ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonlar 10 olmamasına rağmen üretim amaçları ve fonksiyonel proteinleri sonuç için büyütüleceği kolaydır. E. Bu suş yüksek dönüşüm verimleri dayalı mükemmel plazmid verim sağlar, çünkü coli K12 suşu klonlama için bu protokol seçilir. Ayrıca, bir E. Bu konakçı suşu kontrol protein ifadesini ve kararlılığını 11 içerir T7 RNA polimeraz genini içerdiği için coli suşu BL21 ifade için kullanılır. çadır &quot;&gt; ana seçimden sonra, daha fazla bakım rekombinant proteinleri sentezleyen bakteryofaj T7 transkripsiyon ve çeviri sinyallerinin yönlendirmesi altında klonlanır hedef bir DNA dizisi ile başlar. seçilir ve kontrollü bir protein ekspresyonunu kolaylaştırmak için ideal bir ekspresyon vektörü seçiminde de büyük dikkat olmalıdır ve ifadesi T7 RNA polimeraz geninin kromozom kopyasını 12 arasında ihtiva eden konakçı hücrelerde endüklenir. plazmid vektörü pBR322 türetilen Bu vektörler, (inceleme için bkz 13 referans), sıkı bir şekilde, başlangıçta 14 Studier ve arkadaşları tarafından geliştirilen T7 promoter tarafından kontrol edilir ve ek sağlamaktadır lac operatörü ve lac represör (lac1) dahil edilmesi yoluyla kontrol 15,16. yeniden birleştirici protein mühendisliği için, bu ifade sistemi, farklı hedef DNA dizileri sokulmasıyla istenen bir proteinin belirli bir amino asit sekansı ya da uyarlamak için füzyon proteinlerini oluşturmak için olanağı sunar Kombine etki oluşurTek proteinlerden s. Buna ek olarak, bir dizi çizim N veya C terminaline yerleştirilmesi için peptit etiketi modifikasyonlarını içerir. Tasarım amaçları için, bir histidin (His) etiketi saflaştırma için DNA hedef dizisine ilave edildi ve bir 15 amino asit sekansı, biyotinile biyotinilasyon 17,18 için dahil edilmiştir. Bu protokol, bir ampisilin direnç genini ihtiva eden bir plasmid, bizim biyotinile füzyon protein dizileri taşımak için seçildi. Expression T7 lac promotörü, bu vektör ile kontrol edilir ve kolay bir şekilde, izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile endüklenir. Deney ifadeler (küçük ölçekli kültürler), saflaştırma işlemleri formüle ya çözünebilir ya da çözünmez formda ifade edilebilir hedef proteinin varlığını ve çözünürlüğünü belirlemek için kullanılır. Bakteri hücre içinde ifade edilen çözünür bir protein kendi doğal yapısı 19 korumak için kendiliğinden katlama uğrayacaktır. Tipik olarak, doğalyapı termodinamik olarak tercih edilir. Birçok durumda ana metabolik aktivitesi çözünmeyen protein üretimi ve çözünmez agregaların oluşan protein inklüzyon cisimciklerinin oluşumuna yol açar sistemde stres yerleştirerek, hedef proteine ​​elverişli değildir. Bu durumda, hedef protein 20 genel olarak, biyolojik olarak aktif olmayan hale getirilerek, denatüre. Her iki test ifadeler-up ölçeklendirilir ve izolasyon prosedürleri hedef proteinin çözünürlükleri tarafından belirlenir. Ek bir renatürasyon adımı yeniden katlama ya da çözünmeyen proteinler için gereklidir. Meydana gelen rekombinant proteinler, bundan başka, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. Evde rekombinant protein üretim hedef proteinin miligramı Ana kültürün her bir litresi için izole edilebilir çünkü ticari ürünlere kıyasla maliyet avantajı sunmaktadır. Gerekli ekipman çoğu, tipik bir biyolojik ya da kimyasal laboratuar mevcuttur. Protein mühendisliği oluşturulması için sağlar:her zaman ticari olarak geçerli değildir ilave fonksiyonlarını özel füzyon proteinlerinin. 1 rekombinant protein mühendisliği ile ilgili olan temel prosedürleri tasvir etmektedir. Bu ekspresyon sistemi ile, örneğin, interferon-gama, trombosit türevli büyüme faktörü, kemik morfojenik proteini-21-23 gibi pek çok biyotinile protein, oluşturduk, ama biz akson rehberlik, NGF (29 kDa için tasarlanmış iki protein üzerinde durulacak ) ve Sema3A (91 kDa) 10 (inceleme için) 24 başvuru bkz. Biyotinilasyon tanımlanması, hareketsizleştirme ve iyi bilinen bir biotin-streptavidin etkileşimini kullanan 25-27 etiketli proteinlerinin izole edilmesi için yaygın bir tekniktir. Biyofizik sondalar 28,29, 30 biyosensörler, ve kuantum noktaları 31 10 -15 M 27 sipariş üzerine bir K d ile biotin-streptavidin konjugasyon yüksek afinite kullanan sistemler bazı örnekler vardır. E. coli biokalay ligazı, BirA, biyotin içinde bulunan lizin yan zincire biyotin kovalent ekinde yardımcı dizisi 18,32 etiketlendi. Malzeme ve biyomoleküllere Tethering biyotin çoklu doku mühendisliği uygulamaları 21,33-35 için hücre büyüme faktörlerinin sürekli teslim üretti. Bu nedenle, bu özel tasarımlı biyotinile proteinleri mühendislik çoklu araştırma çıkarlarını aşabiliriz güçlü bir araçtır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

Yeniden birleştirici protein mühendisliği Escherichia coli (E. coli) sentezleme yaklaşık 4 yıldır sistemleri ve bugün kullanmıştır E. coli halen en yaygın olarak kullanılan konak organizmadır. Sistemin esneklik, (streptavidin etkileşimler için) bir biyotin etiketi olarak yarımlar ve yeşil fluoresan protein ya da kiraz, kırmızı proteini gibi daha büyük fonksiyonel proteinlerin eklenmesi için izin verir. Ayrıca, post-translasyonel modifikasyonlar kazandıran metal iyonu kenetleyiciler, eşsiz bir biçimde reaktif fonksiyonel grup, spektroskopik sondaları ve moleküller gibi doğal olmayan amino asitlerin protein entegrasyon özelliklerine sahiptir, daha iyi bir manipülasyon sağladı. Sonuç olarak, bu teknik, bir araştırma çeşitli alanları için anlamlı bir yarar sunan özelleştirilebilir füzyon proteinleri oluşturur. Daha özel olarak, biyotinile protein dizisi için avidin ve biotin streptavidin ile arasındaki yüksek afiniteli bir etkileşim çok hedef proteinler dahil edilmiştir. Bu ek etiketli proteinlerin tespiti ve arıtılmasını artırılması yanı sıra hücre sıralama gibi ikincil uygulamalar için önünü açarak destekli vardır. Bu nedenle, biyotin-etiketli moleküller bioindustrial ve biyomedikal alanlarda artan bir ve yaygın etkisini göstermektedir. Araştırmamız amaçla, sinir büyüme faktörünü (NGF) ve semaphorin3A (Sema3A) fonksiyonel bölgeler ihtiva eden yeniden birleştirici füzyon proteinleri biyotinile tasarladık. Bunların biyotinile füzyon proteinleri, diğer aktif protein dizileri ile birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif amacıyla Biyomalzemelere gergin nasıl daha önce bildirilmiştir. Bu protokol bir T7 lak uyarılabilir vektör ve E. kullanan miligram ölçeğinde mühendislik biyotinile proteinlerin temel özetliyor dönüşüm şekilde büyütülebilir-up ve arıtma için başlangıç ​​coli sentezleme ana.

<html> Klonlama ve ifade Testi Kaplama düzgün yapıldığında, tek bir izole koloniler klonal transforme bakteriler hücreleri (Şekil 2A) koparma şansını artırmak için oluşturmalıdır. Çok sayıda hücre plakalanır, ancak plakalar 37 ° C ya da dönüşüm çok uzun inkübe edilir koloniler agar plaka kapak veya hücre daha büyük agregalar (Şekil 2B ve 2C) oluşturabilmektedir, sorgulanabilir. Test ifade sıra...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir.

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.4K Görüntüleme.  University of Akron.  Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir. 

Video: Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Biyomühendislik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Tasarım ve Yapay Ekstrasellüler Matrix İnşaatı (aECM) Proteinler gelen<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cilt Doku Mühendisliği

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Yalıtım insan alveoler kapaklarini ve Osteojenik etkinlik kapaklarini türetilmiş hücre D vitamini etkileri Mezenkimal kök hücrelerin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the wet spinning method, gelatin fibers are produced by smooth extrusion in a suitable coagulation medium. To increase the functional surface of these gelatin fibers and their ability to mimic the features of tissues, gelatin can be molded into a tube form by referring to this concept. Examined by in vitro and in vivo tests, the gelatin tubes demonstrate a great potential for application in tissue engineering. Acting as a suitable filling gap material, gelatin tubes can be used to substitute the tissue in the damaged area (e.g., in the nervous or cardiovascular system), as well as to promote regeneration by providing a direct replacement of stem cells and neural circuitry. This protocol provides a detailed procedure for creating a biomaterial based on a natural polymer, and its implementation is expected to greatly benefit the development of correlative natural polymers, which help to realize tissue regeneration strategies.

We developed and describe a protocol based on the wet spinning concept, for the construction of gelatin-based biomaterials used for the application of tissue engineering.

Islak eğirme esaslı kalıplama işlemi doku rejenerasyonu için jelatin

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...