Bu çalışma CIRM Erken Translasyonel II Araştırma Ödülü TR2-01.821, NIH / NIDCR (hibe R21 DE0177711 ve RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10.677, AWJ ve RKS tarafından desteklenen sahip T32 eğitim bursu ödülü (5T32DE007296-14), JNZ Bir CIRM eğitim bursu (TG2-01.169) vardır.

1. Perivasküler Kök Hücre İzolasyonu Bu, M. Corselli ve arkadaşları tarafından, bitişik makalesi &quot;İnsan beyaz adipoz dokusu perivasküler Kök Hücreler saflaştırılması&quot; de ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. 2. İskele Yaratılış <ol><li> İskelelerin poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA, Burmingham Polimer) hidroksiapatit kaplama 4-6 ile daha önce yayınlanmış protokol başına özel yapılır. Apatit kaplı PLGA iskeleleri çözücü döküm ve partikül liç işlemi ile PLGA 85/15 imal edilir. Iskelelerinin kas kese implantasyon, femoral segmental kusurlar için bir diskoid kalvarial implantasyon için şekil (4 mm çapında), veya silindir (4 mm çapında, 6 mm uzunluk) için bir küresel şekle (2-mm çap) oluşturulur. </li><li> Kısaca, PLGA / kloroform çözümler ısmarlama eksilerini oluşturmak için 200-300-mikron çaplı teflon kalıp içine dökme sakkaroz (polimer / sakaroz oranı 5/95, w / w) ile karışıktruct. Gece dondurarak kurutma sonra, iskele teflon kalıp kaldırılır ve sukroz eritmek için GKD 2 O dalmış. Iskelelerinin GKD 2 O. üç durulama takiben, 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde daldırılarak dezenfekte </li><li> Apatit kaplama için, yapay vücut sıvısı (SBF) çözümü sırayla GKD 2 O içinde CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 ve K 2 HPO 4 • 3H 2 O çözülmesiyle hazırlanmıştır Çözelti pH çözülürlüğünü artıracaktır 1M hidroklorik asit ilave edilerek 6 &#39;e düşürülmüştür. Na 2 SO 4, KCl, ve NaCl eklenmiş ve nihai pH&#39;ı 6.5 (SBF 1) &#39;e ayarlanır. </li><li> Mg2 + ve HCO 3 - ücretsiz SBF (SBF 2) CaCl 2 ve GKD 2 O ve K 2 HPO 4 • 3H 2 O ekleyerek ve pH 6 indirilir tarafından hazırlanmıştır. KCl ve NaCl eklenmiş ve nihai pH&#39;ı 6.8 &#39;e ayarlanır. Bütün çözümler 0.22 um bir PES membr süzüldü sterildirane (Nalgene). Kaplama işlemi hemen önce, kurutulmuş PLGA iskelesi ıslatma ve kaplama yeknesaklık parıltı deşarjı iyileştirmek için argon plazma gravürü (harrick Scientific) tabi tutulur. </li><li> Desenli iskeleleri sonra 12 saat SBF 1 inkübe ve Mg2 + ve HCO 3 değiştirilir - 37 başka bir 12 saat ücretsiz SBF 2 ° C nazik karıştırma altında. Kaplamalı iskeleleri fazla iyonları uzaklaştırmak için GKD 2 O ile yıkanır ve önceden ileri çalışmalar için liyofilize edilir. </li></ol> 3. Muscle Kılıfı Modeli İmplantasyonu <ol><li> PBS içinde bir PSC süspansiyon 100 ul (fosfat tamponlu tuz) hafifçe implantasyonu hemen önce küresel PLGA tabanlı implantın üzerine bırakılır. Hücreler bu nedenle in vivo izleme sonrası implantasyon izin verecek şekilde, Firefly lusiferaz of lentiviral ekleme tarafından önceden etiketli edilmiştir. Hücre yoğunluğu implant başına 2.5 x 10 5&#39;tir. </li><li> SCID (ağır kombine immün yetmezliği) farelerin yaş 6 hafta kullanılmaktadır. Hayvanlar anestezi vardırisofluran tarafından major&#39;un ve buprenorfin (Bedford Labs) ile premedikasyon. Standart Betadine hazırlanmasından sonra, arka ayaklarda bilateral insizyon (uzunluğu boyuna ve 2 mm) yapılır. </li><li> Cepler kas lifi uzun eksenine künt diseksiyon paralel biseps femoris kasları kesilir. Her fare için, PSC&#39;ler ile PLGA tabanlı implant yerleştirilir ve kas örten fasya 5-0 Vicryl (Ethicon) ile sütüre edilir. </li><li> Cilt yanındaki bir subkutiküler desen 5-0 vicryl ile kapatılır. 10 gün boyunca; Hayvanlar 48 saat ve TMP / SMX (Qualitest Trimetoprim / Sulfamethoxazole) için buprenorfin ile postoperatif tedavi edilir. </li></ol> 4. Kalvaryum Arıza Modeli İmplantasyonu <ol><li> SCID farelerinde (12-14 haftalık) ve izofluran anestezisi sonra, saçları kesilmiş ve cilt protokol başına betadin ile dezenfekte edilir. </li><li> A 8 mm.lik kesi fare kalvaryumun orta sagital dikiş boyunca yapılır. Sonra, calvarial periost hafifçe Q-tip uygulama tarafından kaldırılır. </li><li> Sonra, bir yüksek hızlı diş matkap elmaslı trepan bit kullanarak, 4 mm&#39;lik parietal kemik defekti oluşturulur. Defekt tam kalınlıkta - ancak bakım altında yatan duramater kesmemeye alınır. </li><li> Engrafted PSC&#39;ler ile ısmarlama PLGA bazlı implant sonra kusurun sitesi içinde yavaşça yerleştirilir. Hücre yoğunluğu implant başına 2.5 x 10 5&#39;tir. Son olarak, derinin 6-0 Vicryl ile dikilir edilir. Hayvanlar 48 saat ve 10 gün boyunca TMP / SMX için buprenorfin ile postoperatif tedavi edilir. </li></ol> 5.. Femoral bölüm Defekt Model İmplantasyonu <ol><li> Atimik sıçan (12-14 haftalık) isofluran anestezisi altında bulunmaktadır. Femur temizlendi ve betadin standart protokolü (Şekil 1) başına hazır. </li><li> A 27-30-mm uzunlamasına insizyon femurun anterolateral yönü üzerinde yapılır. Femur sonra vastus lat ayırarak maruzeralis ve biseps femoris kasları (Şekil 2). </li><li> Kemik rejenerasyonu tutarlılığı artırmak için femur kusur örten periost tamamen rezeke femoral segmentte ile kaldırılır. </li><li> A plakalı polietilen (uzunluğu 23 mm; genişliği, 4 mm; yüksekliği, 4 mm) femur anterolateral yüzeyi üzerine yerleştirilir. Plaka 0.9 mm çapında yivli Kirschner (Zimmer) karşılamak için altı önceden delinmiş delikleri içerir. Bir şablon olarak plakası alarak, altı yivli Kirschner teli plakası ve iki korteksleri (Şekil 3) aracılığıyla delinir. </li><li> Sonra, küçük bir el testeresi bıçağı (Stryker, MI) ile, 6 mm orta diafiz defekti oluşturulur. Defektlerinin sonra protokol uyarınca hücreleri (Şekil 4) yüklü olmuştur PLGA tabanlı implant yerleştirilmesi ile tedavi edilirler. </li><li> Örten kas ve fasya yerine implant sabitlemek için 4-0 Vicryl emilebilir dikişlerle kapatılır ve cilt sütüre edilir. </li&gt; </ol> 6. Vivo Değerlendirmeleri yılında <ol><li> Radyolojik değerlendirmeler yüksek çözünürlüklü XR ve yüksek çözünürlüklü μCT (mikro bilgisayarlı tomografi) analizi ikisi tarafından uzunlamasına bir şekilde yapılmaktadır. ΜCT analizi (Skyscan 1172F) için, resimler 19.73 mikron (100 kV ve 100 mA radyasyon kaynağı, bir 0.5 mm alüminyum filtre kullanılarak) çözünürlükte taranır. Görüntüler DataViewer, Recon, CTAN ve CTVol yazılımları kullanılarak analiz edilmektedir. </li><li> Biyolüminesens görüntüleme aynı zamanda hücre transplantasyon, canlılığı, proliferasyon değerlendirmek ve implant sitenin göç dışlamak için bir seri şekilde yapılır. Biyolüminesens görüntüleme bir IVIS Lumina II cihazı (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanılarak yapılır. Işık çıkışı Living Image Software (Xenogen) kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Toplam ışık çıkışı fotonlar / ² / saniye cm / steradyan kaydedilir. </li><li> Histolojik ve histomorfometrik analizi otopsi yapılır. Istihdam Rutin lekeleri Masson&#39;un trikrom, anilin mavisi, p dahilentachrome ve Picrosirius kırmızı. Histomorfometrik analizi osteoid sırasıyla, mavi ve koyu sarı göründüğü, anilin mavisi veya pentachrome lekeleri ya kolayca yapılır. Yüksek güç alanı başına düşen piksel Adobe Photoshop&#39;ta sihirli değnek aracı kullanılarak hesaplanmıştır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Kalvaryal ve femoral kusurları kritik iki boyutlu olduğu için, anlamlı bir iyileşme büyüme faktörleri veya ekzojen kök hücreleri ile tedavi olmadan beklenmelidir. Cerrahi manevra açısından, kas kese Diseksiyon fascial düzlemler boyunca olmalıdır ve bu nedenle çok az kanama karşılaşılan edilmelidir. Kas kılıfı modeli bilateral olsa bile, fare postoperatif 1. günde rahatlıkla yürüyüş yapılmalıdır. Kalvaryal kusur için, kanama karşılaştı ama bir Q-tip ile ıslatılmış olabilir. Aşırı bakım yatan duramater kesmemeye dikkat edilmelidir - bu engel olacak şekildenormal iyileşme ile. FSD model için bakım nörolojik hasarı önlemek için aşırı kanama veya femoral sinir neden olmayacak şekilde büyük kan damarları kesmemeye alınır. Kirschner teli şekilde işleminde kortikal kemik zarar vermemek için nazik bir basınç ile delinir. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> Şekil 1.. Atimik Sıçanlarda Femoral bölüm Defekt için Ameliyat öncesi hazırlık (FSD). Erkek sıçanlarda (12-14 haftalık) isofluran anestezisi altında bulunmaktadır. Femur temizlendi ve betadin ile standart protokol başına prepped. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> Şekil 2. Femoral bölüm Defekt (FSD) oluşturulması için cerrahi pozlama. Bir 27-30 mm uzunlamasına insizyon femurun anterolateral yönü üzerinde yapılır. Femur lateral sonra vastus lateralis ayırarak maruzve biseps femoris kasları. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> Şekil 3. Femoral bölüm Defekt (FSD) oluşturulması için Fiksasyon. A plakalı polietilen (uzunluğu 23 mm; genişliği, 4 mm; yüksekliği, 4 mm) femur anterolateral yüzeyi üzerine yerleştirilir. Plaka 0.9 mm çapında yivli Kirschner karşılamak için altı önceden delinmiş delikleri içerir. Bir şablon olarak plaka alarak, altı yivli Kirschner plaka ve her iki korteks ile delinir. Sonra, 6 mm orta diafiz defekti oluşturulur. Bu gerçekleştirildikten sonra, bir ölçüye iskelesi doğrudan tam olarak hangi (gösterilmemiştir) kusurun sitesi uyan sokulur. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> Şekil 4. Postoperatif Kalvaryum Hata örneği. Bir 4 mm, dairesel kalvarial kusurun atimik farelerde sağ yan kemik oluşturulur. Görüntülü buraya takılan bir kusur sitesiAmeliyat sonrası 8 hafta PSC&#39;ler. Defekt site içinde yeni kemik varlığını unutmayın.

<ol>
	<li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li><li>Chen, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+multi-lineage+progenitor+cells+in+human+organs:+regenerative+units,+cytokine+sources+or+both.">Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).</li><li>Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+ancestors+of+adult+multipotent+stem+cells.">Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).</li><li>Zara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell-1+enhances+bone+regeneration+in+a+rat+critical+sized+femoral+segmental+defect+model.">Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model.</a> Plast. Reconstr. Surg. , (2010).</li><li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Effects+of+Freezing+on+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo.</a> Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).</li><li>Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+protein+delivery+from+modular+polymer+scaffolds.">Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).</li><li>Aghaloo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+role+of+nell-1+gene+modified+goat+bone+marrow+stromal+cells+in+promoting+new+bone+formation.">A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.</a> Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).</li><li>Levi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+Stimulate+Autogenous+Skeletal+Repair+via+Paracrine+Hedgehog+Signaling+with+Calvarial+Osteoblasts.">Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts.</a> Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).</li><li>Leucht, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+and+Hox+status+determine+progenitor+cell+fate+during+adult+bone+regeneration.">Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration.</a> Development. 135, 2845-2854 (2008).</li><li>Rajashekhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Adipose+stromal+cell+differentiation+is+reduced+by+endothelial+cell+contact+and+paracrine+communication:+role+of+canonical+Wnt+signaling.">IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling.</a> Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).</li><li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li></ol>

KT, BP, ve CS UCLA&#39;dan yayımlandı perivasküler kök hücre ile ilgili patent mucitleri. Dr. KT, ve CS UC Regents gelen perivasküler kök hücre ile ilgili patent alt lisansları Scarless Laboratories Inc kurucuları vardır. Dr Chia Soo da Scarless Laboratories, Inc bir subay olan

PSC&#39;ler izolasyonu iyi özellikle PSC izolasyon protokolleri ve yöntemleri ele alan bir ayrı bir müracaat Vallahi yayını dahil olmak üzere, başka bir yerde 1-3 açıklanmıştır. Bu makalenin amacı, belirli bir kemik oluşumu / rejenerasyonu için in vivo uygulamada PSC için 3 protokollerini açıklamak ve göstermektir. SCID fare kas kılıfı ektopik insan kemik oluşumu 7 için yaygın olarak açıklanan model. Önemli farklar parakrin konak kemik yapan hücreler 8 ile etkileşim gibi iskelet defekt mikro mevcut osteojenik sinyalizasyon faktörlerin bolluğu da dahil olmak üzere kemik ektopik ve ortotopik (kusur) modelleri arasında var. İki kusurları, burada bir kalvaryal defect8 ve femoral segmental defekt 4 sunulmaktadır. Her ikisi de (yani kendi başlarına hiç iyileşmeyecek) ölçekli kritik olarak iyi belgelenmiştir. İlginç farklılıklar kalvaryal ve femoral kusurları arasında var. İlk olarak,Hücre: xenografted PSC&#39;ler ve endojen hücreler arasında hücre etkileşimi çok farklıdır. Bir kalvarial kusurun açısından, PSC&#39;ler yatan duramater (menenjlerin en dış katmanın) yanı sıra, kusurun sitesi çevreleyen bu osteoblastlar ve periost hücreleri ile etkileşir. Önemlisi, nakledilen hücrelerin ve çevresindeki osteoblastlar 8, veya implante hücreleri ve altta yatan dura (Levi ve ark., Baskıda) arasındaki etkileşimi devam etmek osteogenezisi aracılık Normal kök hücre için önemlidir. Femoral segmental defekt (FSD) açısından, xenografted PSC&#39;ler çok farklı hücre ve sitokin ortamına maruz kalmaktadır. Örneğin, FSD sitesi iliği ve ilişikteki mezenkimal kök hücrelerin yanı sıra endosteum, periost ve uzun kemik osteoblastlar oluşur. Teorik olarak, her bir hücre hasarı kendi reaksiyonu vardır ve her hücrenin olabilir: PSC xenogreftler ile hücre etkileşimleri. Diğer belirgin farklılıklar kalvaryal arasında mevcutve femoral kusurları. Uzun kemikler bir kıkırdak ara (yon) ile ir yandan kalvaryal kemikler başlangıçta intramembranous kemikleşme yoluyla oluşturur. Dahası, onarıcı işlemi sonrasında yaralanması aynı zamanda, bu gelişme kökenleri taklit eder. Hiçbir kıkırdak ara bir parietal kemik defekti içinde oluşur ise Post-FSD, kıkırdak kallus oluşumu görülür. Son olarak, kafatasının embriyonik kökeni uzun kemiklerin farklı olabilir. Kafatası (- perisitler - perivasküler hücreler de dahil olmak üzere tüm kafa bölgesinde) çoğunluğu apendiküler iskelet paraxial mezoderm derivasyon 9 iken, nöral krest (mesectoderm) türetilmiştir. Bütün bu farklılıklar PSC-aracılı kemik onarımı açısından önemli farklılıklar neden olabilir. PSC&#39;ler kullanımı geleneksel yağ kaynaklı stromal hücreler (TSK) üzerinde birçok faydası vardır. PSC&#39;ler kültür gerektirir ve saflaştırılmış hücre popülasyonu WHI vardır değilve hatta olumsuz düzenler - - osteojenik farklılaşması gibi 10 endotel hücreleri gibi ch yer almayan diğer stromal hücreleri içermez. Bunun aksine olarak, örneğin, TSK klonal analizleri sadece bir alt vitro 11&#39;de osteojenik farklılaşma geçiren yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Sonuçta, iskelet doku mühendisliği çabaları olasılıkla en iyi iskelet kusurları iyileşecek şekilde eksojen büyüme faktörleri ile bir osteocompetent kök hücre (örneğin PSC&#39;ler gibi) ve bir osteokondüktif iskelesi (örneğin HA-PLGA olarak mevcut yöntemlerde kullanılan) dahil edecektir.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

İnsan perivasküler kök hücreler (PSC&#39;ler) iskelet doku mühendisliği 1-3 amacıyla birden fazla dokuların yeterli sayıda izole edilebilir. PSC&#39;ler bir &#39;perisitler&#39; bir FACS-sıralı nüfus (CD146 + CD34-CD45-) ve biz daha önce mezenkimal kök hücre özelliklerine sahip bildirdin her biri &#39;adventisyal hücreler&#39; (CD146-CD34 + CD45-) vardır. PSC&#39;ler, MKH gibi osteojenik farklılaşma gibi salgılar yanlısı osteojenik sitokinler 1,2 geçmesi edebiliyoruz. Mevcut protokolde, biz SCID bir kas kese implantasyonu dahil olmak üzere birçok hayvan modellerinde PSC&#39;ler arasında osteogenicity göstermek (ağır kombine immün yetmezliği) fareler, bir SCID fare kalvaryal defekt ve atimik sıçan femoral segmental defekt (FSD). Uyluk kas kese modeli ektopik kemik oluşumu değerlendirmek için kullanılmıştır. Kalvaryum kusurları parietal üzerinde yoğunlaştı ve çapı standart olarak 4 mm (eleştirel boyutta) 8 olarak uygulanır. FSDs bicortical olup ile stabilize edilmektedirpolietilen bir bar ve K-telleri 4. Açıklanan FSD de önemli ölçüde kendi 4 iyileşmeyen bir kritik boyutu bozukluğudur. Kök hücreleri ya da büyüme faktörleri kusurun sitesi eklenir Buna zıt olarak, önemli ölçüde kemik rejenerasyonu takdir edilebilir. PSC xenografting genel amacı ektopik ve ortotopik hem kemik rejenerasyonu modellerinde bu hücre tipi osteojenik yeteneği göstermektir.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration at JoVE.com

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

İnsan perivasküler kök hücreler (PSC&#39;ler) mezenkimal kök hücreler (MKH) benzer iskelet doku yenilenmesine yönelik yeni bir kök hücre sınıfı vardır. PSC&#39;ler standart bir yağ emme prosedürleri sırasında temin adipoz dokusu FACS (floresans aktive hücre ayırma) yoluyla izole edilebilir, ardından kemik oluşumunu sağlamak için bir osteoendüktif iskelesi ile kombine<em&gt; In vivo</em&gt;.

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

use-of-human-perivascular-stem-cells-for-bone-regeneration

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

20.3K Görüntüleme.  School of Dentistry, UCLA. İnsan perivasküler kök hücreler (PSC'ler) mezenkimal kök hücreler (MKH) benzer iskelet doku yenilenmesine yönelik yeni bir kök hücre sınıfı vardır. PSC'ler standart bir yağ emme prosedürleri sırasında temin adipoz dokusu FACS (floresans aktive hücre ayırma) yoluyla izole edilebilir, ardından kemik oluşumunu sağlamak için bir osteoendüktif iskelesi ile kombine In vivo.

Video: Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Biyomühendislik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...