Yazarlar Avustralya Araştırma Konseyi ve Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi fon kabul ve teşekkür Mikrokontak baskı için SU-8 master için Avustralya Ulusal İmalat Tesisi. SHN Yükseköğretim Malezya ve Universiti Sains Malezya Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.

1. PLL-PEG-biotin ile cam lameller arasında Pasivasyon Bu adım, hücreler microcontract baskı (Adım 2-3a) ya da daldırma kalem litografi (Adım 3b) ile oluşturulan cam lamel üzerinde belirli bölgeleri üzerine yapışır ve geçiş böylece yüzey etkisizleştirmek için tasarlanmıştır. Pasivasyon için, poli-L-lisin (PLL), ve polietilen glikol (PEG) arasında bir ko-polimer PEG moleküllerinin 20% biotin (-PEG-PLL biotin) ile aşılanmış olan kullanılır. <ol><li> Cam lameller (18 mm x 18 mm),% 100 etanol rafa daldırın onları temiz ve 30 dakika için bir sonicating banyo rafı yerleştirin. Hava ya da azot akışı altında cam lameller kurutun. </li><li> Daha sonra, 1 M NaOH içinde 30 dakika için cam lameller sonikasyon. Daha sonra dikkatli bir 1,5 L Milli-Q H 2 O ile dolu bir behere raf daldırma cam yüzeyleri durulama Durulama işlemi taze Milli-Q H 2 O her zaman kullanarak üç kez tekrarlayın. Içinde cam lameller kurutun60 ° C&#39;de bir fırında </li><li> Temiz bir cam il kısmen yarı H 2 O ile dolu bir 24 oyuklu plaka yapılmış bir nemli oda içinde ayrı ayrı lamelleri Her bir cam lamel üzerinde PBS-PEG-PLL biotin (1 mg / ml) 15 ul bırakın. Kalan temiz cam lamelleri diğer yarısını al ve dikkatlice sandviç PEG çözüm. Nemli oda içinde, 1 saat boyunca lamelleri bırakın. PEG-kaplı yüzey kazıma olmadan yavaşça Birbirlerinden uzakta bulunan sandviç lamelleri getirin ve Milli-Q H 2 O ile durulayın Su PEG-tedavi tarafında kolayca kapalı slayt gerekir. Gerekirse, tedavi edilen yüzey ile kağıt havlu üzerinde kurumaya cam lameller yukarı bakmaktadır. Daha fazla kullanıma kadar bir vakum desikatörde cam lameller saklayın. </li></ol> 2. Mikrokontak baskı için Pullar fabrikasyonu Biz pasifleştirilmiş cam lameller üzerine desen streptavidin parçaları iki süreç açıklanmaktadır. İlki, mikrofonrocontact baskı, genellikle bir PDMS damga artığını hangi bir silikon master imalat gerektirir. Bizim durumumuzda, PDMS damga üzerine desen 25 um bir özelliği yüksekliği ile 290 mikron merkez merkeze aralıklı 100 mikron çapında çizgilerdir. Aşağıda, biz uygun bir silikon master (Adım 2.1-2.3) ve PDMS damga (Adım 2.4) imal nasıl kısaca tanımlayınız. Bununla birlikte, cam lameller üzerine protein yapısı baskı için uygun olan literatür 19-23 &#39;de tarif mikrokontak baskı için çok protokol vardır. Ustalar da özel yapılmış ve ticari kaynaklardan satın alınabilir. <ol><li> MilliQ H 2 O ile iyice 10 kez, 20 dakika için gofret yıkayın.: İlk olarak, pirana çözeltisi (v sülfürik asit ve% 30 hidrojen peroksit 3:01 v) içinde inkübe edilerek silikon gofret (4 &quot;çapında) temiz 150 fırında gofret kurulayın ° CO / N. </li><li> 100% izopropil alkol izledi% 100 aseton ile temiz ve kuru silikon gofret, durulayın. Sonraki40 sn için 3,100 rpm&#39;de gofret üzerine GM1070 SU-8 fotorezist (Gersteltec Sarl) spin-kat 2 ml 25 mikron kalınlığında bir katman yaratmak için. Örnek sonra 95 daha 5 dk ardından 5 dakika ° C için 65 ° C&#39;de sıcak bir plaka üzerinde pişirilir </li><li> Istenilen desen (Bir Quintel Q6000 maske hizalama kullanarak örneğin) bir Fotoşablonlarda altında 60 sn süreyle UV ışığına SU-8 fotorezist Açığa ve pişirme işlemi 2.2 tarif tekrarlayın. Sonra örnek 100% izopropil alkol durulanır ve azot akışı altında kurutuldu 4 dk için SU-8 geliştirici (Gersteltec Sarl) olarak gofret daldırarak tarafından geliştirilmiştir. UV ışığa maruz değildi SU-8 fotorezist alanı böylece PDMS damga ters desen oluşturarak, kaldırılır. </li><li> Sonraki adım silikon usta bir PDMS damga döküm olduğunu. İlk olarak, iyice elastomer prepolimer 10 kısım (Sylgard 184) ile sertleştirme maddesi 1 kısmı (w / w) karıştırılır. Bir vakum hattında bağlı bir desikatör içinde gazdan arındırmak sonra, karışım hava kabarcıklarını çıkarmak için:1 saat için. Sonraki, yüksekliği yaklaşık 1 cm bir Petri kabı içine silikon ana üzerine PDMS elastomer dökün ve 1 saat boyunca 70 fırında ° C master ve PDMS karışımı kür. Son olarak, PDMS pul silikon kalıp çıkarılır ve ebatlara kesilir. </li></ol> 3. Pasifize Cam lameller üzerine desenlendirme Streptavidin veya Yapıştırıcı Cues Cam lameller pasivasyon sonra, protein modelleri mikrokontak baskı (Adım 3a) ya da dip-kalem litografi (Adım 3b) yazdırılır. Bizim durumumuzda, streptavidin RGD eğimleri (Adım 4) için temelini oluşturan çizgiler olarak yazdırılır. Aynı prosedür, aynı zamanda yapışkan desenler oluşturmak için matris proteinleri baskı için de kullanılabilir. Yüzeylere biyomoleküllerin desenlendirme için mikrokontak baskı için alternatif bir yöntem daldırma kalem litografi olduğunu. Daldırma kalem litografi, bir konsol yüzey üzerine çözelti küçük bir hacim transfer etmek için kullanılır. Sundurmalar boyutu, vÇözeltinin iscosity, yüzey üzerinde konsol temas süresi, baskı odasında yüzey hidrofobikliği ve nem basılı özellikleri boyutunu belirler. Bu yöntemin avantajı, usta ve pul üretmek için gerek yoktur gibi değişik şekilleri, her bir deney için basılabilir olmasıdır. Dezavantajı belirli bir desenini yazdırmak ve daldırma kalem litografi birçok laboratuvarda mevcut olmayabilir, bir uzman alet gerektiren uzun sürer olmasıdır. Biz kullanılan daldırma kalem litografi cihazı Bioforce Nanobilim gelen NanoeNabler oldu. Burada, biz Spt10 konsol kullanıldığı için, çapı &lt;10 mikron idi küçük noktalar yazdırılır. 3a. Mikrokontak Baskı (μCP) Tekniği <ol><li> Temizlemek ve PDMS damga daha fazla hidrofilik hale, 1.5 saat için bir UV ve ozon (Bioforce Nanobilim dan, örneğin, UV Ozon Procleaner) içinde PDMS pul desenli yan tedavi etmek için. Alternatif olarak, bir plazma kullanmakAynı amaç için daha kısa bir süre için temizleyici. Bu işlem, baskı işlemini geliştirir bir okside PDMS yüzey 24 oluşturur. </li><li> Ozon ya da plazma muamele, yer ve PDMS pul üzerine 10 ul streptavidin (PBS içinde 1 mg / ml) yayılır ve nemli oda (örneğin, kısmen doldurulmuş 6-plaka gibi, Aşama 1.3) içinde 1 saat boyunca izin hemen sonra . Parça floresan mikroskop altında görülebilir olmalıdır, örneğin streptavidin AlexaFluor350 olarak fluorofor bağlanmış olduğu streptavidin kullanın. </li><li> Kağıt mendil ve hava yaklaşık 1 dakika boyunca damga kuruması ile damga fazlalıklar streptavidin çıkarın. Hafifçe PLL-PEG-biotin-kaplamalı cam lamel üzerine damga basın. </li><li> Fluoresan streptavidin Adım 3.a2 olarak kullanıldığında ise, bir mikroskop altında Epifloresans kullanılarak desen incelemek. Bir desikatörde baskılı yüzeyleri saklayın. </li></ol> 3b. Dip Pen Litografi <ol><li> İlk olarak, 1 mg / ml streptavidin ya da stre 1 kısım karıştırma10 kısım gliserol (v / v) ile ptavidin-AlexaFluor350 ve dirsek üzerine karışım 5 ul yükleyin. Daldırma kalem litografi aracın kullanım kılavuzunda anlatıldığı gibi Sonra yazdırma işlemi başlar. Yaklaşık 5 um nokta boyutunu azaltmak için, yazdırma hızını ayarlamak, yüzeye konsol yüzeyinde veya dikey mesafeye konsol zaman başvurun. Şekil 2c &#39;de gösterilen örnekte, noktalar, satır ve 10-15 um sütun ayırma ayarlanmış olan bir çizgi halinde basıldı. Bu mesafe birbirine birleştirilmesi gelen noktalar önlemek için yeterli olduğunu ancak çoğu mikroskop ayarları ile görünümü tek bir alanda birden fazla nokta görüntülenmesini sağlar. </li><li> Bir desikatörde baskılı yüzeyleri saklayın. </li></ol> 4. Streptavidin desenli yüzeyler üzerine Yapıştırıcı Degradeler oluşturma Biz, streptavidin (Şekil 3) ya da işbirliği ile kaplanır cam lameller üzerine biyotin-RGD bölgesinin yapışkan gradyanları oluşturmakpasifleştirilmiş cam lameller üzerine ntain streptavidin desenleri (Şekil 5). Bir yüzey degrade oluşturmak için, biz pasif difüzyonla istikrarlı bir çözüm degrade oluşturur piyasada mevcut mikroakışkan cihazı (Ibidi gelen yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D denir) kullanılır. Streptavidin bağlanma yerleri için rekabet için, (bkz. Şekil 1) RGD konjuge değildi biotin RGD ve biyotin iki zıt degradeler istihdam. <ol><li> Yapışkan-Slide Kemotaksis 3D cihazın yapışkan yüzüne streptavidin kaplı ya da desenli bir cam lameller dikkate alınmalıdır. Birkaç saat süreyle hiçbir sızıntı olmamasını sağlamak için, cihazın kenarları ısıtılan vazelin ince bir tabaka ile ve parafin mum, 1 kısım (w / w) ile vazelin 1 kısım bir karışımın bir ikinci tabaka ile kapatılır. </li><li> Kanal içinde 6 ul PBS ile cihazın kanal doldurun. Sonra, PBS ve 70 ve m de 0.03 mg / ml &#39;den biyotin-4-florosin 70 ul ile iki rezervuar doldurmaku; 0.03 mg l / ul biotin RGD sırasıyla PBS içinde. 1 saat için karanlıkta oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin. </li><li> Biyotin çözüm çıkarın ve yine PBS ile iki kez mikroakışkan cihaza takılıyken dikkatlice yüzeyin durulanması. Yapışkan eğim yönü işaretleyin ve eğer gerekirse, 4 ° C&#39;de PBS ile doldurulmuş cihaz depolamak ancak aygıt, kurumanın emin olun. Gerekirse, bir floresan mikroskop ile yapışkan degrade analiz. </li></ol> 5. Canlı Hücre Görüntüleme için fluorophores ile Hücrelerinin Etiketleme Hücreler floresan mikroskopta hücre izleme yardımcı floresan boyalar ile etiketlenir. Ortak problar floresan organel belirteçleri, hücre çekirdeği etiketler gibi syto 64 Kırmızı vardır. Bunu yapmak için, hücreler ilk önce 45 dakika için kültür ortamı olarak 1 uM syto Red 64 ile inkübe edilir, PBS ile üç kez yıkanır ve son olarak PBS ile üç kez daha yıkanır. Hücrelerin olmaması gerektiğini unutmayınuzun süre için PBS içinde tutulur. Hücre izleme için alternatif boyalar sitoplazma leke CellTracker serisi ve hücre göçü ve bölünme sırasında korunur. Floresan füzyon proteini ile hücrelerinin transfeksiyonu geçişi sırasında ilgi çekici bir proteinin hücre altı dağılımı kaydetmek için özellikle yararlıdır. Ancak, organik boyalar genellikle daha foto-ağartma hızlı floresan proteinleri, uzun süreli gözlemler için mümkün olmayabilir. 6. Mikroakiskan Cihaz içine Çözünür Gradient Hücrelerinin yükleniyor <ol><li> Eşit hücre sayıları iki tüpler içine floresan etiketli hücreleri ve split sayın. Bu tür% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile düşük glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) gibi kemoatraktan içeren bir ortam ile birlikte bir hücre tüp yıkanır ve tekrar süspansiyon. Yıkama ve kemoatraktan,% 0 FBS ile, yani DMEM olmadan ortam içinde hücreler diğer tüp tekrar süspansiyon. Nihai konsantrasyonHer bir tüp içinde hücrelerin 5 x 10 5 hücre / ml olmalıdır. </li><li> Mikroakışkan cihaz (Adım 4.3) gelen tüm çözümler çıkarın ve (Adım 7) mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Bir rezervuar ve başka içine HeLa hücreleri 70 ul (% 10 FCS DMEM içinde 5 x 10 5 hücre / ml) içine hücre 70 ul (% 0 FBS DMEM içinde 5 x 10 5 hücre / ml) yerleştirin. Gevşekçe buharlaşma önlemek için rezervuar üzerinde bir kaset yerleştirin. Yüzey hücreleri önce görüntüleme için ön kuluçkaya bırakılır, bu hücrelerin gradyan olmadan büyüme ortamı olarak cihazın içine yüklenmiş olması tavsiye edilir. Cihaz daha sonra mikroskop sahne üzerine yerleştirilen ve medya diğer% 10 FBS ile bir rezervuar ve DMEM FBS olmadan degrade medya yani DMEM ile değiştirilir. </li></ol> 7. Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi Canlı <ol><li> Mikroskobu (Nikon Ti-E) açın ve deneme başlamadan önce en az 1 saat sahnede ısınmak. </li><li> Emin olun MICR kanalofluidic cihaz görüş alanında yer almaktadır ve hücreler odak noktası vardır. Böyle pozlama süreleri ve floresan filtreler, hücre ve parçaları yakalar parlak alan ve floresan görüntü sırası yanı sıra zaman noktaları ve kayıt uzunluğu (örneğin 16 saat boyunca her 15 dakika) olarak görüntü alma parametresini seçin. </li><li> Böyle ImageJ Manuel İzleme veya Ibidi Kemotaksis ve Geçiş Aracı uygun yazılımları ile verileri analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration.">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion:+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension.">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li><li>Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+sensing+through+focal+adhesions.">Environmental sensing through focal adhesions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).</li><li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+cancer.">Chemotaxis in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li><li>Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cells+make+decisions:+engineering+micro-+and+nanoenvironments+for+cell+migration.">How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration.</a> Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).</li><li>Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+fibronectin+matrix+mimetic+as+a+functional+growth-+and+migration-promoting+adhesive+substrate.">Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate.</a> Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+chemokine+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+Coupled+Receptor+(GPCR)-mediated+Signaling+Events+that+Control+Chemotaxis+of+Dictyostelium+Discoideum.">Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum.</a> J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).</li><li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gradient-generating+Microfluidic+Device+for+Cell+Biology.">A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).</li><li>Rhoads, D. S., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+directional+cell+migration+on+defined+FN+gradients:+role+of+intracellular+signaling+molecules.">Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules.</a> Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+haptotactic+gradient+generation+within+a+triangular+microfluidic+channel.">Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).</li><li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device.">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).</li><li>Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+eukaryotic+cell+chemotaxis.">Assays for eukaryotic cell chemotaxis.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).</li><li>Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+micropatterns+for+cells:+a+microcontact+printing+protocol.">Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology.">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+devices:+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration.">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).</li><li>Hillborg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinked+polydimethylsiloxane+exposed+to+oxygen+plasma+studied+by+neutron+reflectometry+and+other+surface+specific+techniques.">Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques.</a> Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).</li><li>Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin,+VEGF,+or+Both+Proteins.">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+a+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li><li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leukocyte+response+to+fluid.">The leukocyte response to fluid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).</li><li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator.">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).</li><li>Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing:+Limitations+and+Achievements.">Microcontact Printing: Limitations and Achievements.</a> Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+dip-pen+nanolithography.">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li><li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithography+and+nanochemistry:+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices.">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li><li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation.">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li><li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template.">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li></ol>

Biz ifşa etmek hiçbir ticari çıkarları var.

Bu protokol, hücre göçü üzerine kimyasal olarak modifiye yüzeyler ve kemoatraktan degradelerin etkilerini incelemek için (Ibidi gelen yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D) piyasada satılan bir mikroakışkan cihaz kullanılır. Gradyan kanalın uzunluğu boyunca difüzyon ile kurulmuş olmasıdır mikroakış ayar akış gerektirmez. Akış ayirt kararlı gibi fokal adezyon ve küçük odak kompleksleri ve sinapsların 26 oluşturacak en lökositler gibi hızlı göç hücreleri oluşturmak fibro...

Yönetmen hücre göçü birçok hücre temel bir özelliğidir ve embriyonik gelişim, enfeksiyona karşı savunma ve yara iyileşmesi gibi birçok normal fizyolojik süreçlerin, önemli bir yönüdür. Buna ek olarak, hücre göçü aynı zamanda damar hastalığı, tümör hücre metastazları ve kronik inflamasyon 1,2 gibi pek çok hastalıkta önemli bir rol oynar. Hücreleri klasik göç ülkeleri iken - polarizasyon, protrüzyon genişleme, adhezyon, kuvvet oluşturma ve arka retraksiyon oluşumu - genellikle 3,4 kabul edilir, sinyal entegrasyon koordine edildiği zamanmekansal mekanizmalarının aydınlatılmasında daha zor olmuştur. Ekstrasellüler matriks (ECM) hücre yapışması için bir substrat olarak hizmet verir ve doğal kimyasal ve fiziksel 5 6 çeşitliliği ile, cep navigasyon 7,8 için directional kuyruklarını sağlar. Bu yapışkan işaretler 9, çözünür faktörlerin 10-12 ek olarak &lt;/ Sup&gt; gibi kemokin ve büyüme faktörleri gibi olabilir kemoatraktan reseptörleri ve onların aşağı motogenic sinyalizasyon yönlendiriliyor hücre göçü teşvik. Şu anda, nişan ve adezyon reseptörleri (yani integrinler) ya da reseptör tirozin kinaz (RTK) olarak kemoatraktan reseptörleri yoluyla sinyal, baskın olup olmadığı bilinmemektedir. Ne de reseptör sistemlerinin hiyerarşileri hücre tipine özgül olduğunu bilinmektedir. Canlı hücresi mikroskopi toplu tayinlerde erişilebilir değildir ve immobilize 13,14 ve çözünür ipuçları 15 16 degradeleri oluşturmak için mikroakışkan cihazlar ile kombine edilebilir bir bilgi zenginliği verir. Burada açıklanan yöntem kolayca bir hücre biyolojisi laboratuvar (Şekil 1) de uygulanabilir olması hücre göçü için bir görüntüleme tahlil oluşturmak için ticari olarak mevcut microfluidic bölme ile bağlantılı olarak yüzey modifikasyonu için basit ve köklü bir dizi adım kullanır. MonteMikroakışkan cihaz cam 17 ile karşılaştırılabilir ve dağılabilir molekül gradyanlar en az 16 saat boyunca stabil optik nitelikleri vardır. Sistem Epifloresans ve ileri mikroskopi için teknikler de kullanılabilir. Diğer kemotaksisi düzeneklerinin 18 farklı olarak, bu sistem yavaş yavaş göç eden, yapışık hücre kayıt için uygundur. Önemlisi, sistemin modüler ve kolaylıkla alternatif yapıştırıcı veya çözünebilir göç ipuçları ve çeşitli hücre tiplerinin incelenmesi giriş sağlar.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

Hücreler gibi ekstrasellüler matriks ve bu büyüme faktörleri gibi çözünür ipuçlarının glikoproteinleri gibi yapışkan ipuçlarının yüksek konsantrasyonlarda doğru algılayıp geçirebilirsiniz. Burada, canlı hücre görüntüleme ile uyumlu bir mikroakışkan haznesi, yapışkan ve çözünebilir ipuçlarının karşıt degradeler oluşturmak için bir yöntem özetlemektedir. Poli-L-lisin ve polietilen glikol (PEG-PLL) bir kopolimerin cam lameller etkisizleştirmek ve biyomoleküller ve hücre spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için kullanılır. Daha sonra, mikrokontak baskı ya da daldırma kalem litografi yapıştırıcı işaret olarak biyotinile peptid arjinin-glisin-aspartik asit (RGD) için bağlantı noktaları olarak görev yapan pasif yüzeyler üzerinde streptavidin üzerinden parçaları oluşturmak için kullanılır. Bir mikroakışkan cihaz modifiye edilmiş yüzeye yerleştirilir ve streptavidin parça üzerinde yapışkan işaretler (100% 0 ile% RGD RGD) ve gradyan oluşturmak için kullanılır. Son olarak, aynı mikroakışkan cihaz bir kemoatraktan Suc bir gradyan oluşturmak için kullanılıryapışkan ipuçlarının gradyanı ters yönde çözünür işaret olarak fetal bovin serumu (FBS), gibi h.

Hücre göçmen sinyalleri 25 entegre anlamak için, biz rakip yapıştırıcı ve çözünür eğimleri (Şekil 1) ile bir ortamda geçirmeniz floresan mikroskobu ile görüntü hücreleri için bir yöntem geliştirdik. Floresan streptavidin biotinlenmiş RGD içerdiği Yapıştırıcı şarkıları mikrokontak baskılı parçalar ve daldırma kalem litografi (Şekil 2) ile oluşturulmuştur. Başarılı mikrokontak baskı yapışkan parçalar ve anti-kirlenme bölgeleri a?...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Görüntüleme.  The University of New South Wales. Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Video: Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Biodissolvable Yapıştırıcı ile Attached sert katılaştıncılar kullanma Esnek Sinir Sondalar ekleme

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Biyomühendislik

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...