Bu çalışma INSERM, Lille 2 Üniversitesi tarafından desteklenen, MEDIALZ, LabEx (mükemmellik laboratuvar program geleceğe yatırım) ve DISTALZ (Alzheimer hastalığı için bir Transdisipliner yaklaşım Yenilikçi Stratejilerinin Geliştirilmesi). FJ.FG anda ANR (Fransız Ulusal Araştırma Ajansı / NeuroSplice de Tau 01 Projet Deurne-2010-BLAN-1114) bir alıcı dostluk olduğunu, ancak bu çalışma JCCM (İspanya) bir hibe desteği altında da oldu.

1.. Homojenizasyon İnsan ve Fare Beyin Dokusu Toplam Protein Ekstraksiyon <ol><li> Beyin dokusu homojen hale getirilmesi. Bir (insan örnekleri için) potter cam veya (farenin örnekleri için) teflon homojenleştirici kullanılarak beyin dokusu% 10 (w / v), 8 M üre içinde, 2 M tioüre ve a / h SDS tamponu (UTS)% 1 homojenize. 60 Hz toplam doku parçalanması 13, 14 için 0.5 saniye başvuran bir ultrason jeneratörü ile 30 darbeler sonikasyon. <ol><li> Standart olarak BSA kullanılarak Bradford tayini ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Bu tampon çıkarma sürece lisatları Karbamilleme 15 önlemek için ısıtılmış fazla değil gibi bir boyut SDS-PAGE ile tamamen uyumludur UTS. </li><li> % 1 ekleme (ağ / hac) Amberlite ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe karıştırılarak inkübe edilir. Daha sonra 0.22 um şırınga filtreleri üzerinde filtre edilir ve son olarak, üre / tiyoüre çözeltisine SDS ekleyin. Bu adım equilibr olan ürik asit ve izosiyanik asit miktarını azaltırçözelti içinde üre ile birlikte amonyum ve bozulma kolaylaştırır. </li></ol></li><li> Kloroform / metanol protein çökeltme. (Bağımsız bir şekilde, IEF gerçekleştirmek için seçilen pH aralığında) 18 cm olanlar için 11 cm IPG pervazlar ve 1-1.5 mg protein 100-150 ug arasında çöktürün. <ol><li> Buz üzerinde veya 4 ° C&#39;de tüm adımları uygulayın Çökeltme işlemi başlamadan önce 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de serin, kloroform ve metanol. </li><li> UTS lizatının bir hacim metanol üç hacim ve kloroform arasında bir hacim. Elle karışım çalkalanır ve soğuk su, üç hacim ekleyin. 1 dakika boyunca, 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ile pelet proteinleri Vortex </li><li> Pasteur pipet kullanarak süpernatant atın ve soğuk MeOH üç birimler eklemek. Daha vorteksleyin ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 xg&#39;de santrifüj Nihayet supernatant atmak ve N2 altında pelet kurulayın. </li></ol></li><li> 2D protein analizi için hazırlanması.2D-tamponu içinde protein kurutulmuş pelet (8 M üre,% 4 CHAPS ile takviye edilmiş 2 M tiyoüre) yeniden süspanse edin. Yukarıda belirtildiği gibi Amberiite ile çözüm yıkayın ve 2D-DIGE için 2D tampon 200 ul başına protein 500 ug oranını tutmaya çalışın. Not: 2D tampon -80 ° C&#39;de saklandı veya (üre bozulmasını önlemek için), bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. <ol><li> Sonikasyon ve aşağıdaki adımı gerçekleştirilmesi kadar -80 ° C&#39;de örnekleri saklayın. Protein formik asit çözündürme 10 agrega sonra kayda değer, bu protokol kullanılabilir. Kısaca, N2 altında formik asit buharlaşır ve tarif edildiği gibi pelletini. </li></ol></li></ol> 2.. 2D-DIGE <ol><li> Numuneler kalitesini test. Yine Doz örnekleri Bradford yöntemi kullanılarak. LDS numune tamponu, ısı 37 ° C de 15 protein 15 ug seyreltilmiş ve% 4-12 poliakrilamid jellerin üzerine yerleştirin. </li><li> Coomassie boyaması. % 0.1 poliakrilamid jel Leke (ağ / hac) CoomassieMavi G-250,% 50 EtOH ve% 10, en az 1 saat boyunca (v / v) asetik asit çözeltisi. Arka plan% 7 asetik asit ve% 10 (v / v) etanol çözeltisi gece boyunca destain olsun. </li><li> Numunelerin ön-elektroforetik etiketleme. Önceki siyanin boyası etiketleme gerçekleştirmeden, N-hidroksisüksinimid, ikame bir baz pH değerinde daha etkilidir ve pH 8.6 de uygun olduğu verilen Başlangıcı bazik ya da nötr olmalıdır, numunenin pH kanıtlamıştır. <ol><li> 50 ug protein/400 pmol boya bir oranı ile, Cy3 veya Cy5 floresan boyalar ile birlikte çalışma minimal iki numune etiketleyin ve protonlanmamış amin ile siyaninler NHS ester reaktif bir grup kolaylaştırmak için karanlıkta 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca devam lisin grupları. </li><li> Belirli cyanine için, bir numunenin bir tercihli bağlanmasını önlemek, Cy3 ve Cy5 boyalarla enine etiketleme yapmak örnek varyasyonu azaltır. Siyanin boyası-minimal etiketleme pr 1 ug oranını tutulması ile proteinlerin küçük bir miktar için adapte edilebilir unutmayın8 pmol cyanine-boya başına otein. Eğer öyleyse, mini 2DE sistemi, bunun yerine büyük bir 2 boyutlu jel sistemi kullanılabilir. Bu beyin dokusunun küçük bir miktar için 2D-DIGE analizini sağlayacaktır. </li><li> Cy2&#39;nin floresan boya ile protein aynı miktarda (toplam 50 ug), her iki numune, bir havuz etiketleyin ve iç standart olarak kullanılmıştır. Daha önce belirtildiği gibi aynı koşullar kullanın. </li><li> % 1.1 Destreak reaktifi, IPG tamponu ve% 1.2 bromofenol mavisi etiketli proteinler, toplam 150 mg (Cy2, 50 ug, Cy2, Cy3, 50 ug ve 50 ug) izleri ihtiva eden 2D tamponu ile toplam hacmi 350 ul komple. Dört bağımsız şeritleri kullanarak dört nüsha olarak bu adımı gerçekleştirin. Ayrıca, hazırlayıcı jeller için protein 350-450 ug ile iki etiketli olmayan şeritler (her bir numune için bir adet) hazırlar. </li><li> Pasif rehidrasyonu için mineral yağ ile kaplanmış bir gece boyunca altı yüklenen şeritler bırakın. </li></ol></li><li> Isoelectrofocusing. 20&#39;de IEF yürütmek6; C. PH 3-11NL için, 18 cm protokolü şerit olduğunu: maksimum akım ayarı 8 aşamalarında 50 uA / şerit: 1) 150 V 1 saat için adım 2) 200 V 5 saat, 3) 500 V gradyan adım için 2 saat, 2 saat için 4) 1.000 V gradyan, 5) 2000 V 2 saat boyunca eğimli, 6), 4,000 V 2 saat boyunca gradyan, 7) 8.000 V ve 2 saat 8) 24.000 V bir toplam için degrade · hr adım . IEF sonra kromatografi kağıdı kullanarak mineral yağın aşırı sevk ve ikinci boyut kadar -20 ° C &#39;de şeritler saklayın. </li><li> IPG dengelenmesini Şeritleri. Aynı tampon içerisinde iyodoasetamit% 4.7 ile değil DTT olmadan 6 M üre,% 2 SDS,% 30 gliserol, 50 mM Tris-HCl, pH 15 dakika boyunca DTT% 1 ile 8.6 tamponu içinde ve sonra şeritler dengelenmesi. </li><li> İkinci boyut veya SDS-PAGE elektroforez. Altı 12% SDS-PAGE jelleri (1.5 M Tris-HCl pH 8.6,% 12 akrilamid / bisakrilamid,% 0.1 (ağ / hac) SDS,% 0.072 (ağ / h) APS ve% 0.1 (v / v) Yap TEMED ) stri için dört düşük floresan cam plakalar ile, büyük bir 2D sistemini kullanarak aynı andaprotein noktalar tüketim için hazırlayıcı jeller için kalınlığı 1.5 mm ile floresan örnekleri ve diğer iki cam plakalar ile ps. <ol><li> (Ağırlık / hacim)% 0.5 agaroz ile jeller üzerinde ve tabakalı fazla altı IPG Şeritler yerleştirin. Çalıştırma tamponu 25 mM Tris, 192 mM glisin ve% 0.1 (ağ / hac) SDS oluşmaktadır. 4 ° C 16,17 ayarlanmış bir soğutma sistemi ile bir gecede 2,5 W / jel &#39;de göç yürütmek. </li></ol></li><li> Floresan görüntüleri toplama ve analizi. Floresan jeller görüntüleri (bir deney için 12 fotoğraf) elde etmek için bir Typhoon 9400 tarayıcı kullanın. Tarama Cy2&#39;nin, 488/520 nm, 532/580 nm ve 630/670 nm uyarma / emisyon dalga boylarında, sırasıyla her jel için Cy3 ve Cy5 görüntüler. Görüntüleri analiz etmek bilişim yazılımı kullanın. Veriler, incelenen iki örnekleri arasında dört jeller üzerinde sinyalinin dağıtımı ile ilişkili bir yer hacim değişiklikleri temsil etmektedir. </li><li> Büyük jeller için Coomassie boyaması. 5 olarak hazırlayıcı jeller saptamak0% (v / v) EtOH ve% 3, en az 24 saat boyunca (hacim / hacim) orto-fosforik asit çözeltisi. Daha sonra, 20 dakika için ultra saf su ile iki kere yıkayın. % 34 bir renk gerçekleştir (v / v) MeOH,% 17 (a / h) amonyum sülfat ve (ağ / hac) Coomassie Blue G-250,% 0.1 ilave edilmeden önce 1 saat boyunca% 2 ortofosforik asit. En az 48 saat ve ultra saf su içinde rengi giderildi için renk olarak jeller tutun. <ol><li> MS tanımlanması için noktalar. Floresan görüntüleri analiz edildikten sonra, yazılım ifadesi istatistiksel olarak farklı noktalar bir listesini sağlar. Elle hazırlayıcı jellerin bu noktalar tüketim. Bu prosedür keratin kirlenmeyi önlemek için pratik ve bazı el becerisi gerektirir. Daha sonra örnekler MS kalma kadar -20 ° C sıcaklıkta su içinde tutulabilir. Nokta tanımlama Tandem kütle spektrometresi (MS / MS) ve protein kimliklerin alaka ile mükemmel uyumlu olasılık 0.05 (p &lt;0.05) 18 p-değeri ile hesaplanan tabanlı Mowse skor göre değerlendirilir. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3.. Nitel Mini-2DE Deneyi <ol><li> 2D protein numune tamponu içinde en fazla 100 ug yeniden süspanse edin, bir 11 cm IPG şerit için 200 ul bir son hacme kadar. Aşın sistem veya saflaştırılmış proteinin durumunda, başlangıç ​​miktarı 20 ug için düşürülebilir. </li><li> 200 ul son hacim olması için (v / v) Destreak Reagent,% 0.55 (v / v) ve IPG tamponu Bromofenol Mavisi izleri% 1.1 ekleyin. Daha sonra, girdap, hızlı döndüğü ve gece boyunca, mineral yağ ile kaplanmış (orijinal kalınlığının için şerit getirmek) için bir pasif rehidrasyon IPG şerit içine yükleyin. Not: IPG tamponu pH oranı istenen (pH 3-11, 4-7, 7-11, vb) her aralık için aynıdır, ancak bileşim, seçilen pH aralığının fonksiyonu olarak değişir. </li><li> Isoelectrofocalisation. 20 ° C&#39;de IEF yapın Programının süresi seçilen pH aralığına bağlıdır. Dikkate değer, bu tür electroendosmosis İEF profilini rahatsız olabilir ve bu durumlarda parametreler,electrofocalisation zamanında optimizasyonu 19 gereklidir. Not: Mutlaka daha iyi sonuç verir ama IEF&#39;nin süresini kısaltarak da çözünürlüğünü artırabilir uzun bir İEF değildir. IEF sonra IPG şeritler ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> IPG dengelenmesini şeritler. 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 20 mM DTT,% 10 gliserol,% 5 SDS,% 0.05 bromofenol mavisi ihtiva eden bir tampon içinde şeritler dengelenmesi. Üç dengeleme her banyosu arasındaki tampon çözeltisi değiştirme ile, 15 dakika boyunca banyoları yapın. </li><li> SDS-PAGE. Ilgilenilen proteinin MW bağlı olarak seçilir poliakrilamid bir yüzdesi olan bir prekast jel (IPG 1 de, 11 cm IPG şerit) üzerine IPG şeridi Katman. Daha sonra, 33 dakika boyunca 100 mV&#39;de bir nitroselüloz / PVDF zarı üzerine jel leke. </li><li> Gerekli antikor ile bir gece boyunca inkübe edin ve peroksidaz aktivitesi ile görselleştirmek. Ikincil antikor ile açığa olmayan polipeptidler kullanılarak İmmünoblotların hizalamalarını yapın. Yarı quantit ulaşmakImageJ yazılım ile izleri / noktalar için hacim ve yoğunluk dansitometreyle analizini Ative. </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grand+challenges+in+global+mental+health.">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li><li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Bu&#233;e, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-covalent+and+covalent+protein+labeling+in+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.</a> J Proteomics. 71, 231-244 (2008).</li><li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+DIGE+system:+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology.">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).</li><li>Westermeier, R., Scheibe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+gel+electrophoresis+based+on+lys/cys+tagging.">Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging.</a> Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ventral+furrow+morphogenesis:+a+proteomic+analysis.">Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis.</a> Development. 131, 643-656 (2004).</li><li>Gharbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+for+proteomic+expression+analysis+of+a+model+breast+cancer+cell+system.">Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+pathology+modulates+Pin1+post-translational+modifications+and+may+be+relevant+as+biomarker.">Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker.</a> Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).</li><li>Bretteville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+of+tau+mutants+reveals+specific+phosphorylation+pattern+likely+linked+to+early+tau+conformational+changes.">Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes.</a> PLoS One. 4, 4843 (2009).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+characterization+of+paired+helical+filament-tau+from+Alzheimer's+disease:+demonstration+of+an+additional+74-kDa+component+and+age-related+biochemical+modifications.">Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications.</a> J Neurochem. 69, 834-844 (1997).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+distribution+of+phosphorylated+tau+protein+isoforms+in+Alzheimer's+and+Pick's+diseases.">Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases.</a> FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).</li><li>Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents+and+chaotropes+for+protein+solubilization+before+two-dimensional+electrophoresis.">Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).</li><li>Wrobel, K., Caruso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+procedures+for+characterization+of+arsenic+and+selenium+species+in+complex+samples+utilizing+coupled+techniques+with+mass+spectrometric+detection.">Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection.</a> Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).</li><li>McCarthy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbamylation+of+proteins+in+2-D+electrophoresis--myth+or+reality.">Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality.</a> J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).</li><li>Chafey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+beta-catenin+activation+in+mouse+liver+by+DIGE+analysis+identifies+glucose+metabolism+as+a+new+target+of+the+Wnt+pathway.">Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway.</a> Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).</li><li>Kahn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+blood+eosinophils+reveals+redox+signaling+modifications+in+patients+with+FIP1L1-PDGFRA-associated+chronic+eosinophilic+leukemia.">Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia.</a> J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).</li><li>Pottiez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+electrophoresis-+and+chromatography-based+determination+of+gene+expression+profiles+in+bovine+brain+capillary+endothelial+cells+after+the+re-induction+of+blood-brain+barrier+properties.">A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties.</a> Proteome Sci. 8, 57 (2010).</li><li>Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+2D+Gel+Electrophoresis+with+Immobilized+pH+Gradients:+IPG+Strip+Equilibration.">Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration.</a> CSH Protoc. , (2006).</li><li>Azimzadeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics.">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+p16-Arc+subunit+of+the+Arp+2/3+complex+as+a+substrate+of+MAPK-activated+protein+kinase+2+by+proteomic+analysis.">Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis.</a> J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+thiourea+to+increase+the+solubility+of+membrane+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis.">Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).</li><li>Molloy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+membrane+proteins+by+differential+solubilization+for+separation+using+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).</li><li>Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+from+cryopreserved+brain+tissue+samples.">Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples.</a> Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).</li><li>Shaw, M. M., Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.</a> Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+solubilization+for+the+analysis+of+the+CD14+human+monocyte+membrane+proteome+using+LC-MS/MS.">Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS.</a> J Proteomics. 73, 112-122 (2009).</li><li>Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteome+analysis+of+the+preeclamptic+placenta+using+optimized+protein+extraction.">Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).</li><li>Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+zwitterionic+detergent+in+two-dimensional+gel+electrophoresis+of+trout+liver+microsomes.">The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes.</a> Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).</li><li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+tau+neuropathology+leads+to+memory+deficits+and+loss+of+functional+synapses+in+a+novel+mutated+tau+transgenic+mouse+without+any+motor+deficits.">Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits.</a> Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).</li><li>Veenstra, T. D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics.">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li><li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins,+neurotransmission+and+mouse.">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies.">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li><li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.

Proteinlerinin patolojik ifadesi değişiklikleri keşfetmek, biyomarkerler için arama ve farmakolojik hedefler için potansiyel yolların modülasyon neuroproteomics amaçları arasındadır 30 yaklaşır. Gelişmekte olan araçları ortasında, 2DE alan bir gelecek vaat expectative ekler. Bununla birlikte, bir konsensüs değişkenliği en aza indirmek ve deneylerde tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla ulaşılmalıdır. Bu fikrin doğrultusunda 2D-dige (Şekil 2) ve mono-boyutlu immun...

Zihinsel ve nörolojik bozukluklar hastalık küresel yükünün% 13 temsil eden, patofizyolojik mekanizmaları, risk faktörleri ve prodromal biyomarkerler gibi yeni sorunlar 1 araştırılmalıdır. Bu amaç doğrultusunda, insan beyninin proteomiks çalışmalar fizyolojik hem de patolojik koşulları için değil, sadece hafıza, davranış, duygu ve örneğin nöronal plastisite gibi süreçlerde moleküler yolları ortaya çıkarmak için vazgeçilmez hale. Bu nedenle, hayvan modellerinin kullanımı ve daha özel olarak ise transgenik fareler, insan nörodejeneratif hastalıkların 2 etyolojisini taklit etmek mümkün olan geniş bir yelpazede getiriyor. Proteomiks yaklaşımlar nörobilim alanında bu yeni perspektifler başarmak için günümüzde mevcuttur. İki boyutlu jel elektroforezi (2DE) Numunelerin geniş bir proteomesini karşılaştırma sağlayan bir kuvvetli ve muhtemelen basit bir yöntemdir. Ayrıca, aynı zamanda birbelirlemek amacıyla kompleks bir karışımdan bir proteini izole etmek ve ayrıca kütle spektrometresi ile analiz etmek için güçlü bir yöntem. (IEF) ile isoelectrofocusing izoelektrik noktası (pl) &#39;ye göre 1) protein ayırma: Bu teknik, esas olarak birbirini takip eden iki adımda oluşur. Daha özel olarak, bir elektrik potansiyeli arasındaki bir pH gradyanı Immobiline akrilamid şeritler arasında uygulanır ve daha sonra proteinler göç ve küresel net yük fonksiyonu olarak belirli bir pl odaklanacaktır. 2) Isoelectrically odaklı proteinler ilk yapısında, böylece proteinler SDS-PAGE ile 3 bunların görünür molekül ağırlığı (MW) bağlı olarak ayrılmış) denatüre edilmiş ve negatif sodyum dodesil sülfat (SDS ilavesiyle ücret. Bu iki farklı özellikler bize proteomun çalışmada daha ileri gitmek için bir çift değer mücadele verir. Bir yandan bu yaklaşım, minimal boyalar 2D-DIGE yöntemi kullanılarak, kantitatif analiz için imkanı sunar, ve diğer taraftan bir Nitelmini 2DE e analiz western blot bağlanmıştır. 2D-Dige ile kantitatif analiz protein ekspresyon tüm numune proteomun geçer bahşetmiştir. Kısaca, numuneler üç farklı dalga boylarında (mavi, yeşil ve kırmızı) de yayan üç siyaninler (Cy2, Cy3 ve Cy5) ile etiketli. N-hidroksi succinimidyl ester grubu içeren en az bir flor Bu boyalar, kovalent amid bağları 4 sonuçlanan protein lizinlerinin kalıntılarının ε-amino grubu ile reaksiyona girer. Lizin kalıntıları sadece% 1-3 arasında ve böylece protein başına birden fazla etiket ekleme ve büyük net ücret değişikliklerini 5, 6 önlenmesi etiketli. Cy3 ve Cy5 genellikle Cy2 karşılaştırma örneklerinin eşit oranda bir karışımı etiketler ise iki bağımsız örnekleri etiketlemek için kullanılır. İki ana avantajları, İşaretlenmiş örnekler karıştırılır ve IEF-PAGE ve SDS karşılaştırma jeller dolayı deneyler arasında en arası değişkenliği kaçınarak, her bir aşama için bir kerede bir jel içinde gerçekleştirilmektedir vardır. Ayrıca, protein 7 çevresinde 1 femtomole yüksek bir algılama eşiğini gösterir. Jeller taranır ve 2D yazılım Cy2, kütle spektrometrisi ile posterior tanımlanması için noktalar arasında istatistiksel farklılıklar tanımlamaya olanak sağlayan bir iç standart olarak hizmet 2B jel floresan görüntü karşılaştırır edilir. Dahili standart kullanarak 2B analiz yazılımı istatistiksel güvenliği 8 fazla% 95 örneği arasında fark% 10&#39;dan daha az hızlı bir algılama sağlar. Mini 2DE nitel analizi, protein karakterizasyonu için çok önemli bir adımdır. Prensibi daha önce pl ve MW ayrılması için anlatılan ile aynı olmakla birlikte, bu durumda, proteinlerin bir membran için küçük bir poliakrilamid jelinden aktarılır ve immunoblotting daha sonra gerçekleştirilir. Bir boyut jel elektroforezi bir ya da antikorun fonksiyonu informatio çeşitli protein epitoplar için protein ifadesindeki değişiklikler sağlarkenmini 2DE n iki ek parametreleri ile endows. İlk olarak, protein isovariants post-translasyonel modifikasyonlar yer alabilir belirten pl fonksiyonu olarak değişir. İkincisi, kütle spektrometresi kimlik makul zimogen ve proteinlerin katabolik ürünleri göstergesi olabilir. Bu nedenle, 2-dige ile gözlemlenen değişiklikler küresel proteom profilinde bir değişiklik altında yatan mekanizmaların gösterge muhtemeldir. Mini 2DE ile aynı proteini epitopiarı / s için çeşitli örnekler arasında İmmünoblotların Hizalanmalar asitliği az görülmüştür post-translasyon değişimleri içine ışık tutan bir değişiklik ya da değil monodimensional imünoblotlarını 9, 10 ile yansıtabilir. Ayrıca bu analiz metabolik kalıntılarının 11,12 pl ve MW bilgisi nedeniyle potansiyel yarılma bölgeleri hakkında bilgi verir. Bu iki tekniğin kombinasyonu tamamlayıcı proteomiks analizini sağlar. Bir yandan, bir 2D-DIGE tipik değer elde edilirifade farklı polipeptidleri, tam bir izolasyon sağlar farklılıklar e. Bu farklılıklar, bir nokta ya da floresan jellerin analiz yazılımı, belirli bir tek yoğunluğunun artış / azalış görünümünü kayboluşu ya da esas olarak oluşur. Bununla birlikte, tek başlarına bu gözlemler gözlenen değişiklik doğasını açıklamak için olası değildir. En isovariant / izoformu seviyesindeki değişiklik: polipeptid izole edilmiş ve kütle spektrometresi ile tanımlanır kez Bu nedenlerle, mini 2DE kullanılmasıdır) tam olarak 1 onaylamak için izole proteinin kimliğini ve farkın 2) doğasını sağlar Örneğin ekspresyon, post-translasyonel modifikasyonlar ve bölünme işlemleri. Ancak, çok farklı olan ekstraksiyon protokollerin kullanımından kaynaklanan potansiyel dispersiyonlar sınırlamak amacıyla 2D-dige ve mini 2DE uyumlu hem de bir başlangıç ​​lizis tamponu geliştirmek için gereklidir. Bu yazıda, biz de2D-dige ve insan ve fare beyin dokusundan gelen proteinler için mini 2DE tekniklerinin hazırlanması, ekstre etme ve performans için uyarlanmış bir protokol açıklandığı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

İki boyutlu jel elektroforezi (2DE) potansiyel olarak farklı fizyolojik veya patolojik durumlar ile ilgili proteomdaki değişiklikleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Temel olarak, bu teknik, SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile bir birinci aşamada, izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması, ve ikinci olarak, moleküler ağırlıklarına göre dayanmaktadır. Bu raporda insan post-mortem ve fare beyin dokusu az miktarda için optimize edilmiş bir numune hazırlama protokolü tarif edilmiştir. Bu yöntem, hem iki boyutlu, floresan fark jel elektroforezi (2D-DIGE) ve mini 2DE immünoboyama gerçekleştirmenizi sağlar. Bu yaklaşımların kombinasyonu tek bir kütle spektrometresi algılama ile uyumluluk için kendi ifadesi sayesinde yeni proteinler ve / veya protein değişiklikleri bulmak için değil sadece sağlar, aynı zamanda işaretçileri doğrulama yeni bir fikir. Böylece, mini 2DE sonrası belirlemek ve doğrulamak için batı lekeleme izin birleştiğinde-Translasyonel modifikasyonlar, protein katabolizma ve farklı koşullar ve / veya tedaviler arasında niteliksel bir karşılaştırma sağlar. Burada, bu tür amiloid beta-peptidi ve alfa-sinüklein olarak AD ve Lewy vücut demans bulunan protein agrega bileşenlerinin çalışma için bir yöntem sağlar. Önerilen yöntem, böylece proteomun analizi için uyarlanabilir ve çözünmeyen proteinler, çok insan beyin dokusu ve farenin modelleri çıkarmak. Buna paralel olarak, nörodejeneratif hastalıklar gibi olası yeni biyolojik belirteç ve terapötik hedefler yer moleküler ve hücresel yollarının çalışması için yararlı bilgiler sağlayabilir.

İdeal bir tampon proteinlerin% 100, özellikle membran-ilişkili veya hücre iskeleti proteinleri kurtarmak için var yana beyin dokusu üzerine Proteomiks zorlu kalır. Deneylerin ilk seti proteinin büyük bir panel kurtarmak sağlayan iki yaklaşım ile uyumlu uygun bir parçalama tamponu için arama üzerinde duruldu. Böylece, üç lizis tampon, en uygun olanı belirlemek için analiz edilmiştir. İlk olarak,% 1 ile 10 mM (w / v) SDS (Şekil 1A), ortak biyokimyasal ve moleküler biyoloji tampon T...

Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Görüntüleme.  Inserm UMR 837.  İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar. 

Video: Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Fragile X Sendromu ve Otizm Bireylerde Plastisite, Mechasnism keşfedin Theta-Burst Protokolü kullanma

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Nörobilim

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

Tatlandırıcı Kodlamanın Yeni Yöntemleri

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Extraction and Dissection of the Domesticated Pig Brain

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular systems, gastrointestinal systems, and nutrition, and the pig is increasingly being used as a large animal model in neuroscience. Furthermore, the pig is an accepted model to study neurodevelopment as it displays brain growth and development patterns similar to what occurs in humans. As a less common animal model in neuroscience, surgical and dissection procedures on pigs may not be as familiar or well-practiced among researchers. Therefore, a standardized visual protocol detailing consistent extraction and dissection methods may prove valuable for researchers working with the pig. The following video showcases a technique to remove the pig brain while keeping the cortex and brainstem intact and reviews methods to dissect several commonly investigated brain regions including the brainstem, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus, and medial prefrontal cortex. The purpose of this video is to provide researchers with the tools and knowledge necessary to consistently perform a brain extraction and dissection on the four-week-old pig.

This protocol details the technique for removal of the pig brain in its entirety and dissection of several brain regions commonly studied in neuroscience.

Evcilleştirilmiş Domuz Beyninin Ekstraksiyonu ve Diseksiyonu

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular ...

Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. Besides neuromelanin, NMGs contain a variety of proteins, lipids, and metals. Although NMGs-containing dopaminergic neurons are preferentially lost in neurodegenerative diseases like Parkinson&#39;s disease and dementia with Lewy bodies, only little is known about the mechanism of NMG formation and the role of NMGs in health and disease. Thus, further research on the molecular characterization of NMGs is essential. Unfortunately, standard protocols for the isolation of proteins are based on density gradient ultracentrifugation and therefore require high amounts of human tissue. Thus, an automated laser microdissection (LMD)-based protocol is established here which allows the collection of NMGs and surrounding substantia nigra (SN) tissue using minimal amounts of tissue in an unbiased, automatized way. Excised samples are subsequently analyzed by mass spectrometry to decipher their proteomic composition. With this workflow, 2,079 proteins were identified of which 514 proteins were exclusively identified in NMGs and 181 in SN. The present results have been compared with a previous study using a similar LMD-based approach reaching an overlap of 87.6% for both proteomes, verifying the applicability of the revised and optimized protocol presented here. To validate current findings, proteins of interest were analyzed by targeted mass spectrometry, e.g., parallel reaction monitoring (PRM)-experiments.

A robust protocol is presented here for isolating neuromelanin granules from human post-mortem substantia nigra pars compacta tissue via laser microdissection. This revised and optimized protocol massively minimizes the required time for sample collection, reduces the required sample amount, and enhances the identification and quantification of proteins by LC-MS/MS analysis.

Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. ...

fNIRS Çalışmalarında Devrim Yaratmak: Nöral Eşleşmeye Yeni Bir Yaklaşım

New Framework for Understanding Cross-Brain Coherence in Functional Near-Infrared Spectroscopy (fNIRS) Hyperscanning Studies

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals using wavelet transform coherence (WTC) seems to ignore the directionality of the interaction. The field is currently lacking a framework that allows researchers to determine whether a high coherence value obtained using a WTC function reflects in-phase synchronization (i.e., neural activation is seen in both members of the dyad at the same time), lagged synchronization (i.e., neural activation is seen in one member of the dyad prior to the other member), or anti-phase synchronization (i.e., neural activation is increased in one member of the dyad and decreased in the other). To address this need, a complementary and more sensitive approach for analyzing the phase coherence of two neural signals is proposed in this work. The toolbox allows investigators to estimate the coupling directionality by classifying the phase angle values obtained using traditional WTC into in-phase synchronization, lagged synchronization, and anti-phase synchronization. The toolbox also allows researchers to assess how the dynamics of interactions develop and change throughout the task. Using this novel WTC approach and the toolbox will advance our understanding of complex social interactions through their uses in fNIRS hyperscanning studies.

Yazar Spotlight: fNIRS Çalışmalarında Yeni İçgörülerin Kilidini Açmak - Beyinler Arası Senkronizasyon Analizi için Yeni Bir Çerçeve 

Wavelet transform coherence (WTC) is a common methodology for assessing the coupling between signals that is used in functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies. A toolbox for assessing the directionality of the signal interaction is presented in this work.

Fonksiyonel Yakın Kızılötesi Spektroskopisi (fNIRS) Hipertarama Çalışmalarında Beyinler Arası Tutarlılığı Anlamak için Yeni Çerçeve

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals ...