Oküler örneklerin kapsamlı proteom analizi için yüksek kaliteli kütle spektrometresi uyumlu örneklerin hazırlanması, sağlık ve hastalıkla ilgili moleküler mekanizmaları ve sinyal yollarını açıklamak için çok önemlidir. Açıklanan iş akışı, oküler mikro kan damarları gibi kitle sınırlı örneklerin analizi için özel olarak hazırlanan sıkı numune hazırlama adımlarına basit ama sağlam bir yaklaşımı temsil eder. Çalışmanın temel amacı oküler kan damarları için MS uyumlu bir metodoloji oluşturmak olmasına rağmen, açıklanan iş akışı geniş çeşitli hücre ve doku bazlı örneklere uygulanabilir.
Seçilen kısa posterior siliker arterin veya SPCA dallarının tanımlanması ve izole edilmesi zor olabilir, çünkü genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edebilir. Taze domuz gözleri, optik sinir ve ekstraoküler dokular ile birlikte, hemen post-mortem lokal mezbaha elde edildi. Buz gibi Krebs-Henseleit tampon içeren bir diseksiyon odasına göz küreyerleştirin.
Dikkatle keskin Mayo makas bir çift ile çevreleyen kas ve dokuları kesip. Bir neşter ile bir kesi yapmak, ve göz ön ve arka yarıya ayrılır kadar keskin Mayo makas bir çift ile ekvator düzlemi boyunca küre kesti. Standart desen forceps bir çift kullanarak gözün arka yarısından mümkün olduğunca çok vitreus vücut çıkarın.
Dikkatle gözün arka yarısını pin diseksiyksiyon pimleri kullandıktan sonra, yavaşça optik sinir çevreleyen bağ dokuları kesip, öğrenci Vannas bahar makas bir çift ile altta yatan retrobulbar vaskülatür ortaya çıkarmak için. Tip beş hassas cımbız ve Vannas capsulotomy makas bir çift ile çevreleyen bağ dokuları ile birlikte paraoptik ve distal kısa posterior siliker arter izole. Kirleri ve kan artıklarını gidermek için buz gibi PBS izole arterleri durulamadan önce ekstra ince uçlu cımbız ve makas kullanarak arter segmentlerinden yavaşça bağ dokularını çıkarın.
Havuz arterler iki göz bir biyolojik çoğaltma elde etmek için, daha sonra analitik bir denge kullanarak örnekleri tartmak. Her tüp için, doku protein iksiyon reaktif ardından 0,5 ve bir milimetre zirkonyum oksit boncuk karışımı ekleyin. Şimdi, örnek tüpleri bir blender homogenizer içine yükleyin.
Zamanlayıcıyı iki dakikaya ayarlayın, hız seviyesini altıya ayarlayın ve homojenleştirmeye başlayın. Çalıştırdıktan sonra, tam homojenizasyon için örnekleri kontrol edin ve her çalışma arasında buz üzerinde örnekleri tutun. Örnekler tamamen homojenize olana kadar döngüyü tekrarlayın.
Dikkatle taze mikrosantrifüj tüpler içine homojen pipet. Numuneleri 10,000 kez G'de 20 dakika 4 santigrat derecede, çözünmez proteinleri peletlemek için santrifüj edin. Pelet tabakasına dokunmadan çözünen proteinleri içeren süpernatantı dikkatlice pipetleyin ve taze mikrosantrifüj tüplere aktarın.
Her pelet örneğine 200 mikrolitre Ekstraksiyon Tamponu 2A ve beş mikrolitre proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin. Daha sonra, bir pipet ile pelet birkaç kez askıya alın. Tamamen pelet homojenize etmek için bir ultrasonik homojener kullanın.
Genliği 60'a ayarlayın ve bire doğru ayarlayın. Küçük hacimli numunelerin homojenizasyonu için uygun titanyumdan yapılmış bir prob kullanın. Sondayı peletve ekstraksiyon tampon karışımına buza batırın ve başlat düğmesine basın.
Pelet kümeleri tamamen homojen hale gelene kadar numuneyi sonicate, her sonication arasında birkaç saniye duraklatma. Görsel olarak tam homojenizasyon olup yok. Hiçbir kümeleri olduğundan emin olmak için bir pipet ile birkaç kez homojen karıştırın.
Bu işlem için üç kilodalton kesme ile santrifüj filtre cihazları kullanın. Üç kilodalton kesme filtre ünitesini mikrosantrifüj tüpüne takın. Pipet 200 mikrolitre numune bir filtre cihazına homojendir ve aynı filtreye 200 mikrolitre deiyonize su ekleyin.
Güvenli bir şekilde kapadıktan sonra, filtre ünitesini bir santrifüje yerleştirin ve 14.000 kez G'yi 15 dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Santrifüjden sonra, numune konsantresini içeren filtre ünitesini filtrasyon içeren mikrosantrifüj tüpünden ayırın ve filtrasyonu atın. Filtre ünitesine 400 mikrolitre deiyonize su ekleyerek konsantreyi yeniden oluşturun.
Filtrasyon üç kez tekrarlandıktan sonra, temizlenmiş numune konsantresini temiz bir mikrotüp haline dikkatlice pipetleyin. Metin protokolünde listelenen tek boyutlu jel elektroforeziçin örnekleri hazırlayın ve bir pipetle iyice karıştırın. Numuneleri kuru blok ısıtıcıda 70 derecede 15 dakika ısıtın ve oda sıcaklığına kadar soğutun.
Bir pipet kullanarak şerit başına 50 mikrogram numuneyi ve moleküler kütle belirteci olarak prestained protein standardını dikkatlice yükleyin. 175 volt sabit bir voltajda yaklaşık 60 dakika boyunca jelleri çalıştırın. Koşunun sonunda jeli dikkatlice bir jel bıçağı kullanarak kaset plakasından çıkarın ve jeli bir jel boyama kutusuna aktarın.
Metin protokolünde açıklandığı gibi jelin sabitleme ve boyama sını gerçekleştirin. En iyi genel sonuçlar için bir gecede boyama çözeltisi jelleri çalkalayın. Dikkatlice boyama çözeltisi decant ve arka plan temizlemek için suda en az yedi ila sekiz saat boyunca jelleri sallayarak önce deiyonize su 200 mililitre ile değiştirin.
Temiz yeni mikrotom bıçakları ile jel protein bantları excise. Küçük parçalar halinde bant kesin ve dikkatle 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpler içine jel parçaları aktarın. 100-milimolar amonyum bikarbonat ve asetonitril içeren destaining çözeltisi 500 mikrolitre ekleyin.
Örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın, ara sıra sallayın. Destaining çözeltisini dikkatlice pipetle. Artık lekeli tüpler için görsel olarak kontrol edin ve jel parçaları hala mavi lekeliyse bu adımı tekrarlayın.
Yaklaşık 400 mikrolitre taze hazırlanmış DTT çözeltisi ekleyin ve 56 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bir pipet ile azaltma çözeltisi attıktan sonra, taze hazırlanmış IAA çözeltisi yaklaşık 400 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Alkilleyici arabelleği pipetle çıkarın ve atın.
Jel parçaları küçülüp opak hale gelene kadar, 10 ila 15 dakika oda sıcaklığında düzgün asetonitil 500 mikrolitre ekleyin. Pipet asetonitile dışarı, ve hava-kaputun altında 5 ila 10 dakika boyunca jel parçaları kuru. Daha sonra, pipet 50 mikrolitre tripsin çözeltisi her tüpe jel parçalarını tamamen kaplar ve tüpleri dört santigrat derecede kuluçkaya yatırır.
30 dakika sonra, gerekirse jel parçalarını tamamen kapsayacak şekilde yeterli miktarda trypsin tampon ekleyin. Numuneleri bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Peptit ekstraksiyonu gerçekleştirmek için, tüplerden çıkarılan peptid çözeltisini dikkatlice pipetleyin ve temiz mikrotüplere aktarın.
Bir santrifüj vakum evaporatör supernatant kuru. Jel parçaları ile her tüp için ekstraksiyon tampon 100 mikrolitre ekleyin ve sallayarak 30 dakika kuluçka. Pipet kendi bantlarına göre çıkarılan peptidler içeren aynı mikrotüpler içine supernatant, ve bir vakum santrifüj aşağı kuru.
Metin protokolünde açıklandığı gibi peptit saflaştırma ve sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon MS/MS analizlerine devam edin. Her bir deterjan türü ile elde edilen numunelerde toplam protein miktarı burada gösterilmiştir. En yüksek verim doku protein ekstraksiyon tamponu ile elde edilen dokulardan geldi, bunu DDM, CHAPS, ASB-14 ve ACN ve TFA'dan en düşük verim izledi.
Tutarlı olarak, tespit edilen toplam proteinler de doku protein iksiyon tampon ayıklanan örnek en yüksek, ve toplam verim olarak aynı eğilimi izledi. Burada gösterilen spca tek boyutlu jel elektroforez protein profilleri karşılaştırma, önce ve optimize örnek hazırlama ve temizleme adımları tabi edildikten sonra. Genel olarak, üçüncü kulvarda yüksek oranda bulaşma ve protein bantlarının kötü ayrılması gözlendi.
Bu profil, örneklerin ekstraksiyon reaktifi ve lipidler ve hücresel enkaz gibi kirletici maddeler içerebileceğini göstermektedir. Ancak, supernatant ve pelet olarak ayrılan ve daha sonra optimize protokole tabi spca örnekleri, örnek tek boyutlu jel elektroforez profilleri ile sonuçlandı. Oküler mikrodamarlardan hızlı, sağlam ve etkili protein ekstraksiyonu için optimize edilmiş yöntem diğer doku bazlı numunelere de kolayca uygulanabilir.
Burada supernatant protein profilleri ve murine beyin ve kardiyak doku örnekleripelet vardır. Bu yordamı denerken, örnekleri homojenizasyona tabi taşırık, süpernatantı peletten ayırmak ve kirletici maddeleri ve ekstraksiyon reaktiflerini çıkarmak önemlidir. Bu teknik, geliştirildikten sonra deneysel ve çevirisel oftalmoloji alanında araştırmacıların, domuz gözlerini model olarak kullanarak osküler vaskülatür proteomunu iyice keşfetmelerinin önünü açmıştır.
