Bu çalışma Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bu yazının sponsorluk için Mıltenyı Bıotec GmbH ile (Bergisch Gladbach, Almanya) kabul etmek istiyorum, Dr Paolo Petrucciani insan buffy kat sağlamak için (Immuno-Hematoloji ve Transfüzyon Servisi, Hastane Lotti Pontedera, Pisa, İtalya Bölümü) ve Prof Massimo Pasqualetti (Biyoloji Bölümü - Hücresel Birim ve Gelişimsel Biyoloji, Pisa, Pisa Üniversitesi, İtalya) konut için fare kolonisi.

ETİK BEYANI İnsan ve hayvan örnekleri İtalyan Sağlık Bakanlığı yönergeleri izleyerek işlendi, kanun 116/92 ve Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi 86/609/EEC. 1.. Monosit Hücre Kültürleri <ol><li> % 10 insan serumu, 50 U / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin,% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 0.05 mM β-merkaptoetanol ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı ihtiva eden T-75 kültür şişelerinde insan THP-1 hücreleri,. </li><li> Bölünmüş kültürler zaman Konfluent (her 3-5 gün). </li></ol> 2. Bufi katlarından Periferik Kan Mononükleer Hücreleri (PBMC) izolasyonu <ol><li> Izolasyon protokolü başlamadan önce, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.2 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın, 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), tampon (1 durulama 95 ml 5 ml BSA stok çözeltisi ekleme,% 0.5 sığır serum albümini (BSA): 20 seyrelti). Tampon Degas ve 2-8 (soğuk tutmak° C). ÖNEMLİ: kabarcıklar izolasyon sütunu (adım 3.2) engelleyebilir çünkü tampon daha iyi daha sonuçlarının neden olabilir degas Başarısızlık. Not: Antikoagülan sitrat dekstroz formül-A (ACD-A) veya sitrat fosfat dekstroz (CPD) alternatif olarak kullanılabilir. Bunun tersine, diğer türlerden diğer albümin proteinleri veya sera BSA yerini alabilir. Ca 2 + veya Mg 2 + içeren tamponlar kullanmayın. </li><li> (20-60 yaş arası), sağlıklı donörlerden buffy kat edinin. </li><li> Yoğunluk gradyanlı santrifüj boyunca 50 ml konik tüp hazırlayın. Kan işleme (her boru seyreltilmiş kan 35 ml işleyebilir) ve her bir boş tüpe Ficoll-Paque 15 ml eklemek için gerekli olan tüplerin sayısını belirler. </li><li> PBS / BSA / EDTA solüsyonu (1:04 seyreltme) 24 ml kan 8 ml seyreltin. </li><li> Dikkatle (yoğunluk = 1.077 g / ml) 50 ml konik tüp, her biri Ficoll-Paque üzerine seyreltilmiş çözelti katman. Karıştırmayınkan ve Ficoll-Paque. ÖNEMLİ: Kan ve Ficoll-Paque karışımını engellemek için, 45 ° açıyla tüpü tutun ve yavaş yavaş kan karışımı katman. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje Mononükleer hücreler (MNC) granülositler ve eritrositler tortu ise nedeniyle Ficoll-Paque ozmotik basıncı daha yüksek yoğunluğa kadar, plazma-Ficoll-Paque arayüzünde kalır. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de PBS / BSA / EDTA ve santrifüj ile dolu yeni bir 50 ml tüp interfaz hücreleri (periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, PBMC&#39;ler) transferi </li><li> Trombositleri çıkarmak için PBS / BSA / EDTA ile iki kez pelet yıkayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 200 xg&#39;de Spin </li><li> % 10 insan serumu ve antibiyotik veya monositler saflaştırma devam tam RPMI-1640 içinde kültür hücreleri. </li></ol> 3. PBMC&#39;lerden Primer Monositler saflaştırılması <ol><li> Hum kullanarak manyetik boncuk ayırma ile PBMC&#39;lerden izole monositlerBir Pan monosit izolasyon kiti: <ol><li> Olası hücre kümeleri kaldırmak için 30 mikron naylon örgü (ön ayırma filtreler, 30 mikron) aracılığıyla hücrelere geçerler. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayısını belirlemek. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Aspire tamamen yüzer. </li><li> 10 7, toplam hücre başına PBS / EDTA / BSA tamponu 30 ul içinde süspanse hücre topağı. </li><li> 10 7 toplam hücre başına Engelleme Reaktif 10 ul FcR ekleyin. </li><li> 10 7 toplam hücre başına Biotin-Antikor Kokteyli 10 ul ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve 2-8 ° C&#39;de 5 dakika boyunca inkübe </li><li> 10 7 toplam hücre başına tampon 30 ul ekleyin. </li><li> 10 7 toplam hücre başına Anti-Biotin mikro, 20 ul ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve 2-8 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe </li><li> PBS / EDTA / BSA tampon maddesi içinde 500 ul hücre 10 8 kadar yeniden süspanse edin. </li></ol></li><li> Manyetik separtirme <ol><li> Buna göre toplam hücre sayısına uygun bir MACS Sütun ve MACS ayırıcı (MACS Sütun veri tablosuna bakınız) seçin. </li><li> Ayırıcı MACS manyetik alanı sütunu yerleştirin. </li><li> PBS / EDTA / BSA tamponu uygun miktarı ile durulanarak sütun hazırlayın (MS sütun: 500 ul; LS sütun: 3 mi.) Not: Kolonlar &quot;akış durdurma&quot; ve kuru çalıştırmayın. </li><li> Kolona hücre süspansiyonu uygulanır. Zenginleştirilmiş monosit fraksiyonunu temsil eden, etiketsiz hücrelerini içeren flow-through toplayın. </li><li> PBS / EDTA / BSA tamponu (500 ul MS ve yıkama başına LS 3 mi) ile sütun 3x yıkayın. </li><li> Zenginleştirilmiş monosit hücreleri temsil geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak ve bölüm 3.2.4 gelen akış yoluyla eklemek. Not: Sütun deposu boş olduğunda PBS / EDTA / BSA tampon alikot eklenerek sütun yıkayın. </li><li> (İsteğe bağlı) gelen sütun çıkarınayırıcı ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin. Kolona tampon pipet (1 mi; LS sütun: MS sütun 5 ml). Hemen sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik etiketli nonmonocyte hücreleri yıkayın. </li><li> Kültür,% 10 insan serumu ve antibiyotikler ile tam RPMI-1640 içinde monositler arıtıldı. </li></ol></li></ol> 4. Tüm kan Primer Monositler saflaştırılması <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre, tam kan monositten izolasyon kiti kullanılarak bütün kan monositleri arındırın. </li></ol> 5. Kan Lökositleri ve Arıtılmış Monositlerinde Nanoparçacık içselleştirilmesi <ol><li> 12 oyuklu bir plaka içerisinde izole edilmiş PBMC&#39;ler veya saflaştırılmış CD14 pozitif monositlerin Plate 5 x 10 5 hücre / ml (1 ml / çukur). </li><li> 100 nM&#39;lik bir çalışma konsantrasyonda komple ortam içinde Vortex FITC-SiO 2 nanoparçacık stok çözeltisi ve tekrar süspansiyon. </li><li> Çalışma nanop 10 ul ekle1 nM&#39;lik bir nanopartikül nihai konsantrasyon elde etmek üzere muamele edilmiş numuneler için madde süspansiyonu (100 nM). Her bir oyuğa, tedavi edilmeyen kontroller için tam ortam aynı hacim. </li><li> 1 saat içselleştirme 1.5 mi polipropilen tüp içinde örnekleri toplamak ve oda sıcaklığında 6000 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüj sonra bunları. </li><li> Oda sıcaklığında 6000 x g&#39;de tampon 3 dk çalışan 1 ml pelet yıkayın. </li><li> Çalışan tampon 200 ul pelet tekrar. Hücreler artık akış sitometri okumak için hazırız. </li></ol> 6. Primer karma Glial Kültürlerin izolasyonu (Bertero bakınız et al. 7) 7. Karışık Glial Konfluant Hücre Kültürü replating <ol><li> Daha sonra 10 ml Versene ekleyin ve 5-7 dakika için 37 ° C&#39;de inkübe, (w / Ca2 + / Mg2 + o) 10 ml PBS ile bir kez, bir T-75 balon içinde yıkayın. </li><li> T-75 yüzeyinden hücreleri ayırmak ve çözünmesi için yukarı ve aşağı birkaç kez üstte yüzen madde pipetHücre agrega. </li><li> Bir 15 ml polipropilen bir tüp içinde hücre süspansiyonu aktarın. Bir hemasitometre ile hücreleri saymak için hücre süspansiyonu, az miktarda toplayın. </li><li> Oda sıcaklığında 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve glial tam kültür ortamı içinde 5 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir son konsantrasyonda pelletini. </li><li> , 24 oyuklu bir plaka içerisinde, 0.5 ml / oyuk Plate ve hücreler, nanopartikül tedavi öncesi 2-4 saat razı sağlar. </li></ol> 8. Mikroglialar&#39;da Nanoparçacık içselleştirilmesi <ol><li> Her bir oyuğa (muamele edilmemiş kontroller için) tam bir glial kültür ortamı içinde 500 ul veya (muamele edilmiş örnekler için) tam bir glial kültür ortamı içinde bir 2x Rhodamine-SiO 2 nanoparçacık süspansiyonu 500 ul ekleyin. </li><li> Seçilen zaman noktalarında nonrapid-yapışan hücrelerin ayrılmasına izin verir ve 2 ml polipropilen tüpleri içinde bunları toplamak için hücrelerin Pipet. </li><li> 500 ul ekleVersene of her oyuğa ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin, daha sonra geri kalan hücre fraksiyonu ayırmak ve önceki aşamada elde edilen karşılık gelen yapışmamalı hücreleri ile her numune. </li><li> Oda sıcaklığında 300 xg&#39;de 3 dakika için örnekleri santrifüjleyin. </li><li> Tampon Koşu autoMACS 100 ul pelletini. </li></ol> 9. CD11-VioBlue ile boyanarak <ol><li> Tampon çalışan hücre süspansiyonu (1:11 oranı), 100 ul VioBlue-CD11b, insan / fare antikorunun 10 ul ilave edin ve 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe </li><li> Tampon çalışan 1 ml ilave edilir ve hücre süspansiyonu karıştırılır. </li><li> 300 x g, 3 dakika boyunca santrifüj her bir örnek. </li><li> Süpernatantı atın ve tampon çalışan 100-150 ul pelletini. </li><li> Sitometre için örnekleri Oku (son iki kademe arasındaki 4 ° C&#39;de saklayın örnekleri). ÖNEMLİ: örnekleri analiz etmeden önce, üst üste sinyalleri tazminat devam in emisyon spektrumları farklı fluorochromes (florokrom-eşlenik nanopartiküller ya da antikorlar) ile saptanmıştır. </li></ol> 10. Kompanzasyon spektral Kirliliği <ol><li> &quot;Cihaz ayarları&quot; kutusu (tüm alet yazılım programları mevcut) açın. Not: Malzeme Tablo bildirilen farklı bir enstrüman kullanıyorsanız, satın alma detayları için araç özel kılavuzuna başvurun. </li><li> Düşük akışkan hızı (cihaz tarafından izin veriliyorsa) de (nanopartikülleri olmadan) işlenmemiş örneği edinin. Satın alma sırasında, manuel voltaj kanalları düzenleyerek ileri ayarlayın ve yan saçılma (sırasıyla FSC ve SSC,). Not: En iyi arsa tam hücre popülasyonu görselleştirmek amacıyla SSC ve FSC eksen ölçekleri değiştirin. Ilgi her hücre tipi için şablon ayarı bir alet, oluşturulan kaydedilir ve gelecekteki satın alma için de kullanılabilir. </li><li> Özel açıkYazılım &quot;bölge&quot; sekmesi. İstenen nüfus etrafında uygun ve geniş bir bölgeyi (&quot;kapı&quot;) çizin. Not: nanopartiküllerin İçselleştirilmesi hücre SSC kayması neden olur. Kapı çok yakından ilgi hücre nüfusunun yaklaşık sınırlanmışsa, elde edilen veriler, büyük tespit edilecek olan hücrelerin bir kısmını kaçırmaz. </li><li> İki boyanmamış örnekleri, boş numune olarak kullanılmak üzere bir ve PI boyama (isteğe bağlı) karşı tazminat birini telafi edilecek her floresan kanal için uygun fluorokrom ile tek lekeli örnek kullanın. Not: Deney etiketleme kullanılmak üzere her bir florokrom-konjuge antikor için başka bir örnek 1.5 ml bir tüp kullanın. </li><li> &quot;Cihaz ayarları&quot; kutusuna &quot;Tazminat sekmesini&quot; açın. Artış veya dağıtma kanal flüoresans yoğunluğu florokrom pos için hemen hemen aynı olduğu kadar satın alınması sırasında dengeleme faktörünü azaltmakitive ve negatif nüfus. </li><li> Kompanzasyon ayarlandıktan sonra nanopartikül ile tedavi edilen örnekleri elde edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems:+Implications+to+personalized+nanomedicine.">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li><li>Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+benefits+and+hazards+of+engineered+nanoparticles.">Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+engineered+nanomaterials.">Immunological properties of engineered nanomaterials.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).</li><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation.">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462, 449-460 (2009).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia.">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li><li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays.">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li><li>Malvindi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+nanoparticles+biocompatibility+and+their+potential+for+gene+delivery+and+silencing.">SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing.</a> Nanoscale. 4, 486-495 (2012).</li><li>Bardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+NPs:+Promising+Candidates+for+Drug+and+Gene+Delivery.">SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery.</a> Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).</li><li>Bardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+amino+functionalized+CdSe/ZnS+quantum-dot-Doped+SiO2+nanoparticles+with+primary+neural+cells+and+their+gene+carrying+performance.">The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance.</a> Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li></ol>

Yazarlar Miltenyi Biotech GmbH bu yazının teslim sponsor olduğunu beyan ederim. HiQ-Nano Şirketi ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) bir nanoteknoloji İİT kaynaklanan şirket off spin olduğunu.

Deneysel protokol, dikkate alınması gereken çok önemli bir nokta sunuyor. Bu, daha yüksek sıcaklıklar ve ışıklar negatif boyama verimini etkileyebilir, çünkü, tüm boyama aşamaları boyunca (buz üzerinde), 4 ° C &#39;de ve muhtemelen karanlıkta çalışmak için çok önemlidir. Nanopartikülleri daha iyi sadece kullanımdan önce yeniden süspanse edilmesi için sonicated olabilir. Sitometri analizi düzgün bir şekilde farklı kanallar doğru bir kalibrasyon gerektirir. Cihazın kalibrasyonu, her bir deneysel oturumda önce yapılmalıdır. Enstrümantasyon ile teknik sorunların yanı sıra, aynı zamanda antikor etiketleme ile ilgili sorunlar olabilir. Bu, uygun bir konsantrasyonda antikor kullanmak zorunludur. Konsantrasyonu çok yüksek veya çok düşükse, dissatisfying sinyal yoğunlukları sonucu olabilir. Bu teknik, endişe dezavantajları tek dağılımlı örnekleri ile çalışan ihtiyaç, yetersizlik yerelleştirilmesinesinyali (örneğin farklı hücre bölmeleri) menşe site. Birlikte kullanılmak üzere fluorochromes seçiminde bazı kısıtlamalar vardır: eksitasyon ve emisyon dalga boyu bantların yeterince bunların uygun ölçüm izin vermek için ayrılmalıdır. Kullanılan antikor spektrumları çakışırsa, doğru kompanzasyon gereklidir. Akış sitometrisi varlığında veya nanopartiküllerin yokluğunda hücre analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu teknik, bir hücrenin bir çok değişkenli bir çalışma, incelenen etkinlikleri yüksek sayıda izin verir, analiz (1.000 &#39;den fazla hücre / sn), tekrarlanabilirlik ve istatistiksel bir okuma hızı. Numuneler, hücre canlılığı kaybetmeden işlenebilir. Floresan etiketli nanopartiküller kullanılarak bu hücre zarında bulunan özel markörler ile tanımlanır hücre alt, kendi içselleştirme hak ve ölçmek mümkündür. Hücre parametreleri s mevcudiyetinde değiştirebilir<html> pecific nanopartiküller. Araştırmanın amacı ile ilgili olarak, bu tür varyasyonlar orantılı olarak artan nanopartikül içselleştirme oranı ile artar hücrelerin yan saçılması gibi belirli bir fenomen tanımlamak için kullanılabilir. Hücre yüzeyinin Nanopartikül indüklenen modifikasyonları da bu tekniğin bir sınırlama temsil edebilir. Bu nedenle, hücre membran reseptörleri devir her zaman dikkate alınmalıdır ve muhtemelen tam olarak ilgi hücre popülasyonu karakterize etmek için önceden bilinir. Nanoparçacık aşırı örneklerinde membran osmoz aşırı bozuklukları hücre ölümüne yol açabilir. Nano malzeme doza bağımlı deneysel toksisite, her bir hücre popülasyonu için test edilmelidir. Açıkça tanımlanmış ölü hücreler floresan ölçümü dışında tutulmalıdır. Örneğin, Annexin V / PI boyama, genellikle nekrotik ve apoptotik hücrelerin hem de tespit etmek için kullanılan çeşitli yöntemlerden biridir. &quot;&gt; GFP ifade birincil hücreler aynı zamanda, belirli bir hücre subpopülasyonu seçmek ve prelabeling olmadan veri toplamak için güçlü bir araçtır. Tamamlayıcı floresan nanopartiküller ile kombinasyon hücre nanoparçacık etkileşimin çok hızlı ve hassas ölçümü. Uyuşturucu ya da gen teslimi düşünülüyor verir Seçilen dokulara spesifik bir ilaç yükünü serbest bırakmak mümkün nanopartiküllerin uygulanması ile gelecekte geliştirilebilir. Nanopartiküller Pharmaceutics için taşıyıcılar olarak teslim özel ve / veya bağışıklık modülatörleri, ve iş hücre nanoparçacık etkileşimleri incelemek için biyolojik ortamının bilgi (yani, akış sitometrisi yoluyla) gerektirir.

İşlenmiş nanomaddeler günümüzde biyomedikal 1 potansiyel uygulamalar için yaşam bilim adamlarının ilgisini ilham edilir. Inorganik ve organik maddelerin çok çeşitli fiziksel farklı şekil ve kimyasal özellikleri ile oluşturulan nano üretmek için kullanılabilir. Bu yapılar arasında, küre şeklinde tasarlanmıştır nanopartiküller tanı ve translasyon tıp 2 için büyük bir potansiyel göstermiştir. Onların çekirdek ve yüzey tasarım olası bir uygulama tarafından tahrik edilir ve nanoparçacık temas ve etkileşimi aşağıdaki hedef hücre yanıtlarının derin bir çalışma anlamına gelir. Kasıtlı insan deneklere uygulanabilir düşünülen Nanoparticles bağışıklık hücrelerinin çeşitli ile doğrudan temas edecektir. Vücut bütünlüğünü korumak için kendi sorumluluk onları nanotıpta 3 soruşturmanın önemli bir konu yapar. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin hücresel bölümü esas olarak phago ile temsil edilircytes. Bunlar arasında, monosit / makrofaj soyu, merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere elde edilen yerleşik mikroglia hücreleri, bağışıklık savunma 4,5 önemli bir rol oynamaktadır. Bunlar yabancı cisimlerin ile karşılaştıktan sonra birkaç saat içinde koruyucu tepkileri tetiklemek için edebiliyoruz. Ayrıca, monositik hücreler koordine ve sitokin salınımı yoluyla edinilmiş bağışıklık yanıtı talimat. Tüm bu olaylar da büyük ölçüde bağışıklık sistemi tarafından 6 &quot;kendinden olmayan&quot; olarak algılanan işlenmiş malzemelerin mevcudiyetinde meydana gelir. Tarihsel hücre analizi için immünoloji kullanılan yöntemler arasında, en güçlü araçlardan birini temsil akım sitometri. Bundan başka, (genellikle tutulmasına ya da tek bir zar proteini varlığını istismar) spesifik bir bağışıklık alt popülasyonun tanımlanmasında veya saflaştırma teknolojileri durumuna izin veren belirli bir birincil ce belirli bir nanoparçacık etkilerinin kesin bir incelemell tipi 7. Ancak, hücre nanopartiküller maruz kaldıktan sonra fizyolojik ve morfolojik değişiklikler ortaya çıkabilir. Yanı sıra, nanopartiküller elde edilen sonuçları 8 etkileyen, tanımlanan dalga boylarında bu tür ışığın emilmesi veya emisyon olarak özel optik parametreleri, engel olabilir. Bu nedenle, kullanım ve yeni malzemelerin çalışma klasik immünolojik deneylerde nihai uyarlamalar limitleri dikkate alınmalıdır. Bu çalışma, akış sitometresi ile birincil bir bağışıklık hücreleri ile etkileşimleri nanopartikül saptanmasını ilgilidir. Bu sorunu gidermek için, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikülleri yöntemini açıklamak için bir model nanomateryal olarak istihdam edildi. Silika parçacıkları nano ölçekli metrik çok hassas bir şekilde üretilebilmektedir. Bu tür ücret veya hidrofobisiteyi gibi boyut, şekil ve yüzey özellikleri, ince onların biyouyumluluk 9 artırmak için ayarlanmış olabilir. 2 nanopartiküller onları bir olarak kullanılmasına izin SiO birçok özelliğiİlaç vermek için örnek 10, parçacıklar. Ayrıca, flüoresan boyalar ya da kuantum nokta tutulabilir veya görüntüleme amaçları için yararlı 11 nano-araçlar sunan bu parçacıklara bağlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

İşlenmiş nanopartiküller tedavi ve teşhis amaçları için çok umut verici özellikleri ile donatılmış bulunmaktadır. Bu çalışma, bağışıklık hücreleri ile etkileşimi nanopartikül çalışma akış sitometresi ile analiz hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Primer bağışıklık hücreleri kolayca antikor aracılı bir manyetik izolasyon, insan veya fare dokularından saflaştırılabilir. İlk olarak, bir Akış Sitometresi çalışan farklı hücre popülasyonları iç karmaşıklığı hücre ile ilişkili hücre büyüklüğü ile orantılı olan ön-dağınık ışık (FSC) ve yan dağınık ışık (SSC), ile ayırt edilebilir. Ayrıca, spesifik hücre yüzey reseptörlerine karşı floresan işaretli antikorlar, aynı örnek içinde birkaç alt popülasyonlarının belirlenmesi izin verir. Hücreler fizyolojik ve morfolojik durumu değiştirmek dış uyaranlarla artırdığını zaman Genellikle, tüm bu özellikler değişir. Burada, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartiküller inci belirlemek için bir model olarak kullanılmaktadırİnsan kan bağışıklık hücrelerinde nano yapılı malzeme e içselleştirme. Hücre floresan ve yan dağınık ışık artışı nanopartiküller ile inkübasyondan sonra bize zaman ve nanopartikül-hücre etkileşiminin konsantrasyon bağımlılığı tanımlamak için izin verdi. Ayrıca, bu tür protokol birincil mikroglia, merkezi sinir sistemi yerleşik bağışıklık hücreleri, özellikle monosit / makrofaj Yeşil floresan proteini (GFP) ifade mutant farelerden izole edilmiş olan Rhodamine-SiO 2 nanoparçacık etkileşimi araştırmak için uzatılabilir. Hücrelere nanoparçacık içselleştirilmesi ile ilgili veriler konfokal mikroskopi ile teyit edilmiş sitometri Nihayet, akış.

Sitometrisi farklı hücreleri belirlemek ve karakterize etmek için bir araçtır ve bu tür monositler, granülositler, T hücreleri, B hücreleri, doğal katil (NK) hücreleri, dendritik hücreler (DC) gibi özel bağışıklık hücrelerini belirlemek için tercih edilen bir tekniktir Akış, ve lökositlerin diğer subpopülasyonunun. Daha iyi nanopartiküller tepki olarak beyaz kan hücreleri davranışını karakterize etmek için bir çaba olarak, (THP-1 hücreleri, Şekil 3), sağlıklı donörlerin kan (Şekil 1 ve 2) için, insan monosit hücre hattı izole primer lökositler ile içselleştirme tahlilleri gerçekleştirilmiştir . Şekil 1A de belirtildiği gibi, üç ana kan lökosit alt-popülasyonları bulunduğunu açıkça PBMC izolasyonundan sonra ön ve yan saçılma ile belirlenmiştir. Ayrıca, FITC-SiO 2 tedaviden sonra, lenfositler (gri), monositler (mavi) ve granülositler (kırmızı) farklı bir n varyeşil floresan yoğunluğu (Şekil 1 B) ile gösterilen anoparticle içselleştirme hızı. Açıklanan protokol PBMC&#39;lerden birinci CD14 pozitif monositlerin saflaştırılması. Şekil 2A FITC-SiO 2 varlığında CD14 + monosit nokta arsa sitometri akışı bildirir sağlar. Şekil 2B, aynı hücrelerde miktarı olarak ifade edilmiştir ve FITC-SiO 2 içselleştirme logaritmik ölçek histogram. Benzer deneyler içselleştirme FITC-SiO 2 nanopartiküllerin artan konsantrasyonları ile muamele edilmiş THP-1 monosit üzerinde gerçekleştirilmiştir. İşlem yapılmamış hücreler negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Şekil 3A, THP-1 hücre hattı saçılma değişmeyen ileri yan saçılması doza bağımlı bir artış göstermektedir. Şekil 3B&#39;de, birlikte test edilen her bir FITC-SiO 2 nanoparçacık konsantrasyonda SSC ve FSC histogramlar ile, ortalama floresans yoğunluğu (MFI) miktar sunulmuştur. Bu veriler, FITC-SiO 2 nanopartiküller ile tedavi, hücre içi parçalı arttırılması (yan saçılma) ve flöresanlı (yeşil kanalı) ile öne monositlerinde doza bağımlı içselleşmesini uyarır düşündürmektedir. Bağışıklık sistemi hücreleri, nano-tanecikleri arasındaki etkileşim tipine içine daha fazla bilgi edinmek için, primer karma glial kültürleri izole edildi ve mikroglia, merkezi sinir sistemi yerleşik bağışıklık hücreleri, saflaştırılmıştır. Yeşil floresan mikroglia eksprese eden transgenik bir fare modelinin kullanımı, farklı nöro-enflamatuar mekanizmalar görselleştirme izin verir. Bu çalışmada kullanılan transjenik fare B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J CX3CR1 12 promotör kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade eder. In vitro (DIV) 7 gün sonra, floresan mikroskobu astrositlerin, çok sayıda (GFP negatif yapışık hücre ile karışık bir birinci glial kültür gösterirs) ve bazı yeşil hücreleri (GFP pozitif, Şekil 5A). GFP - - (astrositler ve glial hücreleri), mikroglial CD11b + GFP + hücrelerinin bir ikinci ayrı bir grup, ve bir ilk CD11b Bu fare modelinde, üç glial altgrupları tek-CD11b antikor lekelemesi ile akış sitometrisi ile ayırt edilebilir Üçüncü CD11b + GFP - alt popülasyonu (Şekil 4A). Analizi (Şekil 4B) flow sitometri tarafından gösterildiği gibi, bu iki son subpopülasyonunun, hem (CX3CR1 destekçisinin transkripsiyonu ile devriye olgunlaşmamış mikroglianın temsil eden) GFP + nüfusun hafif bir artış verimlilik ile nanopartıküllerıni içselleştirmek edebiliyoruz. Meydana içselleştirme ayrıca Şekil 5B&#39;de gösterildiği gibi, Rhodamine-SiO 2 nanopartiküllerin aynı nihai konsantrasyon kullanılarak konfokal mikroskopi ile doğrulanabilir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Şekil 1. Üç ana kan lökosit izole kandaki lökositlerin yan saçılma karşı (FSC) saçılma. A) Temsilcisi ileri FITC-SiO 2 nanoparçacık içselleştirme (SSC) Ficoll-Paque izole kan lökosit nokta arsa akım sitometri. B) Yeşil floresan bindirme histogram grafiği 1 saat için 1 nM FITC-SiO 2 nanopartiküller (+45 mV) varlığında hücre subpopülasyonunun. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Şekil 2,. Mevcudiyetinde saflaştırılmış monosit alt populasyonun yan saçılma karşı (FSC) saçılma FITC-SiO 2 nanoparçacık CD14 içinde içselleştirme + saflaştırılmış monositler. A) Örnek ileri (SSC) saflaştırılarak CD14 pozitif monositlerin nokta arsa akış sitometrisi. B) yeşil floresan histogram plot 1nM FITC-SiO 1 saat 2 nanopartikülleri (+45 mV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Şekil 3,. THP-1 hücreleri yan scatterin karşı (FSC) saçılma. A) Temsilcisi ileriye üzerine FITC-SiO 2 nanoparçacık içselleştirme Etkilerig (SSC) ileri (FSC) ve yeşil saçılma, yan saçılma konsantrasyonu. B) Konsantrasyon bağımlı varyasyon (SSC) artan FITC-SiO 2 nanopartikülleri 1 saat kaldıktan sonra, THP-1 monosit hücre hattının nokta arsa akış sitometri FITC-SiO 1 saat 2 nanopartikülleri (+45 mV) varlığında floresan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Şekil 4. Pr nokta arsa sitometri CD11-VioBlue akış karşı rodamin-SiO B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J farelerden izole primer mikrogliada içine 2 nanoparçacık içselleştirilmesi. A) Yeşil Floresan Protein (GFP)B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J farelerinden izole imary karışık glia. CD11 + GFP + ve CD11 + GFP -. Nüfusu 30 için sırasıyla sağ üst ve sağ alt kadranda, B) 1 nM Rodamin-SiO 2 nanopartiküller (+45 mV) varlığında mikrogliya Altgrupları Kırmızı floresan bindirme histogram grafiği gösterilmiştir dk kontrolü (gri histogram) karşı (kırmızı histogram). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Şekil 5,. 7 DIV ve (B) mikroskopisi GFP +-mikrogliya görselleştirme. (A) Floresan mikroskopiRodamin-SiO 2 nanoparçacık içselleştirilmesi GFP +-mikroglialar&#39;da (kırmızı oklar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K Görüntüleme.  Istituto Italiano di Tecnologia.  Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi. 

Video: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...