Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında onu girişi için Dr Magdalena Götz minnettarız. Biz cömertçe Sox2 kodlama dizisi ile bize sağlamak için Dr Marius WERNIG (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. Biz de virüs üretimi için Dr Alexandra Lepier için çok müteşekkiriz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE) ve BMBF (01GN1009A) BB, ve Bavyera Bilimler Devlet Bakanlığı, Araştırma ve MK ve BBCs için Sanatları uluslu SYSTHER-fon alınan hibe ile desteklenmiştir INREMOS Sanal Enstitüsü (Eğitim ve Araştırma Alman ve Sloven Federal Bakanlıklar) ve DFG (SFB 824).

1.. İzolasyon ve Yetişkin İnsan Beyin Hücrelerinin ekimi Insan dokusu ile ilgili deneyler araştırma amacıyla insan malzeme kullanımı ilgili tüm devlet ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. Mevcut protokol LMU Münih Tıp Fakültesi etik kurulu ve tüm hastalardan yazılı onam tarafından onayı doğrultusunda geliştirilmiştir. Insan yetişkin beyin korteks hazırlanması kültürlerinin Bu protokol, temporal lob epilepsi ya da diğer derin non-travmatik, habis olmayan lezyonlardan muzdarip her iki cinsten hasta örneği kullanılarak kurulmuştur. Bu nedenle beyin lezyona erişim kanalı özel olarak oluşan cerrahi odadan elde edilen ve doku sağlıklı kabul edilir. Hastaların yaş aralığı 19-70 yıl idi. <ol><li> Isı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu büyütme ortamı ekleyerek hazırlamakGlutamax DMEM yüksek glikoz (FCS)% 20 FCS bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. 500 ml büyüme ortamı, toplam 5 ml penisilin / streptomisin ekleyin. Bu ve uygun bir laminer akış kaputu steril kültür koşulları gerektiren sonraki tüm adımları uygulayın. </li><li> CaCI2 ve işleme kadar buz üzerinde HEPES (10 mM nihai konsantrasyon) de dahil olmak üzere MgCl2 (HBSS) ortamı ile Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde cerrahi odadan elde edilen yetişkin insan beyin biyopsisi tutun. Kısa sürede işleme başlayın. </li><li> 65 mm petri içine doku transferi ve iki steril tek kullanımlık neşter kullanarak küçük parçalar halinde kıyma, tek hücre içine ayrışma başlatmak için. Enzimatik sindirme için, 15 ml konik bir tüp içinde 3-6 ml TrypLE kullanımı ve bir su banyosu içerisinde 37 ° C&#39;de 15-30 dakika inkübe edilir. </li><li> Ayrışmasını kolaylaştırmak için önceden ısıtılmış büyüme ortamı 1 hacim ekleyin ve hafifçe ilk kullanarak yukarı ve aşağı doku parçaları içeren çözüm çiğnemekHücre süspansiyonunun homojen olana dek, bir cam Pasteur pipet kullanılarak ve ardından, 5 ml kullanılıp atılabilir pipet. Tipik olarak, çoğunlukla beyaz madde aşağıdakilerden oluşan bir miktar doku parçaları, süspansiyon içinde kalır. </li><li> 5 dakika boyunca 157 x g Spin ve büyüme ortamı içinde uygun miktarda (kaplanmamış T75 kültür şişesi başına 10 mL) &#39;de pelletini. Büyüklüğü 5-10 mm çaplı bir biyopsi için, bir T75 kültür şişesi kullanın ve daha büyük örneklerin durumunda, bu çıkarım. </li><li> % 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C inkübatör içine hücreleri yerleştirin. </li><li> Hücreler birleşik hale gelmiş kadar her 3-4 günde bir ortamın yarısı değiştirin. Bu genellikle (pasaj 0 [P0] olarak da adlandırılır), iki haftaya kadar sürer. </li></ol> Yetişkin İnsan Beyin Hücreleri 2.. In vitro Genişleme ve Karakterizasyonu <ol><li> In vitro genişlemesi: <ol><li> Kültür ortamı aspire ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkamak, oda t tutulduemperature, 3 mi TrypLE eklemeden önce. </li><li> Hücrelerin en müstakil kadar 5-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Yavaşça hücrelerin kaldırma kolaylaştırmak için şişeler dokunun; büyüme ortamının 3 hacimleri ilave edildikten sonra, 15 ml konik bir tüp içine aktarmak ve hücreler, 5 dakika boyunca 157 x g hızında aşağı spin ve büyüme ortamının uygun miktarda hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Geçiş yeni T75 hücre kültürü şişelerine uygun verim için 1:03 oranında hücreler. Not: Biz azaltılmış yeniden programlama verimlilik herhangi bir belirti olmadan P5 kadar bu hücreler pasajlanır var. Kültür endotelyal hücrelerin önemli bir kısmını (CD34 ekspresyonu ile değerlendirilen) içeren P0 da, takip eden geçitler de bu sayı ihmal edilebilir hale gelir. </li></ol></li><li> Yetişkin insan beyin kültürleri karakterizasyonu: <ol><li> İmmünositokimya: <ol><li> Poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine hücreler, tohum ~ 60,000 hücre karakterizasyonu için, 500 ul taze büyüme mediu fişleri24 oyuklu doku kültür plakaları içinde m ve% 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kültürlenmiş insan beyin hücreleri immünositokimyasal analizi için orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit 500 ul ekleyerek, hücreler. </li><li> Cam kapak, uygun bir nemli bir boyama odası içine sığar aktarın ve 80 ul PBS ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 3 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.5 Triton X-100 içeren bloke eder. </li><li> Aynı çözelti içinde seyreltilmiş primer antikorların (seyreltme faktörler spesifik reaktifler ve ekipman tablo bakınız) ilave edilir ve oda sıcaklığında, 4 ° C ya da 1 saat sonra bir gece boyunca inkübe edilir. Not: kültür bu aşamada, hücrelerin önemli bir ama farklı fraksiyon (PDGFRβ) platelet türevli büyüme faktörü reseptörü β için immünoreaktif olan, farklılaşma 146 (CD146), kondroitin sülfat NG2 proteo kümeglukanıdır ve düz kas aktini (SMA), mikrovasküler ilişkili perisitlerden karakteristik yani belirteçleri. Yalnızca küçük bir bölümü (&lt;% 1) astroglial belirteçleri glial fibriller asidik protein (GFAP) ve S100β ifade eder. Ayrıca, bu aşamada kültür nöronal işaretleyici βIII-tubulin ifade eden bir hücre yoksun olmalıdır. Farklı markerlerinin co-etiketlenmesi için çok sayıda birincil antikor kombinasyonları kullanılır. Glial, nöronal, endotel ve perisit markerlerinin sentezlenmesi başka bir onay da, ters transkripsiyon ve (bu protokol açıklanmayan) kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile elde edilebilir. </li><li> Ile inkübe edildikten sonra, birincil antikorlar, 1 ml PBS ile üç kez yıkama ve boyama çözeltisine (uygun seyreltiler olarak) karşılık gelen ikincil antikor ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. Hücreler 3x PBS ile yıkayın. Gerekirse, monte edilmeden önce oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DAPI ile boyama dahilsıcaklığı. </li><li> Montaj orta solmaya kullanın ve Epifloresans bir mikroskop ya da bir konfokal mikroskop kullanılarak kapak fişleri analiz. </li></ol></li><li> Flow sitometri: <ol><li> Akış sitometrisi kullanılarak yüzey işaretleyici ifade analizi için, kaplanmamış T25 veya T75 hücre kültürü şişelerinde hücreleri konfluansa kadar büyür. </li><li> PBS +% 0.5 BSA içeren boyama çözeltisi içinde tekrar süspansiyon ve daha önce tarif edildiği gibi TrypLE kullanarak hücreleri çıkarın. Renk reaksiyonu başına, boyama çözeltisinin 100 ul 100,000-200,000 hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, ilgili izotop kontrol antikorları) kullanılan antikor başına tek boyama reaksiyonları hazırlayın. </li><li> Doğrudan hücre süspansiyonu içine (seyreltmeleri spesifik reaktifler ve ekipman için tabloya bakınız) her bir boyama çözeltisine florokrom-konjuge antikor ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 500 ul PBS ile hücreler üç defa yıkamak ve her arasında aşağı doğru döndürün5 dakika boyunca 157 x g yıkama aşaması. </li><li> FACS tüplere bir hücre süzgecinden (70 um) üzerinden 0.5-1 mi boyama solüsyonu ve transfer hücrelerde hücre pelletini. Işığa maruz örnek koruyun. </li><li> Önce FACS alet yerleştirerek için Vortex örnekleri. </li><li> Canlı hücrelerin analiz ve enkaz ve hücre agrega, FSC-A kapısı ve SSC-A dışlamak için. Hücre duplets özellikle FSC-A ve FSC-W tarafından Geçitli. Ilgili florokroma konjüge eş izotipli antikor kontrolü ile kapıları belirlenen hücre yüzeyi işaretçileri için doğru yolluk koşullarını belirlemek. Daha sonra antikor-bağlı hücrelerin oranını belirler. </li></ol></li></ol></li></ol> Flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile perisit türetilen Hücreler 3. Zenginleştirme <ol><li> FACS 70 mikron meme kullanılarak sıralama ile önce transdüksiyonu ile (büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş) perisit hücre popülasyonu arındırın. C ile bir arada CD34-APC kullanınD140b-PE ve CD146-FITC perisitlerden seçmek için. CD34-negatif, CD140b-ve CD146 pozitif hücreler için sıralar. </li><li> 24 oyuklu doku kültürü plakalarında kayma poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine büyüme ortamı ve plaka içindeki kriteri hücrelerini toplamak ve% 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Sıralama 48 saat sonra, taze büyüme ortamı ile orta yerine Protokol ve 4&#39;te tarif edildiği gibi transdüksiyonunu gerçekleştirmek. </li></ol> 4. Retrovirütik perisit türetilmiş Hücrelerinin İletimi ve İsteyerek Nöronlar içine yeniden programlanması Not: retroviral parçacıkları taşıma yerel biyogüvenlik kurallarına bakın. Almanya&#39;da burada istihdam retrovirüslerde kullanımı biyogüvenlik düzeyi 2 gerektirir. Retroviral parçacıkların üretim protokolüne 6&#39;ya bakın. Tekrar programlanması için kullanılan retroviral yapılar için Karow ve arkadaşlarına bakınız. (2012). Retrovirüsler, VSV-G (vesiküler stomatit virüsü-gliko psödotiplendirilmiş idiprotein) 5. Üretim için Gavrilescu ark 6 başvurun. <ol><li> Önce poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine retroviral transdüksiyon tohum ~ 60000 hücreleri 24 saat 24 oyuklu doku kültürü plakaları içinde 500 ul taze büyüme ortamı içinde kayar ve% 5 CO2 ve% 5 O2, 37 ° C&#39;de inkübe . </li><li> Ertesi gün, 500 ul taze, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı ile büyüme ortamının yerini ve retroviral parçacıklar (kontrol için pCAG-IRES-DsRed, özellikle de laboratuarda protokol kurulması esnasında), pCAG-ascl1 içeren ilgili konsantre edildi yüzer 1 ul ekle pCAG-Sox2 IRES-GFP, IRES-DsRed. </li><li> Bir gün sonra, hücreler, viral partiküller dahil olmak üzere orta kaldırmak ve taze 1 ml eklemek Glutamax ile 49 ml DMEM yüksek glükoz ve 1 ml B27 serum içermeyen ek oluşan, B27-farklılaştırma ortamı önceden ısıtılmış. 5 37 ° C &#39;de kültür içinde hücreleri korumak% CO 2 ve ins olgun olarak tekrarlayan orta değişiklikler zararlı olmak gibi orta değiştirmeden 4-8 hafta boyunca% 5 O 2. </li></ol> İmmünositokimya tarafından Kaynaklı Nöronlar 5. Karakterizasyonu <ol><li> Kalıt aktarımlı hücrelerin hücre kimliğini belirlemek için, nöronal bir fenotip elde edilmesini göstermek için, özellikle, belirli reaktiflerin tabloya bakınız, antikorlar ve bunların ilgili dilüsyonları için (örneğin, BIII-tubulin, MAP2 ve Neun gibi nöronal antijenlere karşı immünsitokimya gerçekleştirmek ve ekipmanlar; 2.2.1 belirtildiği gibi) aynı prosedürü uygulayın. </li><li> E14 fare beyin kortekslerinden elde edilen nöronlarla PdiNs, ko-kültür, bu hücrelerin olgunlaşmasını geliştirmek için. Bu amaçla, serebral korteks incelemek ve bir ateş cilalı cam Pasteur pipeti ile mekanik olarak doku ayırmak. Sox2 ve ascl1 kodlayan yeniden iletimi ile aşağıdaki perisit türetilmiş hücreler, 2-3 hafta kültürlerine 10.000-50.000 sıçangil nöronlar eklemetroviruses ve kültürü devam etmektedir. Iletilmiş hücreler canlı epifluoresan veya GFP ve DsRed için İmmunositokimyayı şu ya da muhabir (GFP ve DsRed) ifadesi ile kemirgen nöronların ayırt edilebilir. </li><li> , Kemirgen nöronlar tarafından PdiNs üzerine sinapsların oluşumunu değerlendirmek veziküler glutamat taşıyıcısı 1 (vGluT1) olarak veziküler nörotransmiter reseptörlerine karşı İmmunositokimyayı gerçekleştirmek için. </li><li> Elektriksel özelliklerine (aksiyon potansiyelleri üreten yani yeteneği) ve patch-kelepçe elektrofizyoloji tarafından fonksiyonel sinapsların kurulması için transduced hücreleri inceleyin. Prosedürün ayrıntıları için bkz Heinrich ve ark. (2011). </li></ol>

<ol>
	<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts.">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li><li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+water+deficit,+ABA,+and+provenances+in+Picea+asperata.">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells.">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level.">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li><li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts.">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li><li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts.">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons.">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts.">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li><li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+cells:+how+to+make+and+define+a+neuron.">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li><li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors.">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li><li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons.">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li><li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons.">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells.">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li><li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion.">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li><li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable,+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells.">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol in vitro genişlemesi ve zenginleştirme perisit türetilen hücrelerin yetişkin insan serebral korteksinden izole takip eden ve nörojenik transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından INS içine sonraki dönüşüm ve Sox2 Ascl1 faktörleri açıklamaktadır. Anılan protokol, sonuçta yetişkin beyninin in vivo ortam haline doğrudan dönüşüm yaklaşımı çevirmek için akılda hedefi ile, potansiyel olarak da glia nöronların içine beyin-yerleşik hücrelerinin soy-dön?...

Da farklılaşma potansiyel bir bolluk ile donatılmış bulunmaktadır uyarılmış pluripotent kök hücreleri içine somatik hücreler (iPSCs), yeniden programlamayı aksine, doğrudan yeniden programlama başka içine belirli bir hücre tipi düz dönüşüm için amaçlanmıştır. Hastalık modelleme ve potansiyel hücre bazlı terapiler bağlamında kendi uygulama ile ilgili olarak, her ikisi de yeniden programlama yaklaşımlar belirli avantajları ve dezavantajları vardır. IPSCs (i) yeniden programlama hücrelerin neredeyse sonsuz bir kaynak içerir; (Ii) genetik mühendisliği için izin verir; (Iii) a, neredeyse sınırsız farklılaşma potansiyele sahip endows. Bu hücreler, hücre bazlı terapiler için kullanılacak olan, ancak, iPSCs önemli dezavantajları farklılaşmamış hücreleri (in vivo teratoma formasyonu) tümöre neden olması ve ex vivo yetiştirme ve müteakip transplantasyon için ihtiyaç risk taşımaktadır. Buna karşılık, direkt soy yeniden programlama arzu edilen hücrelerin düşük verim tarafından kısıtlanırBaşlangıç ​​nüfusun hedef hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişkili, ancak soy programlanabilir hücre nakli 1,2 üzerinde herhangi bir tümör oluşturucu bir risk sergilemek için görünür avantajına sahiptir ki; ayrıca, doğrudan yeniden programlama da örneğin, bu hücrelerin bu şekilde nakli ihtiyacını ortadan kaldırmak, gerekli olacaktır organ içinde, in situ sağlanabilir. Bu düşünceyle, bizim laboratuvar nörodejeneratif hastalıkların hücre bazlı terapiler yönelik yeni bir yaklaşım olarak ins içine soy-yeniden programlanması beyin yerleşik hücrelerinin olasılığını izlemiştir. Potansiyel olarak soy tekrar programlanması için, hücresel hedefler olarak kabul edilebilir Brain yerleşik hücreler farklı macroglia türleri (astrositler, NG2 hücreleri ve oligodendrosit), mikroglia ve mikrovasküler ilişkili hücrelerin (endotelyal hücreler ve perisitler) içerir. Biz kapsamlı serebral kor astroglial in vitro yeniden programlama potansiyel inceledikErken doğum sonrası farelerin 3-5, tex. Yetişkin insan beyninde doğrudan soy-yeniden programlama için benzer uygun hücre kaynakları arayışı içinde, başarıyla INS ve perisitlerin sergi işaretlerinden içine programlanabilir bir hücre popülasyonu karşılaştı. Burada genişletmek ve in vitro olarak bu hücreleri zenginleştirmek ve son olarak da başarılı bir şekilde içine (% 25-30 aralığında), bu in vitro genişletilmiş hücreleri önemli bir kısmını yeniden programlamak için, yetişkin insan beyni biyopsilerinden bu hücrelerin hasat için nasıl bir protokol açıklar INS. Tekrar-iki transkripsiyon faktörleri, Sox2 ve ascl1 eşzamanlı retrovirüs aracılı ko-ifade ile elde edilebilir. Bu PdiNs tekrarlayan aksiyon potansiyeli ateşleme yeteneğini kazanmak ve sinir ağları içine entegre kabiliyetlerini gösteren diğer nöronlar gibi sinaptik hedeflere hizmet bulundu. Bizim protokol ins içine yetişkin insan beyni perisitler izolasyon ve soy dönüşüm için basit bir prosedürü sağlar. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD140b-PE</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">558821</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD146-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MCA2141FT</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD13-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MVA1270A488T</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD34-APC</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">560940</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:80px;">3169S</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-CD146</td>
			<td style="width:80px;">Abcam</td>
			<td style="width:80px;">Ab75769</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NG2</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5320</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-SMA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2547</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T8660</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">M4403</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GFAP</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">G3893</td>
			<td style="width:80px;">use 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-GFP</td>
			<td style="width:80px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:80px;">GFP 10-20</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-RFP</td>
			<td style="width:80px;">Chromotek</td>
			<td style="width:80px;">5F8</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-S100&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">S2532</td>
			<td style="width:80px;">use 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NeuN</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">MAB377</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GABA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2052</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-Calretinin</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5054</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-vGluT1</td>
			<td style="width:80px;">SYnaptic SYstems</td>
			<td style="width:80px;">135511</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">11-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control PE</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">12-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control APC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">17-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">12605-010</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61965</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">B27 serum-free supplement</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">17504044</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">10106-169</td>
			<td style="width:80px;">perform heat inactivation by incubation at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">15140122</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">24020-091</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="198">
			<td height="198" style="height:198px;width:80px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1&#215;; Invitrogen, cat. no. 14190)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">14190</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">H3375</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P0899</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P1648</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A9418</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T9284</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">042M4005</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Aqua-Poly/Mount</td>
			<td style="width:80px;">Polysciences</td>
			<td style="width:80px;">18606-20</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Polypropylene round-bottom tubes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352063</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352235</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">24-well plates</td>
			<td style="width:80px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:80px;">5530305</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">658175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">25 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">690175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Disposable pipettes 10 ml</td>
			<td style="width:80px;">Sarstedt</td>
			<td align="center" style="width:80px;">#########</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass Pasteur pipettes (150 mm)</td>
			<td style="width:80px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:80px;">FB50251</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass coverslips 12 mm diameter</td>
			<td style="width:80px;">Menzel</td>
			<td style="width:80px;">CB00120RA1</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Surgical disposable scalpels&#160;</td>
			<td style="width:80px;">B. Braun</td>
			<td style="width:80px;">5518083</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">633180</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Conical tubes 15ml</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352095</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:80px;">Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes</td>
			<td style="width:80px;">Hettich Lab Technology</td>
			<td style="width:80px;">1406</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Humified cell culture incubator</td>
			<td style="width:80px;">Eppendorf Galaxy 170R</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Wather bath at 37 &#176;C</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">FACSFlow sheath fluid&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">342003</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Epifluorescence microscope BX61</td>
			<td style="width:80px;">Olympus</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Confocal microscope LSM710</td>
			<td style="width:80px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage-reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neurons

Uyarılan nöronların (INS) içine non-nöronal hücrelerin doğrudan soy-yeniden programlama nörogenezi altında yatan moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak ve in vitro modelleme veya hastalıklı beyin tamiri için yeni stratejiler etkinleştirebilirsiniz. Ins içine doğrudan dönüşüm için müsait belirlenmesi beyin-yerleşik olmayan nöronal hücre tipleri hasarlı beyin dokusu içinde, yani yerinde böyle bir yaklaşımı başlatılması için izin verebilir. İşte bu öncül yerine yetişkin insan beyninden türetilen hücrelerin teşhis etmek için bir girişimde gelişmiş bir protokol açıklar. Bu protokol şunları içerir:, yetişkin insan beyin biyopsileri elde serebral korteks, insan hücreleri (1) kültürlenmesini; (2) in vitro (yaklaşık 2-4 hafta gerektiren) genleşme ve immunositokimya ile kültür karakterizasyonu ve akış sitometrisi; (3) anti-PDGF reseptörü β-ve anti-CD146 antikorları kullanılarak (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile zenginleştirme;(4), nörojenik transkripsiyonuna retrovirüs aracılı iletim ve Sox2 ascl1 faktörleri; (5) ve son olarak, bağışıklık kimyası edilen perisit türetilmiş kaynaklı nöron (PdiNs) &#39;nin karakterizasyonu (8 hafta için 14 gün retroviral iletimini sonra). Bu aşamada, ins yama kelepçe kayıt kendi elektriksel özellikleri için tanınacak. Bu protokol, fonksiyonel insan ins içine beyin yerleşik perisitler in vitro soy dönüşüm için son derece tekrarlanabilir prosedürü sağlar.

Bu protokol sonra başarılı bir şekilde insan yetişkin beyin korteksi bir örnekten bir kültür oluşturulması ilk sonuç kültürün hücre bileşimin tanımlanması oluşur. Hücre tipi özel proteinler için İmmünositokimya farklı hastalar (Şekil 1A) numune türetilen kültürleri arasında heterojenite önemli derecede ortaya koymaktadır. Akış sitometrisi ile belirlenir olarak (ortalama olarak ~% 75, 30 ile en fazla% 99 kadar) PDGFRβ eksprese eden hücrelerin önemli bir kısmı her za...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons at JoVE.com

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Görüntüleme.  Ludwig Maximilians University Munich.  Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar. 

Video: Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Yetişkin doğmuş Nöronlar Entegrasyon incelenmesi

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Nörobilim

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...