Biz mükemmel teknik destek için yararlı öneriler ve Martina Gebhardt yanı sıra Heike Arthen için Kök Hücre ve Würzburg Üniversitesi Rejeneratif Tıp Grubu&#39;nun tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), Milli Eğitim Bakanlığı ve Alman Araştırma BMBF (0813 01 GN), Bavyera Araştırma Ağı uyarılmış pluripotent kök hücrelerin &quot;forIPS&quot; ve &quot;Stiftung Sibylle Assmus hibe ile desteklenmiştir &quot;. Şekil 1, www.servier.com temin edilebilen Servier tıp tekniğinde, kullanılarak üretilir.

Bu çalışmada kullanılan insan fibroblastlar Würzburg, Almanya Üniversitesi etik kurulu tarafından onay ve etik açıklığı haberdar olduktan sonra bir cilt punch biyopsi elde edildi (etik raporu no: 96/11 2011/10/06 tarihli). 1. Punch Biyopsi <ol><li> Hastanın cilt dezenfekte edin. Intrakütan 0.5 ml 1 mepivakain hidroklorür biyopsi (tercihen daha az güneşe maruz kalan bölge) alınacak olan cilt kısmını uyutmak ve steril 3mm biyopsi yumruk kullanarak deri biyopsisi hazırlamak, DPBS biyopsi + 1 ul / 1 ml gentamisin durulayın ve kaldırmak şişman. DPBS + Gentamisin, Dispase II aspirat DPBS tamamen ve kapak biyopsisi (2.4 U / ml) ile iki kez biyopsi durulayın ve 16 inkübe - 4 ° C&#39;de 18 saat. </li><li> Aspire Dispase tamamen DPBS ile iki kez yıkayın ve cımbızla epidermis çıkarın. 15ml tüp içinde, transfer 2 mi kollajenaz tip 2 (500 U / ml CDU) ekleyin, DPBS ile iki kez biyopsi yıkayın Collagena eklese kadar 5 ml toplam hacim. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde 45 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Santrifüj 5 180 xg&#39;de dakika ve sonrasında süpernatant atın. 180 x g hızında 5 dakika süreyle yeniden 10 mi DMEM-FCS-Gentamisin-ortam (% 10 FCS, 1 ul / ml Gentamisin) ve santrifüj içinde süspanse pelet. 1.5 ml DMEM-FCS-Gentamisin-medya süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın. Yapışkan doku kültürü şişesi T25 ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe aktarın. </li><li> 3 günde ortamı değiştirmek. </li><li> Yaklaşık olarak 2 hafta, hücreler deri parçaları, tripsin / EDTA (% 0.05) ile bölünmüş hücrelerinin etrafında konfluent olduğunda: Yıkama hücreleri bir kez DPBS ile, 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe,% 5 CO2 2 ml tripsin / EDTA ilave edildikten sonra (% 0.05), DMEM-FCS-Gentamisin-ortam 2 ml ilave 5 dakika boyunca 180 x g&#39;de 15 ml tüp ve santrifüj aktarmak; DMEM-FCS-Gentamisin-medya uygun miktarda supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın. </li><li> Ortam ayrıca her 3 r değiştirerek hücreleri genişletmekhücreler konfluent olduğunda, yukarıda tarif edildiği gibi d günü ve bölme; Gentamisin eklenmesi geçit 2&#39;den sonra durdurulabilir. </li><li> Doğrudan dönüşüm deneyler için hücreleri kullanmadan önce, standart tahlillerle mikoplazma kontaminasyonu dışlamak için emin olun. </li><li> Hücreler genişletilmiş zaman, doğrudan dönüşüm başlatmak ya da% 10 DMSO ve% 90 FCS kullanarak hücreleri aşağı donabilir. Hücreler, 2 gün boyunca -80 ° C&#39;de saklanır ve daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen transfer edilmelidir. </li><li> Dönüşüm hazırlanması için, DPBS, aspirat DPBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve 2.5 ml tripsin / EDTA (% 0.05) ilave edin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de 5 dakika için tutun. Dokunun Şişe hafifçe fibroblast ortamı, 2.5 ml (DMEM dahil. L-Glu +% 10 FCS +% 1 NEAA +% 1 sodyum piruvat) içinde tekrar süspansiyon hücreleri ayırmak ve 15 ml tüp aktarmak için kullanılır. 5 dakika boyunca 180 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant aspire. 1 ml aşağı fibroblast medya ve pipet yukarı ve yeniden süspanse hücreleri tek bir hücre süspansiyonu elde etmek. &lt;/ Li&gt; <li> Bir Fuchs-Rosenthal- ya Neubauer hücresi sayma odacığı ve plaka, bir 24 yuvalı plaka içinde çukur başına 3 x 10 4 hücreleri kullanılarak hücre sayısı. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de O / N inkübe edin. </li></ol> Sendai virüs ve transdiferansiyonun İnsan Fibroblastları 2. Enfeksiyon NOT: virüs taşıma Aşağıdaki adımlar, biyolojik güvenlik kabini ve bir laminer akış kaputu, ve mukozal maruziyetini önlemek için uygun kişisel koruyucu donanımları, özellikle cerrahi maske ile yapılması gereken, güvenliğini sağlamak için. <ol><li> 100 ul fibroblast medya (Adım 1.9) hücreleri geçin. Oct4-, Klf4-, Sox2- hacimde ve c-myc-Sendai virüsü çözülme ve 1 ml fibroblast ortam her virüs tekrar süspansiyon. Hücrelere 3 bir MOI (virüs titresi, partiden partiye değişiklik gösterir, ancak her virüsün bir alikosu genellikle 24 kuyu-plakasının 10 kuyu enfeksiyonu için kullanılabilir) her virüs ekleyin ve yavaşça karıştırın. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de O / N inkübe </sub&gt;. </li><li> Ve 24 saat sonra aspire orta ve neuroinduction ortamı (: 1 DMEM / F-12 Neurobasal, 1 x N2, 1 x B27,% 1 GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542 1) 500 ul Bundan sonra 39 ° C&#39;de,% 5 CO2 de kültür. Her gün medya değiştirin. </li><li> DPBS içinde 1 ug / ml&#39;ye seyreltin laminin 6 iyi plakalar üzerine çözeltinin 1 ml ilave edilir ve 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de tutun: 6. günde, enfeksiyondan sonra laminin kaplı 6 oyuklu plakaları hazırlar. </li><li> Ortamı aspire ve DPBS ile bir kez yıkama hücreleri, ardından DPBS / EDTA, 500 ul ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 &#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir: 7. günde enfeksiyondan sonra DPBS / EDTA kullanılarak hücreler ayrıldı. </li><li> DMEM / F12 500 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 180 x g&#39;de 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj plaka süspansiyon çıkarın. </li><li> Süpernatant aspire ve neuroinduction ortam, laminin kaplı 6 iyi plakalar üzerinde plakanın 1,5 ml pelet tekrar süspansiyon ve nihai conce ROCK önleyicisi Y27632 ekleme39 ° C&#39;de hücreler, kültür 10 uM ntration,% 5 CO2. </li><li> Her gün medya değiştirin. </li><li> Enfeksiyon kültürden sonra 14 gün kadar 37 ° C &#39;de hücreler,% 5 CO2. Nöroepitelyal koloniler faz kontrast mikroskobu ile enfeksiyon gün sonra 17 civarında belirgin hale gelir. Bunlar enfeksiyondan 20 gün sonra yaklaşık çekilmesi için yeterince büyük olmalıdır. </li></ol> Putatif iNPC Kolonileri 3. İzolasyonu <ol><li> Çekme bir gün önce, kaplama, bir 48 laminin ile iyi bir şekilde plakası:, DPBS içinde 1 ug / ml&#39;ye seyreltin laminin plakalar üzerine çözelti, 300 ul 24 saat süre ile 4 ° C&#39;de tutun. Bir gün sonra aspire laminin plakaları ve kuyulara neuroinduction medya 200 ul ekleyin. </li><li> 6 kuyu-plakasının oyuk başına 6 kuyucuklu plaklar kolonileri ihtiva eden DPBS ile bir kez aldı ve ekleme için 2 mi DPBS yıkayın. Mekanik koloniler seçin: hücrelerini çevreleyen kurtulmak için ince bir iğne kullanılarak kolonilerin etrafında kazıyın; 200 set1 l 50 ul üzerinde pipetman ve ilgili pipet uçları kullanarak koloniler seçin. </li><li> Bir laminin kaplı 48 çukurlu plaka içinde bir kuyuya bir koloni, her aktarın ve aşağı doğru 10 kere ve yukarı pipetlenerek mekanik tek bir hücre süspansiyonu üretmek. Hücrelere 10 uM bir nihai konsantrasyona ROCK önleyicisi Y27632 ekleyin. </li><li> 2 gün boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde 48 oyuklu plaka üzerindeki hücreler büyür. % 90 confluency (yaklaşık 3 - -. 4 gün) hücreleri 80 ulaşana kadar her ikinci gün medya değiştirin. </li></ol> 4. Genişleme ve iNPCs Cryo-koruma <ol><li> Pasajlanması ve iNPCs genişletilmesi <ol><li> Orta aspire ve DPBS ile hücrelerin yıkayın. DPBS aspire ve 200 ul DPBS / EDTA ekleyin ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 &#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir, ekleme DMEM / F12 200 ul, 5 dakika boyunca 180 x g&#39;de, 15 ml&#39;lik bir tüp içinde plaka santrifüj süspansiyon kaldırma . </li><li> Süpernatant aspire ve neuroi 0.5 ml pelletininduction ortamı (Adım 2.2), laminin ile kaplanmış 12 oyuklu plakalarda levha ve hücrelere 10 uM bir nihai konsantrasyona ROCK önleyicisi Y27632 ekleyin, 37 ° C &#39;de kültür,% 5 CO2. Hücreler 80 ulaşır sonra -% 90 confluency onlar da daha genişletilmiş olabilir ya da aşağıdaki gibi donmuş. </li></ol></li><li> INPCs dondurulması <ol><li> Orta aspire ve DPBS ile hücrelerin yıkayın. Aspire DPBS ve 300 ul DPBS / EDTA ekleyin ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 &#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir, DMEM / F12 300 ul ilave et ve 5 dakika boyunca 180 x g&#39;de, 15 ml&#39;lik bir tüp içinde plaka santrifüj süspansiyon çıkarın. </li><li> Süpernatantı aspire ve ticari MGK dondurma orta 0.5 ml pelletini. Dondurma şişeleri Transfer süspansiyon ve hücre dondurma kabının koymak. 2 gün süre ile -80 ° C&#39;de saklayın, daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen aktarın. </li></ol></li></ol> INPCs 5. Farklılaşma <ol><li> Nöron doğru Farklılaşmaal soyu <ol><li> Laminin kaplanmış plakalar üzerinde kültür hücreleri, yukarıda tarif edildiği gibi. Hücreler, yaklaşık% 70 olan nöro-diff-ortam (DMEM / F-12, 1 x N2, 1 x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 uM C vitamini, 10 ng / ml, BDNF, 10 ng / ml, GDNF) bir ortam confluent. Üç hafta boyunca her gün medya değiştirin. Farklılaşma sırasında değil bölünmüş hücreler yapın. </li><li> Üç hafta sonra hücreler nöronal belirteç Tuj1 ifade etmelidir. Daha olgun nöronlar kazanmak ve nöronal alt tiplerinin 3 ay farklılaşma kadar devam etmek. </li></ol></li><li> Glial soy doğru Farklılaşma <ol><li> Glial indüksiyon ortamı (1 bir ortam: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1 x N2, 1 x B27, 10 uM β-mersaptoetanol, 100 uM temel olmayan amino asitler, 1.5 mM L-Glutamin, 5 ug / ml insülin, 40 ng / ml T3) 20 ng / ml EGF glial öncü hücrelerine farklılaşmaya yol da dahil olmak üzere. Medyanın yarısı çıkarın ve yaklaşık 2 hafta süreyle her gün taze medya tarafından değiştirin. Bu süre içinde hücreler bölünmüş olmalıdır1:% 100 konfluansa 10 uM ROCK önleyicisi Y27632 mevcudiyetinde 3 ulaşıldığında. </li><li> Hücreler, ticari mevcut astrosit medyaya neredeyse konfluent değişiklik medya olduğunda, her ikinci gün ortamı değiştirmek: 2 hafta sonra daha astrositlerde içine hücreleri ayırt. 7 gün geçtikten sonra hücreler, astrosit belirteçleri (örneğin, GFAP) ifade etmek için başlar. 10 uM ROCK inhibitörü Y27632 varlığında 2 oranında: Hücreler farklılaşma protokol sırasında% 100 konfluent alırsanız, 1 onları bölmek. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada yalıtım ve genleşebilen transgen içermeyen nöral projenitör hücreleri içine insan fibroblastlarının doğrudan dönüşümü ve hücre değiştirme tedavisi ya da ilaç tarama analizleri uygulama için varsayılan bir temel olarak farklılaşmış döl göstermektedir. NPC içine somatik hücre soyu doğrudan dönüşüm seri spesifik transkripsiyon zorla ifade 26,33,34 faktörleri ile elde edilmiştir. Bununla birlikte, bir çok durumda fetal fibroblastlar transdiferansiasyon deneyler 33...

2006 yılında Yamanaka ve arkadaşları ilk kez bir pluripotent devleti 1 içine somatik hücre yeniden programlanması olasılığını gösterebilir. Bu farksızlaşma Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc murin fibroblast dört transkripsiyon aşırı ifadesi ile faktörleri elde edilmiştir. oluşturulan adlandırılan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), embriyonik kök hücrelerin (ESCs) fonksiyonel eşdeğerliği gösterir ve bu nedenle, yetişkin organizmanın bütün hücre tiplerine ayırt edilebilir. Daha sonra iPSCs için yeniden programlama bir yıl insan fibroblastlar 2 için elde edilebilir. Hayvan modellerinde deneyler iPSC türetilmiş hücreler, genel olarak, Parkinson hastalığı (PD), örneğin, hücre değiştirme terapisi, 3-5 için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, iPSCs kullanımı ile ortaya çıkan çeşitli sınırlamalar terapötik potansiyelinin tam olarak gerçekleştirilmesi için engelleri temsil etmektedir. Pluripotent durumuna ve daha sonra, hücrelerin yeniden programlanmasının Her şeyden önce,kalite kontrol, genel olarak, bir zaman alan ve geniş ve bu yüzden pahalı bir hücre kültürü prosedürlerinde elde verimsiz bir işlemdir. İkincisi, iPSCs önemli tümörojenik potansiyeli barındırmaktadır biyomedikal uygulama öncesi ilgi istenilen hücre tipi ve farklılaşmış nüfusa artık pluripotent hücrelerin olasılığı re-ayırt edilmesi gerekir ve böylece hücre nakli 6 sonra yüksek riski gösterir. Üçüncü olarak, yeniden programlama işlemi, genellikle lenti- ya da retroviral enfeksiyonu ile yeniden programlama faktörleri uyarılması ile elde edilir. konukçu genomuna bu virüslerin entegrasyonu girmeyle mutagenez ve / veya transgenlerin 7,8 kontrolsüz bir şekilde yeniden aktive edilmesine yol açabilir. Bütünleştirici olmayan sistemler sokma mutajenez ve transgen reaktivasyonu riskini en aza indirmek olduğu, hedef hücrelere yeniden programlama faktörleri sağlamak için geliştirilmiştir. Bu transgen içermeyen yaklaşımlar için, non-entegre kullanarak hücrelerin yeniden programlama olanAdeno veya Sendai virüsü 9,10, DNA-temelli vektörler 11 ya da yeniden birleştirici proteinlerin 13,14 sentetik mRNA 12 ya da transdüksiyon transfeksiyonu gibi bir DNA içermeyen yöntemlerin uygulanması. Transgen ücretsiz IPSC derivasyon için bir başka umut verici bir yöntem loxP modifiye lentiviral yeniden programlama yapıları ve Cre-loxP DNA rekombinasyon sistemini kullanan 15,16 transgenlerin sonraki silinmesi kullanılmasıdır. Hücre replasman tedavisi post-mitotik nöronlar 17-20 içine fibroblastların doğrudan dönüşüm temsil için daha basit bir yaklaşım nöral hücreleri üretmek için. Vierbuchen ve ark., Transkripsiyon aşırı murin fibroblast 17 ​​den% 20 nöronların nesil Ascl1, Brn2 ve Myt1l sonuçları faktörler olduğunu bildirmiştir. 2011 yılında NeuroD1 aşırı ekspresyonu ile kombinasyon halinde aynı üç transkripsiyon faktörleri neu, insan fibroblast transdiferansiyonun etkinleştirmek, gördünöronlar 19. İnsan kaynaklı nöron ayrıca çift SMAD- ve GSK3β- inhibisyonu altında 20 Ascl1 ve Ngn2 aşırı ifadesi ile oluşturulabilir. Özellikle, nöronlar fibroblastların doğrudan dönüşüm daha da genişlemesi ve biobanking izin vermeyen bir non-proliferatif, post-mitotik hücre popülasyonunu oluşturur. Son zamanlarda, bir çoğalan sinir kök / progenitör hücre popülasyonunun içine fibroblastların doğrudan dönüşüm 21-26 bildirildi. Açıklık uğruna, bütün bu hücre tipleri bu raporda uyarılmış nöral progenitör hücrelerin (iNPCs) olarak adlandırılır. Han ve ark. INPCs oluşturmak için Brn4, Sox2, c-myc ve Klf4 aşırı eksprese. Birincil doku veya pluripotent ya hücrelerden türetilmiş kendi nöral kök hücre meslektaşları gibi bu iNPCs tripotential ve nöronlar, astrositler ve oligodendrosit 21 içine ayırt edilebilir. Grubumuz Sox2, Klf4 aşırı ekspresyonu içeren biraz daha farklı bir dönüşüm protokolü bildirdiC-myc, ve sadece 5 gün süre ile indüklenen Oct4-ekspresyonu ve. Bu yaklaşımla biz yeniden programlama 22 faktörleri tam susturulması sergileyen fare embriyonik ve yetişkin fibroblastlardan stabil çoğalan iNPCs yaratabilir. IPSCs aksine, iNPCs nakli sonra 27 tümörijenik potansiyeli göstermezler. Biz iNPCs klinik 22 faydalı olduğunu gösteren, bir hayvan demiyelinizasyon modelinde miyelin eksikliği sıçanlarda başarıyla hücreleri dönüştürüldü kullandık. O zamana kadar, NPC yalnızca pluripotent kök hücreler veya birincil sinir dokusu 28-32 elde edilebilir. iNPCs dondurularak ve nöronlar, astrositler ve oligodendrositlere ayırt edebiliyoruz olabilir stabil genişletilebilir hücrelerdir. Çok çaba insan hücreleri 23,26,33,34 fare arasında doğrudan dönüşüm protokolü adapte yapılmıştır. 2012 yılında fibroblastlarda tek faktör Sox2 fazla sentezlenmesi sıçangil ve insan iNPCs oluşturmak için yeterli olduğu yayınlanmıştır <s&gt; 33 kadar. Yazarlar, fetal sünnet derisi fibroblast insan iNPCs üretilmesini bildirdi ve Sox2 ve Nestin karşı boyanarak bunları karakterize edilir. Bununla birlikte, yeniden programlama için kullanılan hedef hücreler, klinik uygulamada kullanılabilir ve uygulanan bir hayvan modelinde nakli ile dönüştürülmüş hücrelerin hiç bir işlevsel vasıflandırılması orada olmayacak bir çok özel, hücre tipini temsil etmektedir. Daha yeni bir yayın Sox2, c-myc ve Brn2 ya Brn4 34 ya da aşırı ifadesi ile insan fetusu fibroblastlannda nöronal sınırlı progenitörlerin üretimini tarif eder. oluşturulan hücre çizgileri kendini yenileme kapasite göstermiştir ve terminal nöronların çeşitli içine ayırt edilebilir. Bu hücreler, heterojen kökenlidir ve bir bakiye, örneğin, preparasyonlarda nöral tepe kök hücrelerin varlığını dışlamaz olabilir Ancak fetal fibroblast kullanımı sakıncalıdır. 2014 yılında, Zhu ve ark., Insan yetişkin ve neo doğrudan dönüşüm bildirdiTek başına ya da Oct4 Oct4 birlikte Sox2 aşırı ifadesi ve hücre kültür ortamına küçük moleküllerin ilave edilmesi ile tripotential nöral projenitör hücrelerine doğum fibroblastlar. Özellikle, kendi çalışmaları Sox2 dayalı tek başına doğrudan dönüşüm 26 uyarmak için yeterli oldu. Daha yakın zamanda, Lu ve ark. Yamanaka fazla sentezlenmesi genleşebilen tripotential sinir üretiminde yüksek sıcaklık sonuçları virüs 24 saat ve daha sonra inaktivasyonu için Sendai virüsü ile Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-myc faktörleri rapor ön-madde hücreleri, 23. Insan hücreleri için yayınlanmış dönüşüm protokolleri şu ana kadar zamanında sınırlı bir şekilde, genellikle Yamanaka faktörlerin en az bir ya da daha fazla, ortak bir aşırı ekspresyonu sahip olsa da, sonuç olarak, doğrudan tahrik için gerekli olan en az bir moleküler faktörlerin açık bir belirti yoktur iNPCs içine dönüşüm. ya da genetik yollarla Oct4 zamanında sınırlı aşırı sentetik mRNA ile transfeksiyon, ya da Cı-Birlikte Sox2, Klf-4 ve C-Myc yapısal ifadesi ile Ell-nüfuz edici proteini henüz stabil insan iNPC hatlarında sonuçlanmamıştır. Böylece, Sendai virüsü uygulamanın tüm Yamanaka faktörleri aşın ve zamanında 22,31 bugüne kadar tercih edilen strateji temsil birlikte optimize nöral medya indüksiyon koşulları virüsün 23 ısı inaktivasyonu ile faaliyetlerini kısıtlamak. Çeşitli çalışmalar NSC&#39;lerde veya farklı hayvan hastalık modellerinde kendi farklılaşmış meslektaşları hücresel işlevlerini göstermektedir. Insan pluripotent kök hücrelerinden Sinir atalarıdır birden 35,36 skleroz nöroenflamatuar bozukluğu fare modellerinde nakledilen oylandı. EAE&#39;de HESC türetilmiş nöral projenitör hücrelerin uygulanabilirliği (deneysel otoimmün ensefalomiyelit) -mice ilk olarak 2008 yılında gördü 35. Multipotent nöral ön-madde hücreleri, fare beyin ventriküller içine enjekte edildi ve transplantasyon sonuçlarıEAE klinik belirtilerinin azalmasında ed. Kim ve ark. HESC oligodendroglial öncüleri oluşturulur ve EAE-farelere intraserebrovantriküler olan nakledilen. Nakli fazla 10 gün boyunca hayatta olmasa da, fareler, nörolojik fonksiyonu ve beyaz cevher 36 proinflamatuar bağışıklık hücrelerinin azalması önemli gelişme gösterdi. Kök hücre tedavisi, aynı zamanda NPC başarılı bir şekilde, ilgili hayvan modellerinde kullanılabilir olabilir gibi klinik öncesi Parkinson Hastalığının hedeflenmesi için uygulanmıştır. Bunun için, projenitör hücreler ya pluripotent kök hücreler 38-40 veya 41 kullanılmıştır mezenkimal kök hücrelerden ayırt fetal beyin dokusu 37 elde edilmiştir. 2012 yılında fare iNPCs miyelin eksikliği (md) sıçan 22 beyinlerine naklinden sonra proteolipid protein, büyük bir protein miyelin bileşenini üretmek mümkün olduğunu gösterdi. Bu proof-of-prensibi deney tedavi applicabil tarafındaniNPCs of Sığ öncelikle kanıtlanmış ve yakında başka bir çalışmada 32 ile teyit edilmiştir. Bununla birlikte, insan iNPCs terapötik kullanımı tam potansiyeli bir araştırma konusudur. Burada cilt biyopsisi yoluyla erişkin hastalarda insan primer hücreleri (i) türetme bir sağlam ve entegre sürecini göstermek, (ii) nöral progenitör devlet ve iNPCs (iii) yeteneği, insan fibroblast doğrudan dönüşüm nöronal içine ayırt edilmesi ve glial soy. Bu protokolün kullanımı terapötik uygulamalar için otolog insan hücrelerinin üretimini hızlandırmak için yardımcı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astrocyte media</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td align="right">1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td align="right">48301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon medchem</td>
			<td align="right">1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type2</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>PAN&#160;</td>
			<td>P10-032100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Roth</td>
			<td align="right">4720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td align="right">50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP-antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLIF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>GEM-700-112-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67-antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSC freezing media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4-antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>inh-sb43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>&#160;LifeTechnologies</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumpyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox1-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-205725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 146986-50-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells

Somatik hücre içine yetişkin deri fibroblastlardan uyarılmış pluripotent kök hücre (iPSCs) ve sonraki farklılaşma Nesil histokompatibilite engelleri aşmak otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devleti ve istenen soy içine sonradan tam farklılaşma yoluyla ilerleme nedeniyle ilgili neoplastik potansiyeli ve genomik istikrarsızlık iPSC teknolojisinin klinik çeviri için bir barikat olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda, ve diğerleri, somatik hücreler, sadece bu şekilde, pluripotent durumda ilerlemeyi engellemeyi, tanımlanmış faktörleri kullanılarak iPSCs halinde değil, aynı zamanda multipotent somatik kök hücrelerin farklı tiplerine dönüştürülemez gösterdi. Özel olarak, indüklenen nöral projenitör hücreler (iNPCs), insan fibroblast doğrudan dönüştürme, hücre değiştirme, hastalık modelleme gibi çeşitli uygulamalar için yeni bir otolog hücre kaynağı olasılığını habercisidirve ilaç tarama. Burada, zamanında yoktur Oct4, Sox2, Klf4 ifadesi, hem de c-myc göre iNPCs içine deri biyopsisi ve etkin doğrudan dönüştürme ile, yetişkin insan primer fibroblastlar izolasyonunu tarif eder. Sox2 pozitif nöroepitelyal koloniler indüksiyon 17 gün sonra ortaya çıkar ve iNPC hatları monoklonal izolasyon ve genişlemesi ile etkin bir şekilde tespit edilebilir. Indüksiyon aşamasında enfeksiyon ve lösemi inhibitör faktör takviyesi viral çokluğu hassas ayar kadar% 0.2 dönüşüm verimi elde etmek için kritik faktörleri temsil etmektedir. Şimdiye kadar, hastaya özgü iNPC hatları fazla 12 geçişleri için genişletilmiş ve eşit örneğin Nestin ve Sox2 ifadesi olarak nöral kök / progenitör hücrelerin morfolojik ve moleküler özellikleri göstermek mümkündür. sırasıyla Tuj1 ve GFAP karşı boyama tarafından değerlendirilecek iNPC hatları nöronlar ve astrositler içine ayırt edilebilir. Sonuç olarak, türev ve korkunç için sağlam bir protokol raporBöyle otolog sinir hücre değişimi ve hastalık modelleme gibi biyomedikal uygulamalarda bir hücresel kaynak sağlayabilir stabil genişletilebilir nöral progenitör hücrelerin içine insan fibroblastlar ct dönüşüm.

Burada en az 8 haftalık (Şekil 1) içinde deriden punch biyopsi ile elde edilmiş olan insan fibroblastlarında indüklenen nöral projenitör hücreleri (iNPCs) üretilmesini sağlayan entegre işlemin tanımını. Hasta specifc iNPCs daha nöronal ve glial soy içine farklılaşmış hücre replasman tedavisi ve hastalık modelleme için büyük bir potansiyel liman olabilir. Oct4-, Klf4-, Sox2- ve c-Myc Sendai ile fibroblast Enfeksiyon fibroblast ve 17 gün sonra enfeks...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells at JoVE.com

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

derivation-adult-human-fibroblasts-their-direct-conversion-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Görüntüleme.  University of Würzburg.  Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar. 

Video: Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Nörobilim

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...