Astrositler, doğrudan nöronal programlama için hedeflenen ilginç bir otojen popülasyondur. Bu protokol, kültür astrositlerini farklı bölgelerden veya merkezi sinir sisteminden yüksek saflıkta izole etmek için güvenilir bir teknik sağlar. Bu protokol, astrositlerin farklı başlangıç popülasyonlarının astrositlerin saflığındaki farklılıklar gibi kafa karıştırıcı faktörler olmadan fonksiyonel nöronlara yeniden programlanma yeteneğini araştırmak için tasarlanmış ve optimize edilmiştir.
Prosedürün gösterilmesi, laboratuvarda Postdoc olan Bob Hersbach ve laboratuvarımızda teknik yardım alan Tatiana Simon tarafından yapılacaktır. Başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin gövdesini 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve buz üzerinde tutun. Cildi makasla açın ve omurları küçük makasla çıkarın.
Daha sonra omuriliği çıkarın ve buz üzerindeki bir diseksiyon tamponuna yerleştirin. İki kat büyütmeli stereotaktik diseksiyon mikroskobu altında, forseps kullanarak meninksleri izole omuriliklerden çıkarın ve disseke edilmiş ve temizlenmiş omurilik dokusunu bir C tüpüne aktarın. Nöral doku ayrışma kitinden 50 mikrolitre enzim P ve her C tüpüne 30 mikrolitre önceden hazırlanmış enzim karışımı ekleyin.
C tüplerini ters çevirin ve tüm dokuların tüpün kapağında toplanmasını sağlamak için ısıtılmış ayrışmış bir yere yerleştirin. 800 mikrolitre astrosit kültür ortamı ekleyerek ve hücreleri birlikte verilen pistonla kolondan dışarı iterek kolonu ayırıcıdan çıkararak hücrelerden kaçın. Daha önce hazırlanan kültürdeki plaka hücreleri, mililitre EGF ve bFGF başına 10 nanogram ile desteklenmiş 4.2 mililitre astrosit kültür ortamı eklenerek şişelenir.
Diğer beyin bölgelerinden izole edilen astrositler için kültür şişelerini kaplamak gerekli değildir, ancak omurilikten izole edilen astrositler için daha iyi bir substrat sağlar. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Güvenlik seviyesi birinci olan biyolojik bir güvenlik dolabının altında astrosit oturma eylemi yapın ve metin yazısında açıklandığı gibi Poli-D-Lizin kaplı cam kapak kaymaları ile 24 kuyu plakası hazırlayın.
Kaplama için, altı omuriliği P2 farelerinden izole etmek yaklaşık 1 milyon hücre verir. Kültürlü astrositleri içeren T-12.5 kültür şişelerinden gelen ortamları aspire edin ve 1x PBS ile bir kez yıkayın. 0.5 mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyerek astrositleri kültür şişesinden ayırın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Hücreleri kültür şişesi yüzeyinden serbest bırakmak için şişenin yan tarafına hafifçe dokunun ve 10 kat büyütme kullanarak parlak alan mikroskobu altında ayrılmayı kontrol edin. 2.5 mililitre astrosit kültürü ortamı ile tripsinazasyonu durdurun ve 15 mililitrelik tüplerde hücre süspansiyonunu toplayın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 RCF'de santrifüj.
Süpernatantı aspire edin ve bir mililitre astrosit kültür ortamındaki hücreleri yeniden gönderin. Bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayma sistemi kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Hücre sayısına bağlı olarak, hücre süspansiyonunu, faktör başına mililitre başına 10 nanogramda EGF ve bFGF ile desteklenmiş taze astrosit ortamı ile seyreltin.
Daha önce hazırlanmış 24 kuyucuk plakasının ve kültür hücrelerinin her bir kuyucuğuna 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. 49 mililitre temel kültür ortamına bir mililitre B27 takviyesi ekleyerek nöronal farklılaşma ortamı hazırlayın. 24 ila 48 saat sonra, hücrelerin dönüştürülüp dönüştürülmediğine veya transfekte edilip edilmediğine bağlı olarak, astrosit ortamını kuyu başına bir mililitre nöronal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
Hücreleri% 9 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürleyin. Yeniden programlama verimliliğini artırmak için, astrosit ortamını farklılaşma ortamı ile değiştirirken, nöronal farklılaşma ortamını forskolin ve dorsomorfin ile sırasıyla 30 mikromolar ve bir mikromolar nihai konsantrasyona kadar destekleyin. Hücreleri forskolin ve dorsomorfin ile tedavi etmeyi tercih ederken, ilk tedaviden iki gün sonra ikinci bir doz dorsomorfin sağlayın.
Bu ikinci tedaviyi doğrudan kültür ortamına ekleyin. Astrositlerin birincil kültürleri, manyetik yardımlı hücre sıralama ve kaplamadan yedi ila 10 gün sonra% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştı. Kaplamadan sonraki gün, hücreler tipik olarak kapak kayma yüzeyinin% 50 ila% 60'ını kapladı.
Kültürler bu aşamada büyük ölçüde astrositlerden oluşurken, nöro patlamalar gibi diğer hücre tipleri neredeyse hiç yoktu. Transdüksiyon veya transfeksiyondan sonraki yedi günde, indüklenen nöronal hücreler astrositlerden açıkça ayırt edilebilirdi. Nöronal hücreli soma, yeniden programlanmamış Astrositlerin uzun süreçlere sahip olduğundan daha küçüktü ve nöronal belirteç, beta üç tübülin için pozitif ve astrosit belirteci GFAP için negatifti.
Transdüksiyon veya transfeksiyondan sonraki 21 günde, birçok indüklenmiş nöron aksiyon potansiyellerini ateşleyebildi ve olgun nöronal belirteç NeuN ve pan sinaptik protein Sinaptofizin için pozitifti. İlgilenilen bölgeyi düzgün bir şekilde incelemek esastır. Çevre dokudan kontaminasyonun önlenmesi.
Meninkslerin ve dorso kök ganglionlarının izole omurilikten çıkarılmasına özen gösterilmelidir. Bu yöntem, astrositleri serebral korteks, dorsal orta beyin ve beyincik dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinden izole etmek için kullanılabilir. Gelecekte, bu teknik bölgesel astrositler ve fonksiyonel nöronlara yeniden programlanma potansiyelleri hakkındaki bilgimizi genişletmemize izin verecektir.
