We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

Federal reçete hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak - (350 gr 250) ve Kaliforniya San Diego Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi Deneysel protokoller dişi Long Evans fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. 1. Vücut Kısıtlama için Rat acclimating NOT: Bir kısıtlı diyet sıçan yerleştirin. Kısıtlama (aşağıda açıklanmıştır) sıçan gelmesini hemen her gün kullanım seansından sonra günde bir kez sıçan besleyin. Ilk ağırlığının% 80 hayvan korumak için yeterli yem sağlayın. Bu miktar 250 g ağırlığında dişi Long Evans fare için günlük besleme bölgesinin yaklaşık 6 gramdır. <ol><li> Insanlar tarafından işlenen sıçan alıştırıldı. Yavaşça yaklaşık 5 saniye her 30 sn süre için elle sıçan dizginlemek. 2 gün üst üste 15 dakika bir gün için bunu yapın. Eğitim süresince stres belirtileri günlük sıçan izleyin. İşaretler i mücadele dahilkısıtlama, seslendirme ve diş gevezelik n yanıtı. </li><li> 3. günde, 15 dakika, iki arka arkaya günde bir, günde bir vücuda sınırlayıcı kumaş çorap (Şekil 1), sıçan yerleştirin. </li><li> 5 inci gününde, çorap içine sıçan yerleştirin ve deneysel jig üzerine sert bir tüp (Şekil 4) içine çorap yerleştirin. 2 ardışık günde 15 dakika günde boru sıçan bırakın. </li><li> Her antrenmandan hemen sonra sıçan besleyin. Son oturumda (6. gün) sonunda gıda sınırsız erişim sağlar. Implantasyon için son eğitim gününde aşırı stres belirtileri göstermeye yok sadece bu sıçan seçin. NOT: implantasyon için sıçanların seçimi bizim elimizde, subjektif olmasına rağmen sıçanların% 90&#39;ın üzerinde bağımlılığına duyarlı ve implantasyonu geçmesi mümkün bulundu. </li></ol> 2. Kayıt Odası ve Baş-kısıtlama Mekanizması implante <ol><li> Bir yeniden yapınBir pin konnektörüne çıplak paslanmaz çelik tel lehim teli fark olmamas. 3-5 mm kalıntıları pin tarafından ortaya böylece tel kesin. Tüm cerrahi aletler ile birlikte, referans tel otoklavlayın. </li><li> Ketamin / ksilizin anestezi yönetme. 95 mg / intraperitoneal / kg ksilizin 5 mg ile karışık kg ketamin yönetme. başlangıç ​​dozu 1 ½ 2 saat boyunca devam eder. Gerektiği gibi, her 30-45 dk sonra anestezi Supplement. Bir göz merhem ile hayvanın gözlerini yağlayın. </li><li> Anestezi uçağı belirlemek ve gerekli anestezi korumak için ayak çekme refleksini kontrol edin. </li><li> Kulak çubukları ile bir stereotaksik tutma çerçeve içinde sıçan yerleştirin (Şekil 3A). Kafasına saç tıraş ve povidon-iyot (% 10 solüsyon) ile yara sitesi dezenfekte edin. Onlar kulak zarını zarar vermez, böylece uygun kulak çubukları eklemek için özen gösterin. Künt uçlu kulak çubukları tercih edilir. </li><li> Bir neşter Yaklafl bir kesi yapmakk kulak arkasına gözlerin postero-kaudal düzeyden kafatası orta hat boyunca. Kesme ve kesiğin iki tarafında bir deri 2-3 mm&#39;lik şeridinin çıkarılması için makas kullanın. </li><li> Yanal sırtlara dışarı kafatası yüzeyini açığa çıkarmak için periost kazınması. Superglue ince bir tabaka ile maruz kafatası örtün. </li><li> ½ mm çaplı matkap çapak kullanarak, 0-80 vida biraz daha küçük çaplı, küçük bir delik delin (Malzeme bölümüne bakınız). Vida alt daha yanal üst gitmek böylece delik hemen Bregma dikiş yanal sırt karşılar, ve kafatası içine 30-45 ° açıyla yere posterior Matkap. </li><li> 30-45 ° açıyla, delik (yaklaşık 3 tur) bir 0-80 düz taban makine vida vidalayın. Altta yatan beyin dokusu zarar vermemek için çok derin bir vida için dikkatli olun. </li><li> Gösterilen konfigürasyonda 6 ek vidalar için bu işlemi tekrarlayın <strong&gt; (Şekil 3B). Tüm vidalar tabanına superglue uygulayın. </li><li> Stereotaksi manipülatör bir şırınga iğnesi yerleştirin. Bir referans işareti olarak, istenen kraniotomi konumu Bregma dikiş itibaren ölçün ve yakın iğne ile kafatası bir göçük yapmak, ama dışarıda. NOT: Bu gösteri, markanın stereotaksik koordinatları 3 mm arka ve Bregma dikiş lateral 1 mm. </li><li> Kalıcı bir kalem ile göçük işaretleyin. Bir stereotaksik referans noktası olarak hizmet verecek gibi, marka stereotaksik koordinatlarını Not (Şekil 3B). </li><li> İstenen koordinatları (3 mm posterior ve bu örnekte bregma yanal 3 mm) üzerinde merkezlenmiş bir kranyotomi yapın. Sağlam dura mater bırakın. Tadil edilmiş yapay beyin omurilik sıvısı kraniyotomi Kapak (125 mM NaCI, 10 mM glukoz, 10 mM HEPES, 3.1 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, pH 7.4) içinde 13 (Şekil 3C). </li&gt; <li> 4 0.2 ml santrifüj tüp Cut - uzunluğu 5 mm, ve kapağı kesti. Kafatası üzerinde tüp yerleştirin ve Kraniotomi üzerine merkezi. </li><li> Kafatasına tüpün tabanını mühürlemek için tüpün alt etrafında diş çimento uygulayın. Maruz Kraniotomi (Şekil 3D) içine çimento sızıntı dikkatli olun. </li><li> Kontralateral kranial plaka başka bir küçük delik (yaklaşık ½ mm çapında) delin ve dikkatle referans teli takın. (Donatımı bölümüne bakınız) telin ucuna kayıt amplifikatör ile arabirimleri bir iğne lehim teli referans Construct. Referans tel hareket etmeyin bu neden olabileceği hasar olarak beyinde bir kez. </li><li> Tel sokulduğu bir delik superglue uygulanır. Bu geçici bir yerde pin ve tel mühür olacaktır. </li><li> Silikon jel kitinin iki parça karıştırın yaklaşık olarak eşit kısımlar halinde (Malzemeler kısmına bakınız). Karıştırma ve fil için iki dakika bekleyinl santrifüj tüpü yaklaşık ⅓ jel ile dolu. </li><li> Bir dik açı sonrası kelepçesini takın kafalık çubuğuna (Malzeme bölümüne bakınız). Plaka alt hayvanın burun doğru olduğunu böylece 45 ° eğim açısında tutma çubuğunun (Şekil 2B) kafa plakasını (Şekil 2A) takın. Bu deneysel jig (Şekil 4) uyacak şekilde pitch açısını ayarlamak için bir eğimölçere kullanmak yararlı olur. </li><li> Bar kulak çubukları paralel olacak şekilde stereotaksi manipülatör koluna tutma çubuğunu takın. Plaka kaudal-en vidasına lambda dikiş ve ön arka böylece bar ve plaka indirin. </li><li> Ön kafa cıvata kavrayın (bir 8-32 damızlık veya vida, Malzeme bölümüne bakınız) vidanın baş aşağı ve hayvan kuyruk doğru bakacak şekilde, bir yardım eller kol ve kelepçe ile yaklaşık 45 ° &#39;lik açıyla. O karınca değecek şekilde vidayı indirinerior 0-80 vida (Şekil 3F, G). </li><li> Diş akrilik ile yerde cıvata ve plaka sabitleyin. Kemik vida başlarının etrafında diş akrilik, referans pimini uygulayın ve santrifüj tüpünün yüzüne etrafında. Diş akrilik kuruması için yaklaşık 10 dakika bekleyin (Şekil 3H). </li><li> Implanta cilt çimentolama, diş akrilik kenarlarında diş çimento tabakası uygulayın. Çimento kurumasını bekleyin. </li><li> Santrifüj tüpünün kapağı birkaç delik karıştırmak ve tüp kapağını yerleştirin. </li><li> Yardım eller kelepçe çıkarın. Sonra dikkatlice stereotaksi kafa tutan çubuğunu kaldırmak ve daha sonra bar (Şekil 3I) kafa plaka kaldırmak. </li><li> Stereotaksi hayvan çıkarın ve yürürlükteki tüm kurallar, yönetmelikler, kanunlar ve (uygun post-operatif bakım ve izleme yönetmek, örneğin, Buprenorfin 0.02 mg / kg, 24 en az her 8-12 saatsaat). Inflamasyon implant kenarlarında oluşursa çözülene kadar, günlük etkilenen site antibiyotik merhem ince bir tabaka uygulayın. </li></ol> Nöronal Birimleri 3. Juxtacellular İzleme <ol><li> Bir karbondioksit lazer mikropipet çektirmesi üzerine kuvars kılcal boru çekin az 1 mikron (Şekil 5A) ucu çapları (Ekipman bölümüne bakınız). NOT: ısıtma parametreler arasında özellikle araca göre değişecektir ve gerekli olan boyun çapının ilgi beyin yapısına bağlı olarak değişecektir ki. Sıçan talamus kayıtları için, mikropipetler 5-7 mm arasında değişen boyunları var. </li><li> Uzun çalışma mesafesi hedefleri ile donatılmış bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskop altında yerine pipet sabitleyin. Mikroskop sahnede yerinde pipet tutmak için modelleme kil kullanın. </li><li> Mak için kullanılan bir cam parçası, 1 cm kalınlığında - Yavaşça 0.5 cam bloğu (hareketUltra-mikrotom bıçak ing pipet ile görüş alanı içine) uygundur. Sahne mikromanipülatör kullanarak, yavaşça kırmaya neden cama pipet dokunun. Pipet dış çapı 1-3 mikron arasında olana kadar gerekli tekrarlayın (Şekil 5B, C). Bu mikropipetler yaklaşık 5-15 MΩ arasındaki empedanslara sahip olduğundan emin olun. </li><li> Hücre-dışı tuzlu su (135 mM NaCI, 5.4 mM KCI, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaOH ile 5 mM HEPES, pH 7.2) ile 8 Hazırlama Chicago Sky Blue (ağ / hac)% 2 ekleyin. 30 G iğne ya da daha küçük olan bir şırınga kullanılarak, çözelti ile pipet arka uç doldurun. Seçenek olarak ise, tek bir hücre juxtacellular etiketleme için% 2 ilave (ağırlık / hacim) neurobiotin da biyotinile edilmiş dekstran amin (BDA-3000 ya da BDA-10000) ve Chicago Sky Blue yerine tuzlu su çözeltisine ilave edilir. </li><li> Uygun bir deneysel jig üzerinde sert tüp içinde bez çorap içine sıçan yerleştirin ( <strong&gt; Şekil 4) .Wait kafa tutma jig üzerinde hayvan yerleştirmeden önce ameliyat sonrası 72 saat en az. Havayolu tıkanıklığı önlemek için, yerine boyun daha üst sternum etrafında İpli sıkın. Solunum zorlanarak veya tıkalı gibi görünüyorsa, İpli gevşetin veya posterior taşıyın. Sıçan uyarı ise bu yordamı uygulayın. </li><li> Jig karşılık gelen parça sıçan baş-frenleyici plaka takın. Bunu yapmak için, ilk etapta baş kısıtlama plaka pin ve daha sonra bir 4-40 vida kullanarak sabitleyin. Hayvan başına aşırı tork uygulayarak önlemek için sakin beklemek emin olun. Sonraki sıçan implante edilir kafa frenleyici cıvata somunu bir 8-32 yerleştirin. Sonra baş cıvata dişli paslanmaz çelik çubuk vida. Yerine sıkılabilecek bir şekilde (Şekil 4) &#39;de deneysel jig çubuğun yapıştırın. NOT: Baş-kısıtlama plaka min yanı sıra baş cıvata ile hayvan güvenliğinidüzeneğin bükme imizes ve kayıt kararlılığını geliştirir. İlk gün başlayabilir kayıt Çoğu durumda hayvan kafa ölçülü olduğunu. Hayvan aşırı kıpırdıyor veya seslendirir Ancak, herhangi bir kayıtları başlamadan önce baş-emniyet alışma eğitimi bir gün sunmak. Bu durumda, 15 dakika boyunca şablon üzerine hayvan bırakın ve daha sonra kafes içinde geri koyun. Ertesi gün bu adımı tekrarlayın ve protokol ile devam edin. </li><li> Kayıt odasına açın ve silikon jel çıkarın. Doku Kraniotomi yeniden büyüdü eğer ince forseps kullanarak kraniotomiye temizleyin. </li><li> Motorlu mikromanipülatör pipet takın ve headstage öncesi amplifikatör takın. NOT: Bu gösteride, headstage küçük bir röle devresi amplifikatör kurşun teller ve yüksek uyum (Şekil 6A-C) ile harici akım kaynağı arasında geçiş yapmak için kullanılır. Bazı amplifikatörler yerleşik bir uygun en yüksek uyum kaynağı olduğunu unutmayın(Tartışma ve Malzeme bölümlerine bakınız). </li><li> Kayıt odasında stereotaxically tespit işareti pipet ucu taşımak için motorlu mikromanipülatör kullanın. Bu konumun koordinatlarını unutmayın. Kafatası üzerinde pipet ucu kırmak için değil dikkatli olun. </li><li> Ön-arka ve iç-dış eksende istenilen kayıt konuma pipet taşıyın. Amaçlanan kayıt konumuna yaklaşık 500 mikron dorsal kadar Sonra dura ile ventral pipet ilerlemek. </li><li> Pipet ve referans tel arasında kaydedilen güçlendirilmiş gerilim bir ses monitörde olayları spike için dinlerken yavaşça pipet ilerlemek. Bir kez spiking olaylar tespit edilir, yaklaşık 500 mV gözlenir daha fazla pozitif gidiş gerilim sapması kadar pipet 0-100 mikron hareket devam ediyor. NOT: elektrot direnci yaklaşık 1,5-10 wh bir faktör artacakBu durumda en. </li><li> Bir kez birim ilgi tüm diğer davranışsal ve fizyolojik önlemlerle birlikte, 3.11 adıma göre izole edilmiş kayıt başlayın. Bu gösteride, kendi ürettiği bıyık hareketleri (Malzeme bölümüne bakınız) yüksek hızda videografi ile izlenmektedir. </li><li> Kayıt siteyi etiketlemek için, elektrot akım kaynağına bağlanmak yol açar geçiş. , Yerleşik bir el mevcut amplifikatör kaynağı, ya da (Şekil 6D, bkz adım 3.8 ve Tartışma) - ya bir röle devresi (C Şekil 6A) kullanarak bunu yapmak için birkaç yolu vardır. Geçiş -4 uA% 50 işlem devirinde 2 sn darbeleri ile 4 dakika boyunca iyontoferik pipet ile Chicago Sky Blue enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir. </li><li> Öldürmek ve standart uygulamaya göre çeşitli etiketleme prosedürlerinden sonra hayvan serpmek. Bölüm olarak gerekli beyin ve counterstain kayıt anatomik konumu oturup tanımlamak içinör. 14 uyarınca sitokrom oksidaz reaktiflik için doku Counterstain. Alternatif olarak, floresan mikroskobu kullanarak Chicago Sky Blue mevduat tespit. NOT: doğru etiketler arasında pipet çözülmesini olmadan, tüm etiketler aynı gün aynı pipet ile yapılır önemlidir farklı etiketli birimler ayırt etmek. Bu durumda kayıt siteleri her sitenin kaydetti manipülatör koordinatları ile birlikte post-hoc histoloji onların göreceli konumlara göre ayırt edilebilir (adım 3.9 bakınız). Kesin tanımlama için, birbirlerine ve beyin bölgelere göre en fazla 3-5 etiket en az 200 mikron dışında etiketleri işaretleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Fee, M. S., Leonardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniature+motorized+microdrive+and+commutator+system+for+chronic+neural+recording+in+small+animals.">Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).</li><li>Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-miniature+headstage+with+6-channel+drive+and+vacuum-assisted+micro-wire+implantation+for+chronic+recording+from+neocortex.">Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).</li><li>Szuts, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+multi-channel+neural+amplifier+for+freely+moving+animals.">A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals.</a> Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).</li><li>Roy, S., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+multi-channel+single+unit+recording+in+freely+moving+and+vocalizing+primates.">Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates.</a> Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).</li><li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+metrics+to+accompany+spike+sorting+of+extracellular+signals.">Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).</li><li>Person, A. L., Perkel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pallidal+neuron+activity+increases+during+sensory+relay+through+thalamus+in+a+songbird+circuit+essential+for+learning.">Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning.</a> The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).</li><li>Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific.">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li><li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).</li><li>Hellon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marking+of+electrode+tip+positions+in+nervous+tissue.">The marking of electrode tip positions in nervous tissue.</a> The Journal of physiology. 214, 12P (1971).</li><li>Furuta, T., Desch&#234;nes, M., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+distribution+of+thalamocortical+boutons+in+barrels.">Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1986).</li><li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes.">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).</li><li>Moore, J. D., Desch&#234;nes, M., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-generated+vibrissa+motion+and+touch+are+differentially+represented+throughout+ventral+posterior+medial+thalamus+in+awake,+head-fixed+rats.">Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats.</a> Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).</li><li>Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whisking+in+air:+Encoding+of+kinematics+by+VPM+neurons+in+awake+rats.">Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats.</a> Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).</li><li>Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+motor+cortex+reports+efferent+control+of+vibrissa+position+on+multiple+time+scales.">Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales.</a> Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).</li><li>Moore, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+orofacial+rhythms+revealed+through+whisking+and+breathing.">Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing.</a> Nature. 497, 205-210 (2013).</li><li>Duque, A., Zaborszky, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , 197-236 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , .</li><li>Urbain, N., Desch&#234;nes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroactive+substances:+Neuropharmacology+by+microiontophoresis.+(Kation+Scientific),+Dyes+and+Tracers:+Sitemarking+and+tracktracing+by+microiontophoresis.+(Kation).">Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation).</a> Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Deneysel jig İnşaatı Bu çeşitli şekillerde imal edilebilir deney jig (Şekil 4) oluşturmak için kullanılan mekanik parçaların açıklaması protokol atlandı. Bu gösteri standardında opto-mekanik parça ve destek kelepçeler kafalık bar ve vücut kısıtlama tüp (Malzeme bölümüne bakınız) monte etmek için kullanılır. Benzer opto-mekanik parçalar motorlu mikromanipülatör elektrot tutucu monte etmek içi...

Aktif bir davranış görev yapan bir uyarı hayvanda nöronal aktivitenin izlenmesi sinir sisteminin fonksiyonunu ve organizasyonunu anlamak için önemlidir. Tek nöronal birimlerinden gelen elektriksel aktivite Hücre dışı kayıt uzun sistemleri nörobilim bir elyaf araç olmuştur ve şu anda kullanımda yaygın hala gelmiştir. Elektrot türleri ve yapılandırmaları çeşitli özel bir deney bilimsel ve teknik taleplerine bağlı olarak mevcuttur. Kronik mikro sürücü implante veya elektrot dizileri genellikle kuşlar, kemirgenler ve insan olmayan primatlar 1-4 de dahil olmak üzere serbest hareket eden hayvanlar, kullanılır. Alternatif olarak, harici bir mikromanipülatör yoluyla, metal veya cam Mikroelektronlar akut girmeler genellikle anestezi veya kafa ölçülü hayvanlardan kaydetmek için kullanılır. Cam mikropipet elektrotlar juxtacellular kullanılan ya da &quot;hücre bağlı&quot; gibi bir avantajı vardır yapılandırma açıkça izole etmek için5 sıralama post-hoc başak komplikasyon olmadan tek nöronların aktivitesi. Onlar boya veya Nöroanatomik izleyiciler küçük mevduat enjekte, hatta tek bir hücre kaydedildi doldurmak için kullanılabilir gibi Bu elektrotlar daha, anatomik tanımlanan hücreleri veya konumlardan kayıt izin. Bu yapılandırma, başarılı bir fare, sıçan ve kuşlar 6-10 uygulanmıştır. Şu anda açıklanan teknik juxtacellular izleme ve uyarı hücre dışı boya mevduat, baş-ölçülü fareler üzerinde duruluyor. Bu boya mevduat hücre morfolojisi veya aksonal projeksiyonlar 11 hakkında bilgi vermemektedir doldurur juxtacellular ki aksine tek hücre Not, ancak uyarı hayvanlarda önemli ölçüde daha yüksek verime sahip, eleştirel, yaklaşık 50 um kesin anatomik lokalizasyon etkinleştirin ve. Yine anatomik etiketlenmesi için alternatif bir strateji olarak sağlanır doldurur juxtacellular tek hücre ile ilgili bilgiler. Kısaca,protokol üç ana aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada, sıçan 6 günlük bir süre boyunca bir bez çorap (Şekil 1) vücut kısıtlama alıştırıldı edilir. İkinci aşamada ise, bir kafalık cihazı (Şekil 2) ve kayıt odası cerrahi sıçan birden sonraki kayıt seansları (Şekil 3) sırasında sterotaksik düzlemde muhafaza edilebilir şekilde implante edilir; Bu prosedür, standart referans 12 koordinatları dayalı elektrofizyolojik çalışma için beynin belirli alt-kortikal bölgeleri hedef deneyci sağlar. Üçüncü aşama açıkça tek birimleri 6-9 izole juxtacellular nöronal kayıtları, (Şekil 5) kuvars kılcal tüpten elektrot inşa, davranışsal ve elektrofizyolojik deneyleri (Şekil 4) yürütmek yapmak için uygun bir jig sıçan yerleştirerek içerir ve anatomik Locati işaretlemeChicago Sky Blue boya (Şekiller 6 ve 7) ile kayıt site üzerinde. kayıtlar eş zamanlı davranışsal izleme ile yapılır; Bununla birlikte, davranış teknik detayları Her deney bilimsel hedeflerine bağlı olacak ve tek bir protokol kapsamı dışında kalırlar. Birden fazla gün tekrar edilebilir deney prosedürünün tamamlanmasından sonra, hayvan kurban edilir. Beyin parlak alan veya floresan mikroskobu kullanarak standart nöroanatomik tekniklere göre ayıklanır ve işlenir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Ketaset (Ketamine HCl)</td>
			<td style="width:179px;">Fort Dodge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Anased (Xylazine solution)</td>
			<td style="width:179px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Betadyne (Povidone-Iodine)</td>
			<td style="width:179px;">CVS Pharmacy</td>
			<td align="right" style="width:175px;">269281</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Loctite 495</td>
			<td style="width:179px;">Grainger Industrial Supply</td>
			<td style="width:175px;">4KL86</td>
			<td style="width:315px;">20-40 cp cyanoacrylate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Vetbond</td>
			<td style="width:179px;">3M</td>
			<td style="width:175px;">1469SB</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement powder</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675571</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement liquid</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675572</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Silicone Gel</td>
			<td style="width:179px;">Dow Corning</td>
			<td align="right" style="width:175px;">Mar-80</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Jet denture repair acrylic powder</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Chicago sky blue</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C8679</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:175px;">158127</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">P3813</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C2506</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Diaminobenzidine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">D5905</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Material Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Rat sock</td>
			<td style="width:179px;">Sew Elegant (San Diego, CA)</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 1, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">PVC tube 2 &#189;&#8221;</td>
			<td style="width:179px;">U.S. Plastic Co.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">34108</td>
			<td style="width:315px;">Figure 4</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Subminiature D pins &#38; sockets</td>
			<td style="width:179px;">TE Connectivity</td>
			<td style="width:175px;">205089-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel music wire 0.010&#8221; diameter</td>
			<td style="width:179px;">Precision Brand Products, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">21010</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic holding frame</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 900</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic ear bars</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 957</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic manipulator</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 960</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">&#189; mm drill burr</td>
			<td style="width:179px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:175px;">100-3995</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quiet-Air dental drill&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Midwest Dental</td>
			<td style="width:175px;">393-1600</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel 0-80 1/8&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">247438</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">0.2mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">05-407-8A</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Custom head-holding bar</td>
			<td style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:191px;">Custom head-holding plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:315px;">Custom made, Figure 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Right angle post-clamp</td>
			<td style="width:179px;">Newport</td>
			<td style="width:175px;">MCA-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">8-32 3/4&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">240181</td>
			<td style="width:315px;">For head-restraint, Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">4-40 &#188;&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">239958</td>
			<td style="width:315px;">For head restraint, Figures 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quartz capillary tubing</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">QF-100-60-10</td>
			<td style="width:315px;">Figure 5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Carbon dioxide laser puller</td>
			<td style="width:179px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:175px;">P-2000</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">MP-285</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">Multiclamp 700B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier head stage</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">CV-7B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Isolated pulse stimulator</td>
			<td style="width:179px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:175px;">Model 2100</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Audio monitor</td>
			<td style="width:179px;">Radio Shack</td>
			<td style="width:175px;">32-2040</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:191px;">Pipette holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">Warner Instruments</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">#MEW-F10T</td>
			<td style="width:315px;">Alternate parts: see Discussion</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Figure 6A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Electrode lead wire</td>
			<td style="width:179px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:175px;">NEF34-1646</td>
			<td style="width:315px;">(optional), Figure 6D</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Relay for amplifier head-stage</td>
			<td style="width:179px;">COTO Technology</td>
			<td style="width:175px;">#2342-05-000</td>
			<td style="width:315px;">(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Digital video camera</td>
			<td style="width:179px;">Basler</td>
			<td style="width:175px;">A602fm</td>
			<td style="width:315px;">(optional) For behavioral monitoring, Figure 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtacellular monitoring and localization of single neurons within sub-cortical brain structures of alert, head-restrained rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

<html> Bir sıçan aktif çırpma gibi bıyık hareketinin faz kendi ürettiği 15,16 çırpma esnasında kodlamak talamus ventral posterior medial (VPM) nöronal birimler. Şekil 7A bir VPM talamik birimin örnek spike aktivitesini gösterir. Şekil 7B başak bir histogram gösterir Zaman bıyık hareket 17 anlık aşamasına hizada. Çırpma geri çekilme aşamasında daha fazla sivri vardır. Şekil 7C&#39;de gösterildiği gibi Kayıttan sonra, ...

Watch this Scientific Journal Video about Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats at JoVE.com

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Uyarı, Baş-ölçülü Sıçanların Alt-kortikal Beyin Yapıları içinde Juxtacellular İzleme ve Yerelleştirme Single Nöronlar

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K Görüntüleme.  University of California, San Diego. This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Video: Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Nörobilim

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Transkraniyal elektrik beyin stimülasyonu uyarı Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Fare beynindeki Locus Coeruleus lokalizasyonu

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

A Bedside, Single Burr Hole Approach to Multimodality Monitoring in Severe Brain Injury

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic brain injury. While elevations in ICP are common, data regarding the measurement and treatment of these ICP elevations are conflicting. There is increasing recognition that changes in the balance between supply and demand of brain tissue are critically important and therefore the measurement of multiple modalities is required. Approaches are not standard, and therefore this article provides a description of a bedside, single burr hole approach to multimodality monitoring that allows the passage of probes designed to measure not only ICP but brain tissue oxygen, blood flow, and intracranial electroencephalography. Patient selection criteria, operative procedures, and practical considerations for securing probes during critical care are described. This method is readily performed, safe, secure, and flexible for the adoption of a variety of multimodality monitoring approaches aimed at detecting or preventing secondary brain injuries.

A method of recording multimodality monitoring signals in patients with severe brain injuries using a bedside, single burr hole technique is described.

Ciddi beyin hasarı mobil izleme için bir başucu, tek Burr deliği yaklaşım

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Beyin Yapılarının Üç Boyutlu Şekil Modellemesi ve Analizi

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.