Biz Profs teşekkür etmek istiyorum. Kapsamlı destek için Huibert Mansvelder ve Bert Sakmann, verimli tartışmalar ve teknik yardım için nöronal izleme ve Brendan Lodder sağlamak için Dr Marcel Oberlaender. Veri cömertçe R. Bruno (Columbia Üniv., NY, ABD) tarafından sağlanan LabView için ntrode VI, kullanılarak elde edilmiştir. Bu araştırma Max Planck Derneği ve Hesaplamalı Sinirbilim, Tübingen için Bernstein Merkezi tarafından desteklenmiştir (Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (Bmbf tarafından finanse; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics ve Bilişsel Araştırma Merkezi (CNCR) , Neuroscience Kampüs Amsterdam (NKA), CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 ve ENC-Ağ # p3-c3) ve VU Üniversitesi Amsterdam fon.

1.. Animal hazırlanması Tüm deneysel prosedürleri VU Üniversitesi Amsterdam, Hollanda&#39;da yerel etik komite tarafından Hollanda yasaları uyarınca ve değerlendirilmesinden sonra yapılır. <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile (% 0.9 NaCI, 1.6-1.7 g / kg &#39;de% 20) üretan ile izofluran (oksijen içinde% 2-3) ile ve daha sonra bir Wistar sıçan (P25-P45, ♂ / ♀) anestezisi. Tutam çekilmesi, göz kapağı refleksleri ve burun kılı hareketlerini izleyerek anestezi derinliğini değerlendirin. </li><li> Halinde üretan ek bir doz (başlangıç ​​dozunun% 10) yönetmek hayvanın yeterli anestezi derinliği ulaşamazsa ya da burun kılı twitches deney süresince gözlenir zaman. </li><li> Bir ısıtma yastığı ile donatılmış stereotaksik çerçeve üzerine anestezi hayvan koyun, rektal sıcaklık probu eklemek ve bir ısıtma yastığı ile 37.5 ± 0.5 ° C &#39;de, hayvanın vücut ısısını korumak. </li><li&gt; stereotaktik çerçeve içinde hayvanın kafasını yerleştirin; görünen cildi işlemek için makas kullanarak başının üstüne saç kesme. </li><li> Operasyon yerinde lokal anestezi için 100 ul% 1 lidokain, deri altı (% 0.9 NaCl) enjekte edilir ve 3-5 dakika bekleyin. Kuyruk-to-rostral yönde keserek kafatası yüzeyi kaplayan deri çıkarın ve geri kalan doku temizleyin. </li><li> % 0.9 NaCl ve emici bezlerden ile yoğun kafatası temizleyin. </li><li> (: 2.5 mm posterior ve bregmaya yanal 5,5 mm birincil somatosensoriyel korteks (S1)) sol yarımkürede hedef alan koordinatlarını belirlemek. Bir cerrahi cilt marker kalem ile kafatası üzerinde konumunu işaretlemek. </li><li> Kemik şeffaf hale gelir ve kan damarları açıkça görülebilir kadar ilgi bölgesinden bir diş matkap yavaşça kemik kazıyın. </li><li> Dura mater zarar kaçınarak, bir neşter (# 11) ile inceltilmiş kafatasında bir pencere keserek 0.5 mm x 0.5 mm kraniotomiye olunve kan damarları. İsteğe bağlı: görünürlüğünü artırmak için cerrahi bir cilt işaretleyici kalem kullanılarak kraniotomi kenarlarını işaretleyin. </li><li> Kraniotomi kuşatan bir banyo (yani kayıt odası) oluşturmak için kuru kafatası ve daha sonra diş çimento üzerinde superglue ince bir tabaka uygulayın. </li><li> Bıyık folikül tam 5 mm kontralateral tarafta bıyıkları kırpmak. İsteğe bağlı: siyah maskara ile kesilmiş bıyıkları vurgulayın. </li></ol> 2. Juxtasomal Kayıtlar ve Biocytin Etiketleme <ol><li> 3-5 MQ direnci ile elektrotlar elde etmek ~ 1 mikron iç ucu çapı ile borosilikat cam yama pipetler olun. Not: juxtasomal kayıt için ideal bir pipet morfoloji kademeli sivrilik, düşük koni açısı ve bir ~ 1 mikron ucu (Şekil 1). </li><li> (Pial yüzeyine göre) kayıt derinliğine bağlı olarak, kayıt elektrot şev boyutları ayarlanmalıdır. Önem bu to çap kayıt alanının mekanik hasar veya stresi önlemek için beyinde giriş noktada en az 75 mikron olmalıdır konik. Nispeten derin kortikal katmanları kayıtları maksimum dış yine, 1,500-1,800 um daha uzun bir konik gerektirir ise bu yüzeysel kortikal kayıtları için, maksimum 75 um&#39;lik bir dış çapı 300-500 um&#39;lik bir şev (Şekil 1A) gerekli olduğunu gösterir (elektrot ucundan 1.800 mikron olarak) 75 mikron çapı. </li><li> Normal sıçan zil (NRR) ile yama pipet yükleyin 2% biocytin ile desteklenmiş (çözümleri ve reaktifler için bakınız Tablo 1) ve bir micromanipulator sabit bir kafa sahnede yama pipet montaj. </li><li> Özellikle sıçan S1 D2 sütun hedeflemek için sagital düzleme göre 34 ° &#39;ye kadar, elektrot tutucu açısını ayarlayın. </li><li> Köprü modunda bir amplifikatör (yani şimdiki kelepçe) için kafa sahne bağlayın. </li><li> Yama yerleştirinkraniotomi yakın pipetle. % 0.9 NaCl ile banyo doldurmak ve pozitif akım enjeksiyon (1 nA, on / off 200 msn) ile bir kare darbe uygulayarak değerlendirilen 3-5 MQ arasında olmalıdır elektrot direncini belirlemek. </li><li> Kare bakliyat (1 nA, on / off 200 msn) gibi pozitif akımı uygulanması sırasında 100-150 mbar aşırı basınç kurmak ve 1 mikron adımlarla yama pipet ilerlemek. Dura mater ile temas kurarak üzerine sağlam direnç değişimi izleyin. Bu noktada, doğru derinlik ölçümü izin vermek için &quot;sıfır&quot; için mikromanipülatör koordinatlarını ayarlayın. </li><li> Yama pipet elektrot direnci ani bir düşüş ile gösterilen dura mater girinceye kadar 1 mikron adım modunda ilerlemek. Pipet tutma basıncını çıkarın. </li><li> 1 mikron adımlarla ilerleyen süre tek birimler arayın. / Kapama bakliyat 200 msn&#39;den uygulayarak sürekli elektrot direnci izleyin. Elektrot direnci Typic bir artışmüttefiki tek bir nöron yakınlığını gösterir. Pozitif hareket potansiyelini (AP) ~ 2 mV dalga formu (Şekil 2A ve 2B) kaydedilir kadar elektrodu ilerletin. </li><li> İsteğe bağlı: nöronun kendiliğinden engelleyici desen kaydedin ve tespit bıyık-uyarılmış kaudal bir piezoelektrik cihaz 18 kullanılarak 3.3 ° &#39;lik bir açı ile 200 msn için ayrı bir bıyık saptırma, örneğin, ile spike. </li><li> Direnci 25-35 MQ ve sivri juxtasomal dolum en uygun koşulları elde etmek için 3-8 mV&#39;luk genlikleri kadar elektrot ilerlemek. Pozitif akım (1 nA, on / off 200 msn) kare bakliyat uygulayarak juxtasomal dolum başlatın. AP dalga biçimi ve frekans (Şekil 2A ve 2B) ve izleme sırasında yavaş yavaş yavaş 0.1 nA aşamaları mevcut artar. </li><li> Blok darbesi (Şekil 2C-on aşamasında AP frekans belirgin bir artış gibi, zar açıklığı Monitör </strong&gt;). Dolum sırasında başak dalga artan bir genişliğe ve indirgenmiş sonrası hiperpolarizasyonuna (Şekiller 2C ve 2D) göstermektedir. Ek parametreler artan gürültü ya da bir küçük (1-5 mV) negatif DC vardiya içerir. </li><li> Artırın veya stabil biocytin infüzyon korumak için dolum esnasında (1 nA) akımı azalır. Azaltmak veya sodyum iyonları gibi iyonların hücre dışı, aşırı akışı ile toksisite önlemek için AP frekans ani artışı üzerine akım darbeleri durdurun. Not: Her nöron etiketleme parametreleri ayrı kayıt koşullarına bağlı olarak ayarlanması gerekir akım enjeksiyon ve juxtasomal farklı yanıt olacaktır. </li><li> Yakından mevcut enjeksiyon durdurduktan sonra sinyalini izlemek. Bir dolum oturumundan sonra başak dalga genellikle genişletmiş ve güçlü bir hiperpolarizasyonuna sonra azalır gösterir. Başak dalga (orijinal özelliklerine yani varlığını döndüğünde açıktır nöron, kurtarılması için bekleyinNormal sonrası hiperpolarizasyonuna, Şekil 2). </li><li> Gelişmiş boyama kalitesi için biocytin yükünü artırmak için nöron tam iyileşme sonra oturumları doldurarak biocytin tekrarlayın. </li><li> Başak genlik hücreye herhangi bir mekanik stresi azaltmak düşene kadar 1 mikron adımlarla yama pipet geri çekin. Yakından ilgili hayvanın vücut sıcaklığının izlenmesi ve solunum sırasında hücre yayılması için biocytin için en az 1 saat bekleyin. </li></ol> 3. Hayvan perfüze ve Beyin Çıkarma <ol><li> , Perfüzyon kurulum hazırlayın durulayın, ve% 0.9 NaCl ile boru preload. </li><li> Cerrahi bir tepsi üzerinde hayvan yerleştirin ve standart etiketleme bant ile sabitleyin. Anestezi yeterli derinliği sağlamak; ayak tutam ve göz kapağı refleksleri olmalıdır. </li><li> Sadece göğüs kafesinin altında karın duvarından kesi (5-6 cm) yanal ve sternum maruz posterior-anterior yönde devam etmek için bir orta yapmak.Öne sternum çekin ve dikkatlice diyaframdan karaciğer ayrı. </li><li> Alt kaburga kesti diyafram küçük bir kesi, yapın ve kalp açığa çıkarmak için karın boşluğunun tüm uzunluğu boyunca kesik devam etmektedir. </li><li> Perikard çıkarın. </li><li> Sol ventrikül içine iğne takın ve sağ atrium bir kesi yapmak. Karaciğer soldurması tamamlanana kadar% 0.9 NaCl (~ 8 ml / dak) ile serpmek. </li><li> Ön ayaklarında tutukluk kadar% 4 paraformaldehid (PFA) için infüzyon geçin ve alt çene belirgindir. </li><li> Bir makas kullanılarak sıçan başını kesmek </li><li> Kalan boyun kaslarını kaldırmak ve tamamen kafatası maruz. </li><li> Sırt tarafında beyin sapındaki makas yerleştirin ve dorsal konumunu koruyarak, sagital sütür boyunca dikkatle kemiği kesti. </li><li> Forseps kullanarak beyin maruz sutur iki taraftan kemikleri çıkarın. Dikkatle d önlemek için dura kaldırmakermeden. </li><li> Dikkatli beynin ventral tarafında künt spatula yerleştirin ve yavaşça beyin kaldırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de PFA tüm beyin gecede Post-fix 0.05 M fosfat tampon maddesi (PB) için beyin geçiş ve 4 ° C&#39;de saklayın </li></ol> 4. Teğet bölümlerinde Beyin dilimleme <ol><li> 0.05 M PB dışında beyin almak ve anterior bakan bir filtre kağıdı üzerine koydu. Koronal düzlem boyunca beyincik kesti ve orta sagital düzlemi boyunca keserek yarımküresini ayırmak için keskin bir jilet kullanın. </li><li> Montaj platformda superglue uygulayın ve ön sağ bakan ile sagital düzlemde sol yarımkürede monte edin. Bir vibratome üzerinde 45 ° &#39;lik bir açı ile monte platformu elde edin ve 0.05 M PB beyin daldırın. </li><li> Vibratome bir jilet güvenli ve beyin yüzeyi ile ilk temas yarımkürenin ön-arka düzlemin ortasında olduğundan emin olun. 24 100 mikron kestibölümleri ve 0.05 M PB ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içinde toplarlar. </li></ol> 5. Histolojik Prosedürleri <ol><li> Daha önce tarif edilen yöntemlere uygun olarak 25, sitokrom oksidaz boyama 24 ve avidin-biotin-peroksidaz yöntemi için histolojik protokolleri gerçekleştirir. İsteğe bağlı: floresan avidin / streptavidin-Alexa birleşimleri kullanılarak biocytin görselleştirmek. Bu ayrıca retrograd veya antegrad izleme teknikleri ile çift boyanmasını sağlar. </li><li> 0.05 M PB ve 3-3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) çözümleri için bakınız Tablo 2 (katman 4 S1 (L4) in varil görselleştirmek üzere, sitokrom oksidaz boyanması için çözelti içeren hazırlanması ile yıkayın bölümleri 5 x 5 dakika reaktif). 37 ° C de 30-45 dakika için önceden ısıtılmış çözeltide pia kesitler 6-12 inkübe </li><li> 6 x 5 dakika süreyle 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın ve% 3 H 2&#39;deki tüm bölümleri inkübe edilerek bir endojen peroksidaz etkinliğini gidermek </sub&gt; O, oda sıcaklığında (RT) 20 dakika süreyle 0.05 M PB 2. </li><li> 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın. 4 ° C de bir gece (çözümler ve reaktifler için bakınız Tablo 3) ABC-çözeltisi içinde bölümleri inkübe </li><li> 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın ve (çözümleri ve reaktifler için Tablo 4) biocytin doldurulmuş nöron görselleştirmek için DAB-solüsyon hazırlanır. Oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca filtre edilmiş çözelti içinde bölümleri inkübe edin. </li><li> 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın. Mikroskop slaytlar ve Mowiol ile kapak kayma (çözümleri ve reaktifler için bkz. Tablo 5) Mount bölümleri. </li><li> Işık mikroskobu kullanılarak etiketleme kalitesini belirler. </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+identity:+a+key+to+unlocking+the+function+of+neocortical+circuits.">Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).</li><li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellar+microcircuit+as+an+adaptive+filter:+experimental+and+computational+evidence.">The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).</li><li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+three-dimensional+structure+of+thalamocortical+circuits+in+a+column+of+rat+vibrissal+cortex.">Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex.</a> Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).</li><li>Dyer, M. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+proliferation+during+retinal+development.">Regulating proliferation during retinal development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).</li><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics:+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations.">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li><li>Urban, N., Tripathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Circuits+drive+cell+diversity.">Neuroscience: Circuits drive cell diversity.</a> Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).</li><li>Gentet, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+functional+properties+of+somatostatin-expressing+GABAergic+neurons+in+mouse+barrel+cortex.">Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex.</a> Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).</li><li>Burgalossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcircuits+of+functionally+identified+neurons+in+the+rat+medial+entorhinal+cortex.">Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex.</a> Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).</li><li>Herfst, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-based+stabilization+of+juxtacellular+recordings+in+freely+moving+rats.">Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats.</a> J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).</li><li>Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+biocytin+labeling+and+neuronal+3D+reconstruction.">Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).</li><li>Bruno, R. M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex+is+driven+by+weak+but+synchronously+active+thalamocortical+synapses.">Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses.</a> Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).</li><li>Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+restructures+thalamocortical+axons+during+adulthood.">Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood.</a> Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo-a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).</li><li>de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+and+cell+type+specific+suprathreshold+stimulus+representation+in+primary+somatosensory+cortex.">Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).</li><li>Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+and+standardization+of+the+rat+vibrissal+cortex+for+precise+registration+of+single+neuron+morphology.">3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).</li><li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+axon+morphologies+of+individual+layer+5+neurons+indicate+cell+type-specific+intracortical+pathways+for+whisker+motion+and.">Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).</li><li>Sakata, S., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+structure+of+spontaneous+and+sensory-evoked+population+activity+in+auditory+cortex.">Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex.</a> Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).</li><li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+action+potential+bursts+(&gt;or=+100+Hz)+in+L2/3+and+L5B+thick+tufted+neurons+in+anaesthetized+and+awake+rat+primary+somatosensory+cortex.">High frequency action potential bursts (&gt;or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).</li><li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific.">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li><li>Horikawa, K., Armstrong, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+means+of+intracellular+labeling:+injection+of+biocytin+and+its+detection+with+avidin+conjugates.">A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates.</a> J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).</li><li>O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Veinante, P., Deschenes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+study+of+motor+cortex+projections+to+the+barrel+field+in+rats.">Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats.</a> J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+high-frequency+action+potential+spiking+in+the+prefrontal+cortex+of+awake+rats.">Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).</li><li>Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+light+brightfield+mosaic+microscopy+for+three-dimensional+tracing+of+single+neuron+morphology.">Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology.</a> J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex.">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li><li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development.">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li><li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+without+disturbing:+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli.">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li><li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes).">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li></ol>

Authros ifşa hiçbir şey yok.

Juxtasomal yöntem davranışsal koşulları karşısında tek birimlerden vivo aksiyon potansiyeli çivilenmesi kayıt sağlar (anestezi, uyanık baş-sabit veya serbestçe hareket) biocytin-etiketleme post hoc hücre tipi sınıflandırma ve / veya 3D rekonstrüksiyon için kaydedilen nöron seçeneği ile. Büyük avantajı dışı (böylece noninvaziv) yapılandırmada fizyolojik parametrelerini elde etmek için, henüz biocytin 16,17,32 ile hücre nöron etiketlemek edememek. E...

Nöronal ağ oldukça spesifik morfolojik ve fizyolojik özellikleri 1-7, özelliği çok sayıda hücre türleri, oluşur. Bunun bir sonucu olarak, tek tek hücre tipleri (bakınız örneğin Gentet et al. 8 ve Burgalossi et al. 9) ağ içinde özel görevleri yerine getirir. Biz sadece nöronal ağlarda hücre tipine özel işlevleri anlamaya başlıyor ve çok keşfedilmeyi hala. Bu amaçla, çok sayıda laboratuarlar fizyolojik parametre 1,10-15 elde edilmiş olan aynı nöronal nüfusun morfolojik özelliklerinin analizine izin deneysel yaklaşımlar uygulamaktadır. Burada, biocytin ile kaydedilen nöronun elektroporasyon ile kombinasyon halinde hücre dışı (böylece invazif olmayan) bir yapılandırmada geleneksel kumanda pipetler kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları içerir juxtasomal etiketleme tekniği 16,17 gösterir.Bu yaklaşımın önemli bir avantajı, invaziv olmayan doğası tek nöronların aksiyon potansiyeli spike (örneğin diyaliz) hücrenin hücre içeriği değiştirmeden kaydedilir sağlar olmasıdır. Elektroporasyon ardından, juxtasomal yaklaşım yapısı (morfoloji) fonksiyonu (fizyoloji) bağlamak için post hoc hücre tanımlaması ve rekonstrüksiyon seçeneği sağlar. Tipik olarak, morfolojik yeniden omurga ve / veya bouton yoğunlukları miktarının veya elektron mikroskobu kullanılarak nm çözünürlükte nöronal morfoloji da yeniden genişletilebilir dendritik ve aksonal morfolojisi yeniden içerir. Çalışmaların çoğu, örneğin, fare ya da sıçan gibi küçük kemirgenlerde tekniği uygulanır olmasına rağmen juxtasomal kayıt tekniği, kortikal katmanları arasında türler ya da bir dizi alt kortikal bölgelerinde çeşitli hücre tiplerinin in vivo kayıtları için kullanılabilir. Bizim araştırma nöronlar kayıt ve etiketleme odaklanmıştırsıçan primer somatosensori korteks (S1) dan ve kayıtlı nöronların 18 görsel bir kimlik içerir, standart bir referans çerçevesi içinde kesin kayıt ile kombinasyon dendritik rekonstrüksiyonlar hücre tipine özel yerel karakterize etmek için kortikal ağları 4,19 ve aksonal mimarisi ayrıntılı yeniden tersine mühendislik ve uzun menzilli projeksiyon 20. hedefliyor. Uyanık baş sabit 23, ya da serbest hareket eden hayvanlar 9, alternatif bir in vivo kayıt teknikleri (hücre içi ya da bütün hücre) ile karşılaştırıldığında, juxtasomal kayıtları nispeten kararlı olan ve bu yüzden anestezi 21,22 dahil olmak üzere davranış eyalette uygulanabilir, 14, sedasyon . Biz seçim birçok preparatlar için bu tekniğin genel uygulanabilirliğe vurgulamak rağmen Burada, bir üretan ile anestezi uygulanmış sıçan S1 juxtasomal etiketleme göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">SM-6 control system</td>
			<td style="width:275px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">LN- Mini 23 XYZ</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lynx-8 amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Neuralynx</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Axoclamp-2B amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Osada model EXL-M40</td>
			<td style="width:275px;">Osada, inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Piezoelectric device</td>
			<td style="width:275px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">PL140.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Labview</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ntrode Virtual Instrument&#160;</td>
			<td>R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">(Labview acq. software)</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sugi absorbent swabs</td>
			<td style="width:275px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">30601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Cytochrome C from equine heart</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Catalase from bovine liver</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">DAB</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">H2O2</td>
			<td style="width:275px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">7047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Vectastain standard ABC-kit</td>
			<td style="width:275px;">Vector</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Triton X100</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urethane</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:275px;">Pharmachemie</td>
			<td style="width:119px;">45.112.110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L5647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Simplex rapid dental cement</td>
			<td style="width:275px;">Kemdent</td>
			<td>ACR308/ACR924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Biocytin</td>
			<td style="width:275px;">Molekula</td>
			<td style="width:119px;">36219518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">PFA</td>
			<td style="width:275px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8187151000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Trizma base</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T4661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:275px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Analytical grade glycerol</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">HEPES</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">NaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">KCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">22,350-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">MgCl2</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtasomal biocytin labeling to study the structure-function relationship of individual cortical neurons

Beyin korteksi, birlikte bir ağ olarak karar verme, duyusal kılavuzlu davranış veya bellek dahil olmak üzere birçok yüksek bilişsel işlevler sorumludur çok katmanlı ve çok farklı hücre tipleri ile karakterize edilir. Böyle karmaşık nöronal ağlar gibi görevleri gerçekleştirmek nasıl anlamak için, çok önemli bir adımdır hayvan ilgili bir bilişsel görevi gerçekleştirirken zaman tercihen, ağ içinde tek tek hücre tiplerinin işlevini (veya elektriksel aktiviteyi) belirlemektir. Ayrıca, ters kortikal ağını sağlamak için bireysel nöronların ağ ve morfolojik mimarisinin anatomik yapısını belirlemek için eşit derecede önemlidir. Bugün mevcut teknik atılımlar kaydedildi nöronları belirlenmesi post hoc değerli seçeneği ile hayvanlar davranmak, uyanık hücresel aktiviteyi kayıt izin. Burada, biz kayıt eylem potenti içerir juxtasomal biocytin etiketleme tekniği, göstermekal geleneksel yama pipetler kullanılarak dışı (ya da gevşek-yama) konfigürasyonunda spike. Juxtasomal Kayıt konfigürasyon, anestezi sedasyon, uyanık kafa sabit, ve hatta serbestçe hareket hayvanda dahil, davranışsal koşulları karşısında nispeten istikrarlı ve uygulanabilir. Bu yüzden, bu yöntem, bireysel nöronlar ve sonuçta, tüm kortikal mikrodevre yeniden hayvan davranış sırasında hücre tipi özel aksiyon potansiyeli çapalama bağlama sağlar. Bu Video yazıda, juxtasomal yapılandırmada bireysel nöronların post hoc tanımlanması ve morfolojik yeniden inşası için üretan-anestezi sıçan biocytin ile etiketlenmiş nasıl göstermektedir.

Bireysel nöronların 3D yapısı hakkında detaylı bilgi nöronal ağların örgütsel ilkelerini aydınlatılması için çok önemlidir. Bizim yöntem ve böylece post hoc nöronal sınıflandırma ve dendritik ve yüksek çözünürlükte tek nöronların aksonal mimarisinin ayrıntılı yeniden izin, in vivo hazırlanmasında yüksek kaliteli biocytin etiketleme elde etmek için bir boru hattı içerir. Juxtasomal etiketleme kalitesine bağlı olarak, nöronlar soluk çok doğru bir şekilde kay?...

Watch this Scientific Journal Video about Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons at JoVE.com

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Nöronal ağların yapısını anlamak için, bireysel nöronların fonksiyonel ve morfolojik karakterizasyon bir zorunluluktur. Burada, juxtasomal biocytin dışı yapılandırmada elektrofizyolojik kayıtları etiketleme izin verir, ama hücre içi dendritik ve aksonal mimari post hoc yeniden için nöron etiket yeteneğini muhafaza göstermektedir.

Juxtasomal Biocytin Etiketleme Bireysel Kortikal nöronlar yapı-fonksiyon ilişkisi Çalışması için

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Görüntüleme.  VU University Amsterdam.  Nöronal ağların yapısını anlamak için, bireysel nöronların fonksiyonel ve morfolojik karakterizasyon bir zorunluluktur. Burada, juxtasomal biocytin dışı yapılandırmada elektrofizyolojik kayıtları etiketleme izin verir, ama hücre içi dendritik ve aksonal mimari post hoc yeniden için nöron etiket yeteneğini muhafaza göstermektedir. 

Video: Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Nörobilim

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...