Bu teknik, nöronlarda kalsiyum kullanımı hakkındaki anlayışımızı ve bölümlere ayrılmış kalsiyumun in vivo nöronal fonksiyon için önemli olan farklı mekanizmaları nasıl düzenleyebileceğini anlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, C.elegans'ta fizyolojik koşullar altında diğer floresan aletlerle kombine edilebilen daha yüksek çözünürlüklü hızlı in vivo görüntülemeye izin vermesidir. Bu teknik, birçok farklı bağlamda nöronlarda kalsiyum sinyallemesini düzenleyen mekanizma hakkında fikir verebilir.
Örneğin, yaşlanma, nöronal yaralanma ve nörodejenerasyon sırasında. Bu prosedürü gösteren araştırma teknisyeni Ennis Deihl olacaktır. Doktora adayı Kaz Knight ve laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Rachel Doser.
Bir promotör içeren ekspresyon vektörlerini klonlayarak başlayın, ardından bir kalsiyum göstergesi ve üç asal UTR tercih edin. Kalsiyum göstergesi transgenindeki kurtarma DNA'sı Lin-15 plus'ı içeren bir DNA karışımının bir günlük yetişkin C.elegans'ın gonadına mikroenjeksiyonu ile transgenik C.elegans suşları oluşturun. Enjekte edilen ebeveyn solucanları, F1 soyu yetişkinliğe ulaşana kadar 20 santigrat derecede tutun.
Multi-vulva fenotipinin yokluğunu tarayarak transgenik yetişkinleri seçin. Bu, kalsiyum göstergesini içeren ekstra kromozomal dizinin ekspresyonunu gösterir. Multi-vulva fenotipine sahip olmayan yetişkin F1 soyundan klonal olarak geçer.
Kalsiyum göstergesinin optimal bir ifadesi ile transgenik suşların sonraki nesilleri üzerinde deneyler yapın. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme yapabilen bir mikroskop kullanın. Solucanı düşük büyütme hedefi altında bulun ve ardından nöronları lokalize etmek için yüksek büyütme hedefine geçin.
50 FPS'den daha yüksek hızlarda hızlı görüntü yakalama yeteneğine sahip ultra hassas bir kamera kullanarak görüntüleri elde edin. Ardından, kalsiyum göstergesi için standart bir emisyon filtresi kullanın. 10 saniyeden uzun görüntü akışlarının elde edilmesi için bir Z-sürüklenme düzelticisi ekleyin.
13 x 100 milimetrelik bir cam kültür tüpünde, moleküler sınıf agar'ı M9 ve mikrodalgada birkaç saniye boyunca çözerek üç mililitre% 10 agar hazırlayın. Agar pedlerini yapmak için, önce iki kat laboratuvar bandı ekleyerek iki slayt hazırlayın. Ardından iki slaytın arasına bir mikroskop slaydı yerleştirin.
1000 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu kesin ve kapak slipinin ortasına küçük bir damla agar damlası pipetlemek için kullanın. Agarın üstüne başka bir slayt bastırarak agar'ı düzleştirin. Soğuduktan sonra, 10 mililitrelik bir tüpün açıklığını kullanarak agar'ı küçük bir diske kesin ve ardından çevreleyen agar'ı çıkarın.
Daha sonra, 30 milimolar bir stok oluşturmak için mussimol tozunu M9'da çözerek solucan haddeleme çözeltisini hazırlayın. Haddeleme çözeltisini yapmak için stoğu polistiren boncuklarla bire bir oranında seyreltin. Solucanı görüntüleme için konumlandırmak için, önce 1.6 mikrolitre haddeleme çözeltisini agar pedinin ortasına yerleştirin.
Daha sonra tercih edilen bir solucan toplama kullanarak, istenen yaştaki bir solucanı agar pedi üzerindeki yuvarlanma çözeltisine aktarın. Mussimolün solucan hareketini azaltması için yaklaşık beş dakika bekleyin ve ardından agar pedinin üzerine 22 x 22 milimetrelik bir kapak kayması bırakın. Ventral sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için, kapak kaymasını hafifçe kaydırarak solucanı yuvarlayın.
Solucanı mikroskopa monte etmek için, kapak kaymasına bir damla daldırma yağı yerleştirin. Parlak alanda düşük büyütme hedefi kullanarak solucanı bulun. Ardından 100x hedefine geçin ve 488 nanometre görüntüleme lazeri ile GCaMP veya mito GCaMP'nin aydınlatmasını kullanarak AVA nöritini bulun.
İn vivo GCaMP görüntüleme için, fesleğen GCaMP floresansı kameranın dinamik aralığının orta aralığında olana kadar görüntüleme lazerini alım ayarlarında ayarlayın ve pozlama süresini 20 milisaniyeye ayarlayın. AVA nöriti GCaMP floresan kullanılarak 100 kat büyütmede konumlandırıldıktan sonra, Z-sürüklenme düzelticisini ayarlayın ve sürekli otomatik netlemeyi başlatın. Görüntülemeden önce odak düzlemini gerektiği gibi manuel olarak düzeltin.
100 kat büyütmede bir görüntü akışı elde edin. Bu protokol kullanılarak, sitoplazmik kalsiyum yüksek temporal ve mekansal çözünürlükte ölçüldü. GCaMP6F'nin glutamaterjik AVA komutu internöronlarındaki hücreye özgü ekspresyonu, kalsiyum akışının yönlü bir yayılımını ortaya çıkardı.
GCaMP6F floresansının hücre altı nicelleştirilmesi, sadece 10 mikrometre uzaklıkta bulunan nöritin bir kısmında kalsiyum akışının başlangıcının geciktiğini göstermiştir. Ayrıca, AVA nöriti boyunca bulunan dendritik omurga benzeri yapılar, nörit aktivasyonundan bağımsız olarak meydana gelen ve kalsiyum akışının yayılmasına yol açmayan GCaMP6F floresansında parlamalar gösterdi. Ayrıca, nispi kalsiyum seviyeleri, mitokondriyal matris lokalize kalsiyum göstergesi mito GCaMP'nin AVA'ya özgü bir ifadesine sahip bir solucan suşu kullanılarak tek nöritlerdeki bireysel mitokondride ölçülmüştür.
Sonuçlar, nispeten büyük miktarda kalsiyumun mitokondrinin bir alt kümesine senkron alımını gösterdi. Spesifik olarak, bazı mitokondrilere kalsiyum alımı senkronize edilirken, komşu mitokondrinin kalsiyum aldığı görülmedi. Benzer şekilde, mitokondri alt kümeleri, az miktarda kalsiyumun hızlı alımını ve salınımını göstermiştir.
Bu aynı zamanda eşzamanlı görünüyordu, ancak sadece mitokondrinin bir alt kümesi için. Hız ve ince manipülasyonlar, hayvanları konumlandırmak ve nöronal fonksiyonu korumak için gereklidir. Hayvan sağlığı da her şeyden önemlidir.
Biraz açlık bile sorunludur. Öğrenmesi en zor kısım, hayvanların konfokal mikroskopi için zarar görmeden hızlı bir şekilde yönlendirilmesidir. Benim tavsiyem çok fazla pratik ve iyi kontroller.
Bu protokol, kalsiyumun nöronlardaki diğer hücre altı konumlarından, diğer nöronlardan veya C.elegans'taki nöronlar dışındaki hücrelerden salındığı deneylere uygulanabilir. C.elegans'taki bu yaklaşım hayvanları sağlam bıraktığından, tam bir sinir sisteminin tek nöronlarında in vivo olarak hücre altı kalsiyum kullanımının düzenlenmesi ile ilgili soruları ele almak mümkündür.
