The authors would like to acknowledge the CIHR for fellowship support of Steve Deimling and the Department of Paediatrics, University of Western Ontario for support of Steve Deimling, Rami Halabi and Stephanie Grover. This work was supported by the NSERC grant R2654A11 and an NSERC Discovery Accelerator Supplement

1. Embriyo Hazırlık <ol><li> Embriyo kültürü, pH 8.0 öncesinde tespit 8% 2.5 sistein kullanarak de-jöle embriyoların bir parçası olarak rutin yapılmadıysa. Kesinlikle gerekli olmasa da daha sonra elle ince forseps kullanarak önce tespite döllenme zarfı çıkarmak için, yararlıdır. <ol><li> Embriyo transferi için cam Pasteur pipetler kullanın. pipet embriyolar yani bir embriyo almak için yeterince geniş bir noktada cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın aktarmak için yeterince geniş değil. Hızlı keskin kenarları eritmek için bir Bunsen beki alevi ile kesme ucu geçirerek kestikten sonra pipetler keskin kenarları ortadan kaldırmak. NOT: Bakım görsel muayene ile soğutulan görünüyor olsa cam hala yanıklara neden olabilecek kadar sıcak olabilir gibi, alınması gerekiyor. </li></ol></li><li> Aşamalarında embriyo tespiti gerçekleştirin. İlk olarak, embriyo tespit kullanılmak üzere cam gibi tüp hazırlanır. Finalde dahil olmak üzere tüm adımlar için bu şişeleri kullanınDepolama. Sürecin her aşamasında embriyoların izlenmesi için izin kapaklı iyi bir teflon conta ile açık şişeleri kullanın. Kalıcı bir kalem kullanarak uygun deneysel bilgilerle şişeleri Etiket ve hatta kalıcı işaretleyici nedeniyle alkol ve diğer çözücülerin kullanımı prosedürü boyunca kaybolur gibi, sonra şeffaf bir bantla etiketi kapsar. <ol><li> Embriyoların düzeltmek için Mempfa kullanın. Bir seferde 50-100 ml gruplar halinde% 8 paraformaldehit bir stok yapın. Çözelti içine paraformaldehid elde etmek için gerekli olan, 50-60 ° C, gerekli H2O ve ısı yaklaşık 75% kullanın. Not: Bu çözüm formaldehit yerine paraformaldehid kullanır ki Memfa eski yayınlanmış protokol sürümlerinde kullanılan biraz daha farklıdır. </li><li> 10N NaOH 2-3 damla ekleyin veya pH kadar 7.5 (pH kontrol etmek kullanım pH kağıdı) yaklaşık. Paraformaldehyde çok zehirli, bu nedenle bir davlumbaz stok çözüm üretmek. Para kezformaldehid çözeltisi içinde yeni bir kap içine Whatman kağıt içinden çözelti filtre edilir ve nihai hacme O H2 eklenir. Gerekirse, 1-2 hafta boyunca 4 ° C &#39;de paraformaldehit çözeltisi saklayın. </li><li> Mempfa sabitleme çözeltisi (Tablo 1) geri kalan bileşenlerin monte edin. Paraformaldehid nihai çalışma konsantrasyonu% 4 olduğundan emin olun. Stoklar olarak 4 ° C &#39;de sabitleme çözeltisi tüm bileşenleri saklayın. </li><li> Bir kesim cam pipet kullanarak, Mempfa solüsyonu (Tablo 1) yaklaşık 3-4 ml ile dolu olan etiketli cam şişelere embriyolar ekleyerek embriyolar düzeltmek. Vialde fazla 20-30 embriyo tespit kaçının. Embriyo ortamından sıvı transferi minimum embriyolar ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de Mempfa çözeltisi embriyolar düzeltildi. </li><li> Geç endoderm yapılar için elle izole bağırsak ve endoderm türevleri 9,10 üzerinde situs gerçekleştirmekProbun iyi nüfuz etmesi için izin verir ve aynı zamanda kavite boyama kaçınan. </li><li> -20 ° C&#39;de% 100 metanol ihtiva eden bir çözelti saklayın. Paraformaldehit tespit edildikten sonra, yaklaşık 4 ml -20 ° C, embriyo depolanması için% 100 metanol ile Mempfa çözeltisi değiştirin. </li><li> Cam veya diğer embriyolar yapışmasını embriyolar önlemek için metanol ilave edildikten sonra şişeleri çalkalanır. Ayrıca, gevşek ise metanol zamanla dondurucuda buharlaşması nedeniyle flakon sıkıca kapatılmış olduğundan emin olun. Not: Embriyolar in situ hibridizasyon kalite kaybı ile boyanmadan önce metanol içinde, muhtemelen daha az bir yıl için depolanmıştır ve üzerinde olabilir. </li></ol></li></ol> 2. Probe Hazırlık <ol><li> Digoksigenin-işaretli problar için şablon DNA 1-2 ug kullanın. Bir sınırlama ile, ilgi konusu genin 5 &#39;ucunda uygun bir DNA dizisini ihtiva eden kesik plazmid tha için uygun enzimT vektörü antisens sondaları oluşturulur. Not: Plazmid uygun bir RNA polimeraz bağlama bölgesi (örneğin, T7, T3, veya SP6) olması gerekir. </li><li> DNA, su, NTP prob sentez reaksiyonu monte edilmeden önce oda sıcaklığına kadar ısınmaya karıştırmak ve polimeraz tamponu izin verir. Tablo 2&#39;de listelenen sırada, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü RNA sentezi, reaksiyon bileşenlerini ekleyin. Su seviyesini ayarlama 20 ul prob sentez reaksiyonunun toplam hacmi getirmek ekledi. Polimeraz tampona bileşenleri yüksek konsantrasyonlarda ve soğuk hedef DNA zaman uyarabileceği reaksiyon oda sıcaklığında bir araya getirin. </li><li> 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca transkripsiyon reaksiyonu inkübe edin. NOT: biraz daha uzun iki saatten İnkübasyonlar hiçbir yan etkilere yol açar, ama aynı zamanda çok az verim artışı göstermektedir. Bir saat süre ile kuluçkalanmıştır ise, verim yine de iyi bir prob için yeterli indirgenmiş fakat edilecektir. <ol><li> Bitirmek için transkripsiyon reaksiyonu için beklerken, prob kalitesini test etmek için kullanılacak bir agaroz jeli tercih. 1x TAE tamponda 100 ml agaroz 1 ug Erime kaynama noktası, çözeltinin ısıtılması (Tablo 1 e bakınız). Agaroz toz tamamen çözülene zaman ısı çözüm çıkarın. </li><li> Agaroz ultraviyole (UV) ışık altında RNA görüntülenmesine olanak vermek üzere yaklaşık 60 ° C&#39;ye soğuduğunda agaroz jeli, yaklaşık 100 ml 2 ul etidyum bromür stok solüsyonu (10 mg / ml) ilave et. Not: gelecek jeller tekrar eritmeden dökülebilir, böylece bu agaroz jel çözeltisi, 60 ° C&#39;lik bir kuluçka makinesi içinde tutulabilir. Nedeniyle potansiyel toksisite etidyum bromür ele dikkatli olun. </li></ol></li><li> Şablon DNA ortadan kaldırmak için 37 ° C&#39;de bir 10 dakika daha 2 saat inkübasyondan sonra, transkripsiyon reaksiyonu 1 ul DNaseI (RNAse serbest derece) ilave edilir ve inkübe edilir. </li><li> Reaksiyon karışımı 1 ul çıkarınTE tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA), 5M NH4 Asetat 10 ul ve 220 ​​ul% 1 SDS ve 80 ul% 1 agaroz-TAE jel üzerinde ve geri kalan (20 ul), kontrol soğuk etanol. Vortex karışımı şiddetle ve RNA kalite kontrol sonuçları bilinmektedir kadar buz üzerinde bir kenara. <ol><li> % 1 agaroz-TAE jel üzerinde çökeltme işleminden önce çıkarılması RNA&#39;nın 1 ul çalıştırın. Jel üzerinde yüklenmesini kolaylaştırmak için su, 4-5 | il ve RNA standart yükleme boyası 1 ul ekle. (Tartışma) prob kalitesini kontrol etmek için bir UV ışık transilluminator&#39;de kullanılarak jel üzerinde RNA görüntüleyin. </li></ol></li><li> 10-15 dakika süre ile tam hızda bir mikrosantrfuj eğirme adım 2.5 buz üzerinde bir kenara geri kalan RNA çökeltilmesi. Bir çizilmiş cam pipet ile süpernatant kapalı çizin ve kısaca kurumasını bekleyin. <ol><li> Eppendorf tüpü içinde RNA melezleme, 1 ml tampon (Tablo 1) ile prob yeniden süspanse edin. Girdap ve briefly tekrar 37 ° C ve girdaba boruyu ısı. 15 ml kap polistiren tüp vida bir prob çözüm aktarın ve RNA hibridizasyon tamponu ile 7-10 ml doldurun. Not: Prob (10 kat daha fazla seyreltme hala iş görebilir) genellikle düşük bir arka plana neden ancak boyama reaksiyonlar da daha uzun sürer daha seyreltilebilir. </li></ol></li></ol> In situ Hibridizasyon 3. <ol><li> -20 ° C&#39;de metanol içinde depolanmıştır embriyolar alın ve oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verildi. Cam şişeler içinde tüm prosedürü uygulayın. Bir grup farklı embriyolar farklı prob tarafından baktı olacak olursa, sondalar ilk gününde değişkenliği ve emek azaltmak için eklenir hemen önce kadar bir tek şişede saklayın. <ol><li> Prob ilave hazırlık Tablo 3 (yıkama tarifleri için bakınız Tablo 1) de tarif edilen bir metanol dizi embriyolar rehidrate. Yavaşça Embry girdapHer değişiklikten sonra os onlar tarafta veya birbirlerine yapışmasını değil emin, ve bir nutator şişeleri montaj embriyolar rock. Sıvıları aktarırken, embriyolar orada sıkışıp değil emin olmak için kapaklar içini kontrol edin. </li><li> Tablo 3&#39;te tarif edildiği gibi prob çözeltisi içinde bir kez, bir gece boyunca embriyolar hibridize olur. </li></ol></li><li> Prob çözüm çıkarın. 15 ml saklayarak kullanılan prob kaydet -20 ° C&#39;de tarih ve prob kullanılmıştır kaç kez ile işaretlenmiş kap polistiren tüp, vida. NOT: kolorimetrik reaksiyonlar istenilen yoğunluğu ulaşmak için anormal uzun zaman almaya başlayana kadar aynı prob yerinde döllemeler sonraki birçok kez tekrar edilebilir. <ol><li> Prob çıkarıldıktan sonra, Tablo 4&#39;te açıklanan yıkama dizi prob karşı antikor lekelemesi için embriyolar hazırlayın. Sıcaklık değiştirme t hareket ettirerek (Tablo 4) gerektiğindedoğrudan uygun sıcaklığa ayarlanır melezleme fırınlarına bağlı embriyoların şişeleri ile o nutator. </li><li> MAB uygun hacimde Makyaj + HTSS + br + embriyolar antikor ilave edilmeden önce bloke olmasına neden olur + HTSS + br bloke etme çözeltisi MAB inkübe edilmektedir, o zaman, anti-Dig antikoru (Tablo 4) embriyolar. Kullanım gününde engelleme çözümleri taze olun. </li></ol></li><li> Antikor çözeltisini çıkarın ve antikor ile gece boyu inkübasyondan aşağıdaki Tablo 5&#39;te belirtildiği gibi yıkama başlar. Alkalin fosfataz alt-tabaka ile boyama için hazırlama ve mümkün olduğu kadar arka planı azaltmak için en az on iki 30 dakika yıkama yapın. Yıkama adımları için, MAB tampon veya TBT çözeltisi (Tablo 1) kullanın. NOT: TBT çözümü 2 mg olan TTW olduğunu / BSA ml. <ol><li> BM Mor alkalen fosfataz substrat ile son yıkama solüsyonu değiştirin. Boyama REAC gerçekleştirinOda sıcaklığında veya 37 ° C ya da manda. Not: Boyama 37 ° C&#39;de daha hızlıdır, ancak, gece boyunca bırakılırsa, kabul edilemez arka plan renklenmesi genellikle bir sonucu olabilir. boyama reaksiyonları genellikle gecede boyama gerektirir ve oda sıcaklığı bunun için güvenli olduğunu. </li><li> Daha fazla boyama gereklidir ve BM mor çözüm mavi renk alıyorsa, taze BM Purple ile boyama çözüm yerine ve 37 ° C içine tüpleri koymak. Hedef mRNA&#39;nın çok bol ise, bir gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta boyama çözeltisi embriyolar koymak ve daha sonra oda sıcaklığına embriyolar hareket ya da 37 ° C boyama reaksiyonu daha iyi kontrol edilmesi izin verir. </li><li> Nihai sonuç için zaman farklı hedef RNA&#39;lar arasında önemli farklılıklar gibi, dikkatle yeni reaksiyonları izleyin. Tutarlılık için, daha uzun inkübasyon ile ortaya çıkan ifade yeni siteler varken (3.4 bakınız) boyama reaksiyonu durdurmak. Önemli bir şekilde, in situ hibridizasyon, eğer bir test olarak kullanılmaktadırFarklı tedavi grupları şu an deneyleri için, deney ve kontrol embriyoları arasındaki renk reaksiyonları için aynı zamanda kullanılır. </li></ol></li><li> Boyama reaksiyonu durdurun ve Tablo 6&#39;da belirtildiği gibi sıvıları değiştirerek depolama ve görüntü kaydı için embriyolar hazırlayın. Leke çıkarma embriyoların yaklaşık metanol mor renk olarak görünür, çünkü bu aşamada embriyolar kaya vermeyin. Not: Bu, ağır arka plan veya oyuk lekeleme çıkarmak için yeterli değildir, ancak sık sık embriyolar, boyama çözeltisi ve en azından kısmen bu kaldırmak soğuk metanolden açık mavi lekelenme mevcuttur. Soğuk metanol ile -20 ° C dondurucu içinde muhafaza edilir, metanol anlamına gelir. <ol><li> Embriyoların rehydrate ve Mempfa (Tablo 6) ile lekeyi düzeltmek. Sabit bir kez, Mempfa kaldırmak ve% 25 metanol ile embriyolar yıkayın. </li><li> % 25 metanol çıkartın ve ağartma çözeltisi ilave endojen pigment gidermegereklidir. Yanıklara neden olabilir ağartma çözümü ele dikkatli olun. Nispeten hızlı olur ve beyazlatma derecesi farklı etkileri (Şekil 2) için değiştirilebilir yakından beyazlatma gözlemleyin. </li><li> Ağartma sonrası uzun süreli depolama için% 100 metanol ile bir metanol dizi embriyolar kurutmak, ya da kısa süreli depolama ve daha sonra görüntüleme için PBS&#39;ye transferi (bakınız Tablo 6). </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme Embriyolar <ol><li> Bir embriyo boyama işlemi tamamlandıktan sonra, görüntü embriyo ilgi gen ifade nerede bilgi daha geniş bir kitleye yakalanan böylece. Temizlenmemiş embriyolar görüntülemek için bir arka plan olarak agaroz% 1 kullanın. NOT: Agaroz embriyo ve boyama reaksiyonu mavi renk ile de tezat bir mavi / gri arka plan verir. Aynı zamanda rahatsız edici gölgeler ve embriyo dikkatini başka yöne yansımaları yaygın yardımcı olur. <ol><li> Suya agaroz ekleyin ve agaroz çözeltisi içinde kalıncaya kadar kaynatın ve sonra petri içine dökülmeden önce 50 soğumaya bırakın. TAE jeli çözeltisi gibi, birden fazla kullanım için 55 ° C inkübatör agaroz çözeltisi saklayın. Petri kabına yaklaşık 2 mm&#39;lik bir derinliğe kadar agaroz dökün. Gerekirse, arka plan biraz farklı gölge elde etmek agaroz derinliğini ayarlayın. </li><li> Sulu bir çözeltisi (PBS veya ttw) metanol içinde depolama rehidrasyon sonra, bir metanol dizi kullanılarak, (bakınız Tablo 6) agaroz baz ile bir petri tabağına embriyolar yerleştirin. Temiz bir çözüm tutun ve gerekirse, iyi görüntülerin temiz arka plan bozabilir küçük partiküler madde ortadan kaldırmak için basit filtreleme kullanın. </li><li> Görüntü gibi ventral taraftan gibi alternatif görünümler, gelen embriyolar, Şekil 3 ince forseps kullanarak embriyo sığacak ve (yönlendirme için bu kanallarda embriyolar yerleştirmek için agaroz ince kanallar kesmek </strong&gt;). Kolayca zarar olarak embriyolar manipüle özen gösterin. NOT: Çoğu aşamaları çözeltide yerleştirilen zaman varsayalım karakteristik bir konuma sahip. Örneğin, blastula aşamalı embriyolar hayvan yan yukarı oturup eğilimindedir. Embriyolar uzatmak için başladığınızda, onların yan yattı. </li></ol></li><li> Görüntüye derinlik sağlayan embriyo üzerinde gölgeler oluşturarak, sığ bir açıdan embriyo aydınlatmak ve yüzey yapılarını ayırt yardımcı olmak için fiber optik ışık kaynağı kullanın. Ağartma yararlı yerlerinden sağlayan pigment, ortadan Çünkü güçlü ağartılmış embriyolar için gölgeleme kullanın. </li><li> Böyle beynin, (Şekil 4) Notokordun, akciğer, veya bölgelerde olduğu gibi, derin embriyonun içinde görüntü boyama embriyolar temizleyin. Bunu gerçekleştirmek için,% 100 metanol kadar metanol dizi embriyolar koydu. <ol><li> Metanol içinde tam daldırma sonra, çözelti, bir kısım benzil alkol embriyo transferi ve iki bölüm benzil olamaznzoate (BABB). embriyolar başlangıçta yüzeyde yüzer ancak metanol Babb ile karışır gibi, onlar Babb içine batar. Cam şişeler veya yemekler Babb ile ilgili her adımı gerçekleştirin; BABB herhangi bir plastik veya boya eriyecek. </li><li> Bir kez, temizlenmiş embriyodan altına gelen iletilen ışık embriyolar görüntüleyin. Kontrastı artırmak ve en iyi renk sağlamak için aşağıdaki ışık yoğunluğunu yanı sıra açısını ayarlayın. </li><li> Görüntüleme temizlenir embriyolar baz kapalı cam petri yükseltmek zaman. Sadece embriyolar ile çanak bölgesi yükselir, böylece onu yükseltmek için diğer iki petri kapakları kullanarak yapın. NOT: Bu odak dışında tabanını alarak ve görüntü ile müdahale edebilir mikroskop baz kusurlar veya lekeleri rahatsız edici etkilerinin ortadan kaldırılması avantajına sahiptir. </li></ol></li></ol> 5. Çift İn situ Hibridizasyon <ol><li> Aynı anda tw ifade desenini görüntülemek içinTek bir embriyo farklı genler o iki prob farklı genlerin her biri için bir sentez. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir etiket olarak DIG-11-UTP ile bir prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin. <ol><li> DIG DIG 11-UTP ile ikame edilmesi gerektiğini floresein-12-UTP dışında problanmış etiketli için izlenen aynı protokol ile ilgili diğer prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin. </li><li> 1: 1 oranında iki konsantre probları karıştırın. En iyi sonuçları elde etmek için in situ hibridizasyon protokol tek güçlü ifadesini gösterir geni için, floresein-işaretli prob kullanılır. </li></ol></li><li> In situ hibridizasyon protokolü aynı için &lt;yerinde tek için tarif edilen/ Em&gt; hibridizasyonları, çift prob kullanımı dışında in situ hibridizasyon probu tek yerine ilk günün sonunda (etiketli-digoxigenin ve floresan işaretli prob 1.5x konsantre karışımı içeren prob). <ol><li> Anti-DIP-AP Fab fragmanları yerine 4,000 seyreltme ile 1: Anti-florosin AP Fab fragmanları hariç, in situ hibridizasyon protokolü çift ikinci gününde tek melezleştirme protokolü takip edin. Yerinde protokolünde single olarak embriyo aşırı antikor yıkayın ve BM-Mor AP substratı kullanılarak ilk renkli reaksiyonu yürütmek. </li></ol></li><li> İlk renk reaksiyonundan sonra, 0.1 M glisin pH MAB beş ila on dakika yıkama yapılmıştır 2.0 40 dk için floresein antikor etkisiz hale getirirler. 90 dakika için MAB + HTSS + BR embriyolar engelleyin. 1 anti-DIG antikoru ekleyin: MAB + HTSS + br 2000 seyreltme ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. <ol><li> Ertesi gün, inci embriyolar yıkayınoroughly MAB (30 dakika 12 yıkama) aşırı antikorları ayıklamak için. </li><li> AP Tamponu içinde 10 dakika (tablo 1) için embriyolar yıkayın ve BCIP (AP tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile boyanır. NOT: Yerinde birlikte ilk renkli reaksiyon ve ikinci (Şekil 5) için bir açık mavi renk reaksiyonu için bir koyu mavi-mor leke vermelidir. </li><li> AP tampon kaldırarak nihai renk reaksiyonu durdurmak ve MAB ile üç kez yıkayın. 10 dakika boyunca Mempfa ile embriyolar Fix. MAB veya TBT 5 hızlı yıkama ile embriyolar yıkayın. </li><li> O BCIP yalnız renk ortadan kaldıracak gibi bu renk kombinasyonu ile, sonrası boyama işlemlerinde metanol kullanımı, artık mümkün. % 0.02 sodyum azid ile PBS içinde boyama ve tespit sonrası embriyolar saklayın. Boyama yoğunluğu situs çift zayıf olabilir. Bu bir sorun ise, dört 2 saat süre her yıkar azaltır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo.">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li><li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor,+p27Xic1.">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration,+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis.">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2.">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li><li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm.">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li><li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus.">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression.">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li><li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos.">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum.">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+(Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum).">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li><li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis.">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li><li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus.">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li><li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo:+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis.">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li><li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+pronephric+development.">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li><li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNkx-2.5,+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman:+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development.">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li><li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis.">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li><li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination.">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li></ol>

Authors have no competing financial interests to disclose.

Belirli genlerin ifade desen görselleştirmek için in situ hibridizasyon kullanma yeteneği Xenopus embriyo belirli organları veya hücre tiplerini belirlemek için en sık kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni, bu teknik ile sunulan çeşitli avantajlar taşımaktadır. Bir genin ekspresyonu, bu hücrelere 18 arasında açık bir sınır önce kalp atalarda Nkx2.5 ekspresyonu için halinde de farklılaşma herhangi bir histolojik işareti önce belirli yapıl...

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own 1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established 4. Our protocol is a streamlined version of the original protocol 4 that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines. 
In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo 5. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains 6,7. 
The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="557">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:304px;">Name of the reagent or equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labguake Tube Shakers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>17-08-2011</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">VWR Vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10-07-2012</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">L-Cysteine</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>CYS342.500</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11209256910</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Rnase inhibator (Rnase OUT)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>10777-019</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EPO111</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EPO101</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EPO131</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Dnase 1</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18047-019</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Sheep Serum</td>
			<td>&#160;Wisent</td>
			<td>31150</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Blocking reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">BM purple Ap Substrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442094001</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAMX0485-7</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">NaCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD002.10</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">SDS</td>
			<td>EM&#160;</td>
			<td>7910</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT001.500</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS003.5</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Tween-20</td>
			<td>EM&#160;</td>
			<td>9480</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2643</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Mops</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MOP001.250</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3889-25G</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>PAR070.500&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Formamide</td>
			<td>&#160;VWR&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CAFX0420-4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">RNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109223001</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Maleic Acid</td>
			<td>&#160;VWR&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CAMX0100-3</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">tri-Sodium Citrate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>CIT001</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Hydrogen Peroxide (30% Solution)</td>
			<td>EM&#160;</td>
			<td>HX0635-2</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.100</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">PVP-40</td>
			<td>ICN</td>
			<td>195451</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Ficoll 400</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0300-10</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-1042</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6630</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>16500-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

understanding early organogenesis using a simplified in situ hybridization protocol in xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Doku spesifik probların kullanımı belirli organların gelişim durumuna ilişkin olağanüstü bilgi verebilir. Aşağıdaki örneklerde, embriyonun sahne Nieuwkoop ve Faber evreleme masaya 11 dayanmaktadır. Bir sondalar formu farklılaşma sonra genlerin, evre 28-30 ben kalp troponin, örneğin, (Şekil 1C), farklılaşmış bir organın varlığını veya boyutunu kullanıyorsa herhangi bir aşama sonrası farklılaşma de değerlendirilebilir. Yıllar önce, embriyolog, erken ...

Watch this Scientific Journal Video about Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus at JoVE.com

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

understanding-early-organogenesis-using-simplified-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

38.9K Görüntüleme.  Hospital for Sick Children. The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Video: Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Gelişim Biyolojisi

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...