In situ protokolümüz önemlidir çünkü gen ekspresyonu desenlerini en az arka plan boyama ile görselleştirmenin basit bir yolunu sağlar. Bu teknik, karmaşık ve uzun bir protokolün gerçekleştirilmesini nispeten kolaylaştırır. Benchtop, bu protokolün doğru şekilde gerçekleştirilip yeniden oluşturulmasını kolaylaştıran öneriler ve denetim listeleri ayarlayın.
Burada gösterilen teknikler Astyanax mexicanus'a özgü olsa da, protokole küçük ayarlamalar yapılan, nispeten büyük boyutlu bireylerin diğer sistemlerine adapte edilebilir. İlk olarak, her gen için şişe ve pipetler belirlemek için renkli laboratuvar bandı kullanın. Pasteur pipeti kullanarak embriyoları sıralayın.
Şişe başına genellikle en fazla 12 embriyo vardır. Sonra, 70 santigrat derece bir sallayarak su banyosu ayarlayın. Dikkatle sıralanmış embriyoların şişeleri metanol dışarı çekmek ve taze% 100 metanol 500 mikrolitre ile değiştirin.
Bir platform shaker üzerinde yaklaşık bir dakika için embriyolar kısa bir süre yıkayın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi bir platform shaker üzerinde Tween 20 ile 1x PBS artan konsantrasyonda embriyolar rehydrate. Başlamak için, 70 santigrat derece önceden ısıtılmış olan dönen su banyosu içine bir örgü alt küçük bir conta yerleştirin.
Conta içine hibridizasyon tampon eksi ve hibridizasyon tampon artı aliquots yerleştirin. Tüm dokuların tamamen çözeltiyle kaplı olmasını sağlayan embriyo şişelerine hazırlanmış bir PK çözeltisi ekleyin. Şişeleri bir platform çalkalayıcıya aktarın ve proteinaz K çalışma çözeltisinde yaklaşık 12 dakika sindirin.
Bundan sonra, pk çözeltisini yavaşça çekin ve kalan PK'yı seyreltmek için şişeyi PBT ile birlikte kısa bir süreliğine sulayın. PBT çözeltisini 500 mikrolitre taze PBT ile değiştirin ve çözeltinin platform çalkalayıcısında beş dakika durulanmasına izin verin. Daha sonra PBT çözeltisini 500 mikrolitre çözülmüş %4 PFA ile değiştirin. Embriyolar 20 dakika oda sıcaklığında platform shaker üzerinde kuluçka yaslayın.
Ön hibridizasyona başlamak için, embriyo içeren şişelere 500 mikrolitre önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon eksi çözeltisi ekleyin. Beş dakika boyunca sallayarak olmadan 70 santigrat derece su banyosunda conta içine şişeleri dikkatlice yerleştirin. Sonraki hibridizasyon tampon eksi çözüm kapalı çekmek ve önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon artı çözüm 500 mikrolitre ile şişeleri sel.
Su banyosunda conta içine şişeleri geri yerleştirin ve dört saat ya da bir gecede sallayarak kuluçka. Hibridizasyon abaşlamak için, şişeler dışında hibridizasyon tampon artı çizmek ve taze önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon artı 500 mikrolitre ile değiştirin. Her şişeye iki mikrolitre RNA sondası ekleyin ve sondanın eşit dağılımını sağlamak için yavaşça girdap layın.
40 RPM sallayarak bir gecede 70 santigrat derece su banyosunda kuluçka. Başlamak için, mikrosantrifüj tüpleri hibridizasyon tampon artı ilgi RNA prob geni ile metin protokolünde belirtildiği gibi etiketli hazırlamak. İki adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve 0,2 gram bloke reaktifi ve 10 mililitre MABT ekleyin.
Reaktif çözeltide tamamen eriyene kadar her iki tüpü de bir besleyici mikser üzerine yerleştirin. Bir cam Pasteur pipet kullanarak hibridizasyon tampon artı ve prob çözeltisi çizmek ve steril etiketli mikrosantrifüj tüp içine yerleştirin. Bu tüpü ileride kullanılmak üzere eksi 20 derecede dondurucuda saklayın.
Dikkatle sıcak tuzlu sodyum sitrat ve hibridizasyon tampon eksi seyreltme 500 mikrolitre ekleyin. Her biri sallayarak su banyosunda 10'er dakika sıralı çözeltiler halinde kuluçkaya yatırın ve metin protokolünde belirtildiği gibi bir platform çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında. Son kuluçkadan sonra, her şişedeki %100 PBT'yi 500 mikrolitre MABT ile değiştirin.
Bu işlemi her biri beş dakika boyunca iki kez tekrarlayın. İlk olarak, her şişeden MABT çıkarın ve 15 mililitrelik konik tüpler birinden önceden karışık engelleme çözeltisi ile sel. Oda sıcaklığında dört saat boyunca besleyici karıştırıcı üzerine her iki şişe yerleştirin.
Hazırlanan bloklama çözeltisi ve kısaca girdap ikinci tüp antikor parçaları iki mikrolitre ekleyin. Sonra engelleme çözeltisi ile neredeyse tamamen her şişe doldurun ve dört derece santigrat bir buzdolabında bir gecede bir nutating karıştırıcı üzerine yerleştirin. Başlamak için, MABT%10 NGS'lik bir stok şişesi hazırlayın.
Her şişedeki engelleme çözeltisini bu NGS çözeltisinin 500 mikrolitresi ile değiştirin. Platform shaker oda sıcaklığında 25 dakika kuluçka. Bundan sonra NGS karışımını %100 MABT'nin 500 mikrolitresiyle değiştirin.
30 dakika boyunca oda sıcaklığında platform shaker incubate. Bu durulayın 11 gün boyunca, her 30 dakikada bir daha. Sonra% 100 MABT ile her şişe doldurun ve dört derece santigrat bir buzdolabında bir gecede bir besleyici karıştırıcı üzerine yerleştirin.
İlk olarak, her şişedeki MABT'yi bir mililitre AP tamponuyla değiştirin ve beş dakika boyunca yıkamasına izin verin. MABT'yi tamamen kaldırmak için bu yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra AP tamponu, 3,5 mikrolitre BCIP ve 4,5 mikrolitre MBT içeren bir mililitre taze AP tamponu ile değiştirin.
Reaksiyon tamamlanana kadar her saat başı BCIP ve MBT içeren yeni bir AP tampon karışımı yla değiştirin, reaksiyonu yakından izlediğinden ve istenilen boyama düzeyielde edilene kadar her 15 dakikada bir kontrol ettiğinizden emin olun. Protokolde belirtildiği gibi AP tamponunda 1X PBT konsantrasyonu artan bir konsantrasyonda embriyoları durulayarak renklenme reaksiyonunu durdurun. İstenilen minimum arka plan boyama ulaşına kadar bir besleyici karıştırıcı üzerinde yaklaşık beş mililitre% 100 PBT embriyolar durular.
Durulama tamamlandığında, embriyoları 500 mikrolitre steril PBS'de bir platform çalkalayıcı üzerinde yıkayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi örnekleri postfix. Embriyoları duruladıktan sonra, %100 steril PBS'nin dört mililitreye yerleştirin ve gerekirse uzun süreli olarak dört santigrat derecede saklayın. Bu çalışmada embriyonik Astyanax örnekleri yüksek kaliteli gen ekspresyonu analizi için etiketlenmiştir.
Bu süreç hem Pachon mağara balığı hem de yüzey balığı embriyolarında başarıyla uygulanmıştır. Sox9 ekspresyonu için etiketlenmiş mağara balığı embriyoları, gelişmekte olan dalsal kemerlerde ve pektoral yüzgeçlerde açık etiketleme göstermektedir. Boyama nın sarısı kesesinde veya yan tarafta gelişen somitlerde neredeyse yok olduğunu unutmayın.
Benzer şekilde, Tfap2a ekspresyonu embriyonun dorsal böğür bölgesi boyunca erken göç nöral krest hücreleri olarak gelişmekte olan baş ın bölümlerinde belirgindir. Mağara balığı embriyoları phf20a için sunulan üçüncü gen, kemik dokusuna yol açan somatik mezoderm ve posterior baş bölümlerinde görülür. CXCR için etiketlenmiş yüzey balık embriyoları baş ve kanadın izole bölgelerinde pozitif etiketleme göstermek, yanı sıra sarısı kesesini örten birkaç bireysel hücreler.
Adcyap1a geni hipofiz hücreleri de dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin bölgelerinde ifade edilir. Embriyonun dorsal yönü üzerinde eşleştirilmiş hücre çiftleri içinde yüksek özgüifade, hem de orta hat ifade daha büyük bir bölge unutmayın. Mağara balığı embriyoları için incelenen son gen olan Sox10, dorsal embriyonun sol ve sağ taraflarında nöral tepenin erken bir belirteci olarak belirgindir.
Situ'u tamamladıktan sonra, genellikle Sonuçlarımızı ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyiz. Boyama bozulmasını önlemek için tamamlanmasından sonra iki hafta içinde bunu yapmak en iyisidir.
