1. Standart Çalışma Protokolü 1.1 Cihaz Kurulumu ve Numune Hazırlama <ol><li> Yüklü Izon Kontrol Suite yazılımı ile bir bilgisayara aleti bağlayın. </li><li> - Veya NP200 (hedef boyutu aralığı: 100 - 400 nm) en sık kullanılan bir NP150 (300 nm hedef boyut aralığı 85) EVs büyüklüğü ve konsantrasyon ölçümü için: kullanmak için nanopore boyut seçin. Bir 220 nm filtre boyunca geçirerek, numunenin, örneğin daha büyük bir EVs çıkarılmasını içeren bir protokol kullanılarak izole edilmiştir EVs çalışırken, bir NP100 gözenek (hedef boyut aralığı 70-200 nm) kullanılabilir. Bir biyolojik numunede EVs veya farklı protokolü kullanılarak izole EVs çalışırken daha az sıklıkla tıkanma gibi, NP200 kullanılabilir. Veya NP400 (hedef boyut aralığı 200-800 nm), örneğin - NP300 (600 nm hedef boyut aralığı 150) gibi diğer Nanopores ya da daha büyük olan nano-gözeneklerde, EVs büyük türleri için de kullanılabilir. </li><li> Polistiren KALİBR seçinAdım 1.1.2 seçilen Nanopore tamamlayacak tirme parçacıklar. Bir NP100 için, NP150 ve küçük gözenek NP200 sırasıyla CPC100, CPC200 ve CP100 parçacıkları kullanır. Doğru boyutlu tahmin için, kalibrasyon parçacıklar bilinmeyen parçacıklar gibi, benzer bir boyuta sahip olduğundan emin olun. </li><li> Kalibrasyon parçacıkların homojenlik, vorteks kısaca (30 sn) sağlamak. İsteğe bağlı olarak, agregatları uzaklaştırmak için sonikasyon uygulanır. </li><li> En az 40 ul lik bir hacim içinde, hedef konsantrasyona PBS içinde seyreltin kalibrasyon parçacıkları. Not: Hedef konsantrasyon adımda 1.1.2 seçilen nanopore göre değişir. Hedef konsantrasyonları nanopores birlikte verilir. </li><li> Uygula ve doğrudan alt sıvı hücre PBS 78 ul kaldırmak; nanopore konumda olduğunda alt sıvı elektrolit hücreye bir uygularken alt sıvı hücrenin bu nemlendirme nano-gözeneklere altındaki hava kabarcıklarının oluşması riskini azaltır. </li><li> Aletin 4 kolları üzerine Nanopore yerleştirin. Kullanımdijital kumpas iki zıt kolları arasındaki mesafeyi ölçmek ve &quot;Stretch&quot; girdi alanına mm mesafe girin ve nanopore streç kalibre etmek &quot;streç kalibre&quot; tıklatın. </li><li> Alt sıvı hücreye 78 ul PBS yeniden uygulanması öncesinde, cihazın karşıt kolların arasındaki mesafeyi arttırarak, böylece yan çarkı açıp kapatarak, 47 mm Nanopore gerin. Not: Elektrik paraziti önemli ölçüde ölçümlerin kalitesini etkileyebilir. Izon Kontrol Suite yazılımını çalıştırmak için bir dizüstü bilgisayar kullanırken, dizüstü bilgisayar, bir topraklı priz ve fişi kullanarak şebekeye bağlı olduğundan emin olun. Cep telefonları da elektrik girişim bir kaynak olabilir yakın enstrüman tuttu. Elektrik parazit çoğunlukla kök kare (RMS) ses&gt; 10 pA Yani, temel akımı sürekli tekrarlanan zirveleri olarak görülmektedir. Not: Hemen hemen herhangi bir tampon tRPS characteri kalibrasyon parçacıklar ve EVs seyreltmek için kullanılabilenkıymetleştirme. Tuzların varlığı, bir elektrik akımının kurulması için bir ön koşuldur. EV ölçümleri için, bir tampon madde olarak PBS kullanın. EVs doğru şekilde sağlamak üzere kalibrasyon parçacıkların her zaman aynı tampon içinde seyreltilmelidir. </li></ol> 1.2. Ölçüm için Optimal Settings belirleyin Not: Kayıttan önce, optimal ölçüm ayarlarını kurmak için önemlidir. Nano-gözeneklere geçen bir parçacık neden blokajı büyüklüğü uygulanan germe ve uygulanan gerilimine bağlıdır. Güvenilir ölçümler için RMS ses olmalıdır 0.1 nA &lt;10 pA ve mod abluka büyüklüğü olmalıdır&gt;. <ol><li> Nano-gözeneklere üzerindeki üst sıvı, hücre ve koruyucu kafese yerleştirilir ve üst sıvı içinde seyreltilmiş hücre kalibrasyon parçacıkların 40 ul getirmektedir. ≥0.8 kPa pozitif basınç uygulamak için VPM kullanın. </li><li> Kalibrasyon neden abluka olayları analiz ederken 44 mm doğru yavaş yavaş uygulanan streç azaltınparçacıklar. Nano-gözeneklere yoluyla gözenek çapı parçacıkların hareketi azaltmak zaman olasılığı daha az olacaktır ve bu nedenle, partikül oranı azalacak: edin. Ancak, gözenek nispî blokajına daha büyük bir blokaj etkinliği gelişmiş bir sinyal-gürültü oranı ile meydana gelir. Gerilimi artırarak daha abluka büyüklüğünü artırabilir ama aynı zamanda RMS gürültü artırabilir. </li><li> Uygun blokajı olaylar (Şekil 1c) &quot;Sinyal İz&quot; panelinde gözlenen kadar streç azaltın. (Modu&gt; 0.1 nA) ve tekabül eden partikül hızı&gt; 100 / dakikadır. Not: parçacık hızı en az 500 parçacık ölçüleri, ancak ideal olarak, daha az sıkı bir kesme olduğu, &lt;100 / dak tanecik oranı en az 5 dakika sürelerini kayıt neden olacaktır. (Örnek seyreltme yapılmalıdır mevcut olduğu takdirde) 2000 / dak daha yüksek oranlar daha az parçacık hassas ölçümler neden olabilir. </li></ol> Kalibrasyon 1.3 ÖlçümüParçacıklar, Uper Sıvı Hücre ve Numune Ölçümü Yıkama <ol><li> Habis beyin tümörü hücre çizgisi U87 mg / EGFRvIII hücre kültürü süpernatanından bu bölüm AGH&#39;ye karakterize edilir. Bu EVs izolasyonu ve hazırlanması daha önceden tarif edilmiş ve 18 görselleştirilmiştir. </li><li> Üst sıvı hücreye kalibrasyon parçacıkları yerleştirin. (Örneğin 0.8 kPa için) basınç VPM ve kayıt&gt; 500 parçacıkları kullanarak uygulayın. </li><li> Çok basınç ölçümünün gerçekleştirilmesi durumunda, (1.0 kPa örneğin) uygulanan basıncı artırmak ve ikinci bir kalibrasyon dosyasını kaydedin. Not: 0,2 kPa fark minimum gereklidir. </li><li> Üst sıvı hücreden kalibrasyon numune çıkarılmaktadır. Kalan parçacıkları çıkarmak için, üst sıvı hücreye 100 ul PBS ile 3 kez yıkayın. Üst sıvı hücreye örnek uygulaması başlamadan önce, üst sıvı hücreden herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için tüysüz bir doku kullanın. </li><li> Üst sıvı hücreye örnek tanıtmak. Bazal geçerli kalibrasyon parçacıkları ölçerken gözlenen temel akımın% 3 içinde olduğundan emin olun. Değil% 3 içinde ise, başlangıç ​​akımını stabilize etmek için aşağıda açıklanan stratejisini uygulamak. Kalibrasyon parçacıklara uygulanan kesin basınçlar uygulamaya ve örnek dosyaları kaydedin. Not: Parçacık oranı grafiği sabit bir partikül algılama (Şekil 2a) göstermelidir. Parçacık algılama, temel akımı ani bir düşüş, veya RMS gürültü ani bir artış ani kesilmesi durumunda, gözenek tıkanmış olabilir; Böylece, Kaydı duraklatmak. Bazal, dokunun geri yüklemek veya koruyucu kapağı bükün, dalgıç uygulamak, veya tamamen Nanopore çıkarın ve deiyonize su ile yıkayın ve cihaz üzerinde değiştirmek için. Not: Alternatif olarak, yaklaşık olarak 5 dakika boyunca VPM maksimum basınç ile birlikte 47 mm küçük gözenek gerilmesini arttırabilecekse. </li></ol> 1.4 Veri Analizi <ol><li> Tıklayın &quot;, Yazılımın analiz bölümüne girmek için Veri &quot;sekmesini analiz edin. &quot;İşlenmemiş Dosyaları&quot; ve seçme &quot;Süreç Files&quot; sağ tıklayarak kalibrasyon ve örnek dosyaları işleyin. </li><li> Kalibrasyon kayıtları çift &quot;Kalibre&quot; sütununda numune yanında örnek dosyaları onay kutusunu tıklatın. İlgili örnek ve kalibrasyon dosyaları seçin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Not: Çoklu basınç kalibrasyon seçeneği birden fazla kalibrasyon dosyaları çift birden numuneler için soldaki &quot;Çok basınç Kalibrasyon&quot; sekmesini seçin kullanırken. </li><li> Bir kez başarıyla birleştiğinde, Izon Kontrol Suite yazılım gibi bir boyut dağılımı gibi farklı örnek karakteristikleri (Şekil 2b) gösterecektir, bazal süreler, tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) ve konsantrasyon analizi. İsteğe bağlı: Bir virgülle ayrılmış dosya olarak her numune için, bireysel veri noktaları ihraç edilebilir. </li></ol> 2.lternative Protokolü - Kalibrasyon Boncuk ile Örnekleri Ani Not: İzole AGH ile çalışırken Genel olarak, standart işletim prosedürü kullanılabilir. Biyolojik numunelerde, ya da büyük protein agrega ile kontamine izole EV hazırlıklarında izole olmayan AGH, çalışırken cihazı kullanmadan zor olabilir. Bu zorluklar özellikle Nanopore engelleme (temel akımı ani düşüş), kalibrasyon ölçüm veya özdeş örnekleri (Şekil 3a) arasındaki parçacık oranlarında önemli farklılıklar% 3 içinde temel akımlarını kurtarmak için yetersizlik yüksek bir orandır. AGH ölçmek için bu güçlükleri bir alternatif protokolü görüntülendiği numuneler için 17 geliştirilmiştir. Bu yöntem, ilgi (Şekil 3b) arasında daha büyük bir numune içine polistiren kalibrasyon boncuklar eklenmesine dayanır. Bu protokol için ayrıntılı bir işlem, aşağıda tartışılmıştır. 2.1. ÖrnekHazırlık Not: alternatif bir yöntem kullanarak örnekler hazırlarken, yaklaşık aynı zamanda 1. EV-kadar-boncuk oranının sağlanması istenir, bu doğru &quot;gating &#39;sağlamak için, örnek bir&quot; sadece kalibrasyon boncuk&#39; içeren esastır kalibrasyon boncuk ve tampon mevcut (örneğin protein agrega için) arka plan parçacıkların sayısını belirlemek için. <ol><li> 300 xg&#39;de 7 dakika boyunca hücre kültürü süpernatanı Santrifüj 100 ul </li><li> PBS ve 20 ul 75 kez 10 ul süpernatan 20 ul 335 nm polistiren boncuklar (stok 7E10 / ml) ile seyreltilmiştir. </li></ol> 2.2. Numune Ölçümü <ol><li> Optimum enstrüman ayarlarını belirlemek için 1.2 bölümünde tanımlanan strateji kullanın. </li><li> Örnek ilk &#39;sadece kalibrasyon boncuk&#39; ölçün. Küçük olmayan boncuk parçacıkların arka tespiti mümkün olduğu kadar düşük olduğundan emin olun (&lt;boncukların% 10). </li><li> Her sa ölçünyapıldığı Örnek kez kayıt eşit farklı numuneler üzerinde küçük gözenek koşullarında dalgalanma dağıtmak için önceki çoğaltır. Her numunenin en az 3 suret ölçün. </li><li> Tüm örneklerin kayıt bittikten sonra &#39;kalibrasyon Kordona sadece&#39; örnek yeniden ölçmesi. </li></ol> 2.3. Veri Analizi Not: Alternatif protokolünü kullanırken, Izon Kontrol Suite yazılımının özel kullanımı konsantrasyonu hesaplama için yeterli değildir. Ek tablo yazılım gereklidir. Tablo 1, Şekil 3 &#39;de gösterilen ters örneklerinin konsantrasyonunu hesaplama örneğini gösterir. <ol><li> &#39;Kalibrasyon Kordona sadece&#39; örnek ve bir veya daha fazla örnek dosyaları açın. </li><li> AGH ve polistiren boncuklar arasındaki ayrım için bir cut-off olarak kullanılabilir (nA) hangi abluka olay boyutu belirleyin. Polistiren boncuklar nüfusun sol tabanına karşılık abluka değerini (nA) (Belirlenmesi <stRong&gt; Şekil 3b). Not: Tüm ölçümlerin bin-boyutları eşit ayarını sağlamak (&quot;Bireysel Abluka Trace&quot; altında &quot;pop-up&quot; butonuna tıklayarak erişilen &#39;ViewSettings&#39; ayarlanabilir). </li><li> Numunenin &quot;Parçacık Analiz Özeti&quot; sekmesini tıklayarak her bir numune için toplam tanecik sayımı değerlerini alabilir. </li><li> Adım 2.3.2 belirlenen eşik değeri kullanılarak, veri kümeleri filtre. &quot;Veri Filtreleme&quot; pop-up seçerek. Ekran sadece cut-off daha küçük olan parçacıklar. </li><li> &quot;Parçacık Analiz Özeti&quot; den her numune için EV sayımı değerlerini alabilir. </li><li> Kalibrasyon boncuk miktarını belirlemek için, toplam parçacıklardan EVs miktarını çıkarın. </li><li> Kalibrasyon boncuk sayımı EV sayısının bölünmesiyle EV-to-boncuk oranını belirler. </li><li> Her &amp; için belirlenen oranları ortalamasını alarak ortalama arka oranını belirleme# 8220; sadece &quot;kalibrasyon örneği boncuk. Her bir örnekten bu değerini çıkarın. </li><li> Her numune için EVs konsantrasyonunu belirlemek için kalibrasyon boncuk konsantrasyonu ile ayarlanmış EV-kadar-boncuk oranını çarpın. </li><li> EV örnek kalibrasyon boncuklarının eklenmesi ile ortaya EV seyreltme faktörü ile adım 2.3.9 bulunan konsantrasyonu çarpın. Not: Örnek örnek kurulumunda, PBS ve kalibrasyon boncuk numunenin toplam 2.5 kat seyreltme ve dolayısıyla aşama 2.3.9 bulunan konsantrasyon ham EV örnek konsantrasyonunu belirlemek için 2,5 ile çarpılmalıdır olduğunu. </li><li> Bu ortalamalar, standart sapma ve çoğaltır her grup için ortalamanın standart hatası olarak istatistikleri hesaplayın. Not: Bazı durumlarda görülmektedir AGH ve kirpi polistiren boncuklar birbiriyle örtüşmektedir. EV konsantrasyonunun düşük tahmin için düzeltme gerekli ise, kirpi polistiren boncuklar olmayan örnekleri de ölçülmelidir. Aynı kesilmeye kullanınBir &quot;boncuk kadar EV&quot; oranını belirlemek için aşama 2.3.2 belirlenen kapalı olarak, katkılı polistiren taneciklerin aralığı içinde kalan EVs oranını hesaplamak için kullanılır. Bu boncuk kadar EV oran basamağına 2.3.8 belirlenen EV-kadar-boncuk oranında eklenmelidir. </li></ol> 2.4. İsteğe bağlı: Alternatif Yöntemiyle EV Boyut Dağılımı. <ol><li> Kontrol Suite Yazılımı iki kez örnek bir kayıt açın. </li><li> Yukarıda belirlenen kesme daha büyük bir göstergedir parçacıklarına örneklerinden birine filtre seçeneklerini ayarlayın. Bu kalibrasyon parçacıkları tek gösterecektir. </li><li> &quot;Kalibrasyon dosyası&quot; filtrelenmiş örnek ayarlayın ve kalibrasyon boncuk modu boyutunu girin. </li><li> Çift örnek dosya ve 1.4.2 tarif edildiği gibi aşama 2.4.3 oluşturulan &quot;kalibrasyon dosyası&quot;. Örnek dosya artık çivili kalibrasyon boncuklar göre EVS ve kalibrasyon boncuk her ikisinin bir boyut dağılımına gösterecektir. Not: Standart operating protokol çoğunlukla EVs boyut dağılımlarının belirlenmesi için yeterli olacaktır. Bazı durumlarda bununla birlikte, kesin bir tampon komponentler imkansız ilgi EVS ile aynı tampon maddesi içinde kalibrasyon boncuk bir numune hazırlamak için yapar (plazma veya idrar gibi) bilinmemektedir. Kalibrasyon parçacıkları ile çivili bir EV örnek bu özel koşullarda EV boyut tahmininde kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.+Nature+reviews.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews.</a> Drug discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer--the+emerging+science+of+cellular+'debris'.">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'.</a> Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+function:+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology.">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9, 871-881 (2008).</li><li>Bobrie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+supports+exosome-dependent+and+-independent+mechanisms+that+modify+the+tumor+microenvironment+and+can+promote+tumor+progression.">Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression.</a> Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET.">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nature medicine. 18, 883-891 (2012).</li><li>Al-Nedawi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+transfer+of+the+oncogenic+receptor+EGFRvIII+by+microvesicles+derived+from+tumour+cells.">Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells.</a> Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).</li><li>Dommelen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+exosomes:+opportunities+for+cell-derived+membrane+vesicles+in+drug+delivery.">Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).</li><li>Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+detection+of+microparticles+and+exosomes.">Innovation in detection of microparticles and exosomes.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).</li><li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+sizing+of+nano/microparticles+with+a+tunable+elastomeric+pore+sensor.">Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor.</a> Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).</li><li>Kozak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+size+and+zeta-potential+measurements+of+individual+nanoparticles+in+dispersion+using+size-tunable+pore+sensors.">Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors.</a> ACS. 6, 6990-6997 (2012).</li><li>Willmott, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+tunable+nanopore+blockade+rates+to+investigate+colloidal+dispersions.">Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions.</a> Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).</li><li>Roberts, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+pores+for+measuring+concentrations+of+synthetic+and+biological+nanoparticle+dispersions.">Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions.</a> Biosensor. 31, 17-25 (2012).</li><li>Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variable+pressure+method+for+characterizing+nanoparticle+surface+charge+using+pore+sensors.">A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors.</a> Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).</li><li>Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Particle+Velocity+and+Measurement+Sensitivity+by+Changing+Pore+Sensor+Dimensions.">Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions.</a> Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).</li><li>Vrij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+nanosized+extracellular+membrane+vesicles+with+scanning+ion+occlusion+sensing.">Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing.</a> Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. (3037), (2012).</li><li>Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+nanoparticulate+drug+delivery+system+using+scanning+ion+occlusion+sensing.">Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing.</a> Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).</li></ol>

Özetlenen protokol ve bu yazının yazma gelişme mali Hollandalı Beyin Vakfı, Schumacher Kramer Vakfı ve Bohnenn Fonu, kısmen, desteklenmiştir. Bu video-makale üretimi kısmen Izon tarafından sponsorted edildi.

Miktar ve tRPS kullanarak EVs boyutu karakterizasyonu için bu el yazması teklif metodolojileri tarif protokolleri. TRPS platformunun önemli avantajları küçük örneklem büyüklüğü, göreceli kısa ölçüm süresi ve gerekli numune manipülasyon yokluğu vardır. Doğru tRPS ölçümü için önkoşuldur kalibrasyon ve numune ölçümleri arasındaki özdeş koşullar tutmaktır. Bu, aynı tampon kullanımının yanı sıra küçük gözenek büyüklüğü, gerilim ve uygulanan basınç gibi aynı cihaz ayarlarını kapsamaktadır. Orijinal VPM bu şekilde, örnekler arasında uygulanan basınç arasındaki farklılıklar küçüktür neden uygulanan basıncın tam ayarı için bir mekanizmayı barındırmamaktadır. Farklı zaman noktalarında ölçülmesi Ayrıca, VPM hazırlama sıvısı içinde buharlaştırılması, küçük basınç farklılıkları neden olabilir ve bu nedenle sık sık yeniden VPM ile prime edilmiş olmalıdır. Bu kısıtlamalar, potansiyel olarak VPM2, zerk edilmesi ile çözülmüştür hangiBir tıklama bazlı ölçeğe sahip ve hava basıncı dayanır. Bu yazıda tarif edilen alternatif protokol olmayan saflaştınlmış biyolojik numuneler 17 EVs ölçümü için uygundur. Bu şekerler, lipidler, proteinler ve bazı durumlarda, diğer daha büyük parçalardan tampon bileşenleri, geçerli olmak üzere standart bir protokol için çok fazla ölçüm koşulları etkileyebilecek inanıyoruz. Numunenin iki ayn yapı yerine değerlerle karşılaştırılarak kalibrasyon boncuklarının ilavesinin, &quot;gerçek zamanlı kalibrasyon &#39;getirmektedir. Farklı ve / veya bilinmeyen bir akışkan arka plan içeriğini numuneler (örneğin, farklı vericilerden kan plazması) karşılaştırırken Bu yöntem özellikle uygundur. Farklılıklar AGH ve polistiren parçacıkların (örneğin, parçacık yoğunluğu ve yüzey yükü), teorik modellerin yanı sıra deneysel veriler arasındaki mevcut olmasına rağmen miktar ve AGH boyutu profil için polistiren boncuk kullanılabilirliğini altını,önkoşul altında olduğu önemli bir basınç 15,19 uygulanır. Elektrokinetik güçlerin etkisini en aza indirmek için, göreceli olarak daha yüksek NP150 / nano-gözeneklere NP200 ve önemli bir basıncın kullanımı tavsiye edilir. AGH ve kalibrasyon boncuk boyutuna göre ayırt edilir. Sonuç olarak, çok küçük gözenek EVS ve daha büyük partiküllerin kalibrasyon her ikisinin tespit gözlenen bir çapa, gerilme uygulayarak açılmalıdır. Gözenek açılması küçük parçacıklara karşı hassasiyetini azaltacaktır yana, yalnızca kaydedilir belirli bir boyutta (genellikle AGH&gt; 120 nm bir 335 nm kalibrasyon boncuk kullanılarak) daha büyük EVS. EVs için en düşük saptama sınırı bir NP150 nano-gözeneklere 203 nm kalibrasyon boncuklar kullanılarak, yaklaşık 90 nm&#39;ye düşürülebilir. Büyük AGH nanopore sık sık tıkanma neden Ancak, bu kurulum geçerli olmayabilir. Bu engellemekten EVs varlığı kurulum kullanımını zorlamaktır nerede rea çok küçük AGH bir nüfus,bulgulama eşiğine ch, tespit edilemez. Boyutu 100 nm daha küçük partikülleri ölçmek için çalışırken zorluk sistemi artar çalıştırmak için. Bu gibi durumlarda, belirleme elektrolit tuz konsantrasyonunun arttırılması yoluyla iyileştirilebilir. Artan iyon konsantrasyonu küçük parçacıklar için nispeten artmış abluka büyüklüklerini (büyük sinyal-gürültü oranı) neden olacaktır. EVs ölçümleri için bu tekniğin yaşayabilirliği yüksek tuz konsantrasyonları EVs hacmini etkileyebilir gibi olsa da güncellenmelidir. Sonuç olarak, bir platform tRPS doğrudan miktar ve EVs büyüklük bakımından kullanılabilir. Herhangi bir izolasyon veya EV manipülasyon (antikor bağlama veya floresan etiketleme) gerekli olduğundan, platform, biyolojik sıvılar içinde, doğrudan EV ölçümü için uygundur. Alternatif bir protokol bellek bileşenleri önemli ölçüde gözenek cloggin neden burada numuneler için yararlı olabilir sağlanmıştırişlersiz standart protokol güvenilir kullanımını sağlayarak g olaylar.

Hücresel kökenli kesecikler vücut sıvılarında 1 oldukça bol. Bu sözde-dışı vezikülleri (EVS) (50 - 1000 nm boyutunda) hücre membranı ile çoklu vesiküler organların ikisi füzyonu veya hücre zarının doğrudan dışarı tomurcuklanma ile oluşturulmaktadır. Son yıllarda, AGH&#39;ye bilimsel ilgi çok yeni fonksiyonlar ve EVs özellikleri tarif edilmektedir, ki 1 EV odaklı yayınların bir bolluk ile sonuçlanan, artmıştır. AGH artık, sinyal iletimi, bağışıklık düzenlemesi, ve kan pıhtılaşmasının 1-4 gibi fizyolojik ve patalojik sürece, geniş bir dizi dahil olmak inanılmaktadır. Kanserde, AGH premetastatik niş 5,6, anjiyojenez 8 ön-kanserli içerik 7,8 transferini ve uyarım oluşumunda rol oynamaktadır. Bunun yanı sıra, AGH terapötik ajanların 9 teslimi ajanlar olarak incelenmiştir. Bu de rağmenyadaki gelişmeler, EVs güvenilir ölçümü zor kalır. Geleneksel olarak, dolaylı ölçüm yöntemleri toplam protein içeriğinin veya spesifik protein miktarının dayananlar kullanılır. Geniş kullanılmasına rağmen, bu teknikler protein başına EV farklar için hesap yoktur, ve AGH protein agrega ve proteinleri kirletici arasında ayrım yoktur. Ayrıca, bu teknikler çoğu durumda biyolojik numunelerde EV konsantrasyonlarının karşılaştırması yapmak imkansız hale EVs izolasyonunu gerektirir. Bu nedenle, çabaları daha hassas ve doğrudan EV ölçümü için 10 yapılabildiği yeni yöntemler geliştirmek için yapılmaktadır. Bu rapor, güvenilir ölçümü ve AGH boyutu profil için ayarlanabilir rezistif darbe algılama (tRPS) kullanımını açıklar. Şu anda, qNano alet (Şekil 1a) tRPS için piyasada bulunan tek bir platformdur. TRPS olarak, iletken olmayan bir elastik zar wi noktalamanano-boyutlu bir gözenek inci iki akışkan hücrelerini ayıran. Diğer hücre partikülsüz elektrolit ile doldurulur ise sıvı hücrelerinden biri, söz konusu numunesi ile dikkatle doldurulmuştur. Bir voltaj uygulanarak, bir iyonik akış / elektrik akımı gözenekten partiküllerinin transferi üzerine değiştirilmiş olan (Şekil 1b) kurulur. Bu akım blokajının (&#39;dirençli darbe&#39;) büyüklüğü parçacık 11 (Şekil 1c) hacmi ile doğru orantılıdır. Blokajı süresi örneğin yük ya da 12 gibi şekil parçacık özellikleri üzerine dayanır partiküllerinin zeta-potansiyelini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bilinmeyen parçacık büyüklüğü profil bilinen bir çapa sahip taneciklerin kalibrasyon kaynaklanan direnç darbelerle hasardan kaynaklanan darbeleri dirençli karşılaştırılmasıyla yapılabilir. Blokajın olayın büyüklüğü yanı sıra, bu ortaya çıktığı oranı ölçülür. Bu sayım oran dinleriparçacık konsantrasyonuna es. Konsantrasyon ve ablukaya oranı bilinen konsantrasyon ve tanecik büyüklüğü ile tek bir kalibrasyon numune kullanılarak doğrusal olarak orantılı olduğu için 13 konsantrasyon 14 ve bilinmeyen bir numune boyutu dağılımının 11 ölçülmesini sağlar. Nano-gözeneklere parçacıklarının hareketi elektro kinetik (elektroforetik ve elektro-ozmotik) ve akışkan kuvvetlerinin 15 tarafından belirlenir. Değişken basınç modülü (VPM) akışkan hücreler arasında bir basınç farkı kullanılarak ek bir kuvvet olarak indüklenebilir. Pozitif bir basınç uygulanması, parçacık konsantrasyon düşük olduğunda yararlı olabilir parçacıkların akış hızını artırır. Ayrıca, basınç elektro kinetik güçlerin etkisini azaltmak için uygulanabilir. Göreceli küçük bir gözenek çapına sahip olan nano-gözeneklerde kullanıldığında bu özellikle önemlidir (NP100 muhtemelen NP150 ve NP200) sıklıkta EVs tespiti için kullanılır.Bu nano-gözeneklerde için, önemli bir basınç uygulanması bile, elektro kinetik kuvvetler, partikül yüzey yüküne bağlı olarak, 16 nonnegligible kalabilir. Birden fazla basınçlarda parçacık hızını ölçerek, bir elektro kinetik düzeltilmiş, ve böylece daha hassas EV konsantrasyonu hesaplanabilir. Burada ayrıntılı protokolleri, EVs boyut dağılımına ve konsantrasyonunu tespit etmek için temin edilmiştir. Numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon 17 polistiren boncuklar ile tutturuldu yerlerde normal çalışma protokolü yanında, alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bu gerçek-zamanlı bir ayarlama tekniği, idrar, plazma ve hücre kültürü üstte kalan sıvı ya da biyolojik sıvılarda, doğrudan EV&#39;lerini ölçümü sırasında teknik sorunlardan bazılarını karşılaşılan üstesinden gelmek için kullanılabilir ölçüm uzun bir süre boyunca nano-gözeneklere stabilitesi olamaz zaman sağlanmalıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Variable pressure module</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>NP100, NP200</td>
			<td>Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration Particles</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>CPC100, CPC200, CPC400</td>
			<td>Calibration particles are available in different sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td>Basic sonication bath is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mini) vortexer</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-free tissues</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows based computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Control Suite 2.2</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Software</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification and size-profiling of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing

&#39;Microvesicles&#39; ve &#39;eksozomlann&#39; dahil Ekstrasellüler veziküller (AGH), vücut sıvıları oldukça bol. Yeni yıl AGH ilgi büyük bir artış tanık olduk. EVs koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser de dahil olmak üzere, çeşitli fizyolojik ve patolojik işlemlere, önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Buna ek olarak, AGH ilaç verme araçları olarak, örneğin bir ilaç olarak ya da rejeneratif, terapötik maddeler olarak potansiyele sahiptir. Çünkü kendi küçük boyutu (50 1,000 nm) doğru ölçümü ve AGH boyutu profil teknik açıdan zor. Bu protokol qNano sistemi kullanılarak nasıl ayarlanabilir darbe dirençli algılama (tRPS) teknolojisini tarif EVs konsantrasyon ve boyutunu belirlemek için kullanılabilir. Nano ölçekli gözenek yoluyla transfer üzerine EVs saptanmasında kullanılır göre yöntem, nispeten hızlı bir küçük örnek hacimlerinin kullanılması yeterli ve pur gerektirmezification ve EVs konsantrasyonu. Alternatif bir yaklaşım kullanılarak açıklanmıştır normal çalışma protokolü aşağıdaki numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon polistiren boncuklar ile tutturuldu. Biyolojik akışkanlarda ölçümü sırasında doğrudan EV&#39;lerini bir ayarlama tekniği teknik engellerin üstesinden gelmek için kullanılabilir Bu gerçek zamanlı karşılaştı.

TRPS aleti kullanmak için, iletken olmayan bir küçük gözenek makinesi (Şekil 1a) bir 4 kolları üzerine yerleştirilmiş olması gerekir ve bir voltaj (Şekil 1b) esas alınmalıdır. Bir elektrik akımı temel bir kez kurulduğunda Şekil 1c&#39;de gösterildiği gibi, gözenek içinden geçen parçacıklar tarafından sebep mukavemet darbeler algılanır. AGH ultra-santrifüj ile gliyoblastoma hücre hattı U87 mg / EGFRvIII kapsamındaki hücre kültür süpernatanından saflaştırılmıştır. NP100 bir nano-gözeneklere üzerinde izole EVS (Şekil 2a) ölçümü sırasında stabil bir parçacık hızı grafiği görülmektedir. Bu kararlı parçacık hızı arsa güvenilir EV konsantrasyon ölçümü için gereklidir. 115 nm polistiren kalibrasyon boncuklarının, bir boyut dağılımı (Şekil 2b) ve EV-numunenin konsantrasyonu hesabının bir kaydı EV-örnek kayıt eşleştirilmesi (veriler gösterilmemiştir) temin edilebilir. (Figrue 3a) kesinti ve / veya dalgalanmalar sonuçlanır. Bu yanlış EV konsantrasyon tahminlerinde sonuçlanır. Bilinen konsantrasyon ve boyutta polistiren boncuklar ile numuneyi spike olarak, EV-kadar-boncuk oranı tespit edilebilir. Şekil 3b, boyut olarak 335 nm polistiren boncuklar ile hücre kültürü üst dip sonra, elde edilen sonuçları göstermektedir. İki net nüfus gözlenmektedir. Daha sonra, 0,46 nA bir blokaja yol açacak olan parçacıklar daha büyük parçacıklar polistiren boncuklar belirlenir, kararlı AGH bulunmaktadır. Polistiren boncuklara EVs oranı EVs (Tablo 1) ham konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılır. 3c çivili polistiren taneciklerin dayanan iki popülasyonlarının boyutu tahmini göstermektedir Şekil. Nanopore kurulum kullanılan yenidenboyutunda AGH&gt; 140 nm tespiti neden olmuştur. Bu, küçük gözenek açıklığını düşürerek azaltılabilir, ancak bu aynı zamanda daha tıkanma olayları ile sonuçlanacaktır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: qNano alet ve çalışma modu. Aletin (A) fotoğrafı. Bir küçük gözenek bir üst sıvı hücreden bir alt sıvı ayırma hücresi, alet üzerine yerleştirilir. Sıvısı hücre koruyucu kapak ile çevre elektrik müdahalesinden korunmaktadır. (B) İllüstrasyon ayarlanabilir direnç darbe algılama (tRPS) özetleyen. Bir iletken olmayan elastik Nanopore iki akışkan hücrelerini ayıran. Bir voltaj uygulanarak, bir elektrik akımı nano-gözeneklere delinmiş gözenekten kurulur. Ekstrasellüler veziküllerin nanopore ile hareket ederken, iyonik akışı değişir ve bir direnç darbe olarak algılandı. TRPS olarak nanopore açıklık büyüklüğü aygıtının karşıt kolların arasındaki mesafeyi artırarak ya da bu mesafenin azaltılması ile Nanopore gerilmesiyle (azaltılabilir veya artırılabilir) ayarlanabilir. (C) dirençli darbeleri Açıklayıcı Örnek. Tek bir direnç darbesinin büyüklüğü parçacığın hacmine orantılıdır:. Büyük bakliyat büyük parçacıkları gösterir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2: Tane saymak-arsa ve U87-MG / EGFRvIII hücre kültürü süpernatanından izole AGH ölçüm elde boyut dağılımı genel sabit bir partikül algılama gösteren (A) Partikül sayım arsa.. Katılımı ile kısa azalmale algılama kaydın 80 ve 100 saniye arasında gözlenmiştir. Koruyucu kapağı kaydının durdurulması ve basıldıktan sonra, parçacık oranı, bundan sonra, kayıt devam edildi stabilize. (B) izole EVs boyutu dağılımı, 115 nm polistiren kalibrasyon tanelere bilinmeyen bir örneği (EVS) kalibre sonra işaretlenir. (5 nm kutu boyutu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3: Alternatif protokolü kullanılarak hücre kültür tortusu içinde EVs tRPS ölçümü. Bir biyolojik sıvıda doğrudan EV&#39;lerini ölçülürken elde edilen (A), tipik tanecik hızı çizimleri. Gözenek tıkanması parçacık algılama oranı kısa kesintileri ve dalgalanmalara neden olur. Herarsa aynı numunenin bir tekrarlanan ölçümü ifade eder. 335 nm polistiren kalibrasyon boncuklar ile hücre kültürü üst katmanını spike sonra elde edilen (B), üç adet eş büyüklüğü dağılımı grafik. En az 0.46 nA bir darbe dirençli indükleyen tüm parçacıklar EVs seçilir. (C) kirpi polistiren taneleri, numunenin bir boyut dağılımını elde etmek için kullanılabilir. (5 nm kutu boyutu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ölçme </td><td> Kalibrasyon sadece # 1 </td><td> Kalibrasyon sadece 2. </td><td> Supernatant # 1 </td><td> Supernatant # 2 </td><td> Supernatant # 3 </td></tr><tr><td> Ortalama akım (nA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Parçacık hızı </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> kullanılan kesme (nA) </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td> Toplam parçacıklar </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Hücre dışı kesecikler </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> Çivili kalibrasyon boncuk </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> AGH / kalibrasyon boncuk </td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> 0,788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td> Örnek - arka plan </td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> Extracelullar vezikülleri (10 7) / Ml </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> Örnek 2.5x seyreltilmiş </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ham konsantrasyon AGH (10 7) / ml </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Alternatif protokolü kullanılarak EV konsantrasyon Örnek Hesaplama cut-off değeri kalibrasyon boncuk AGH ayırt kararlıdır. Daha sonra, EVS ve boncuk toplam sayısı alınabilir. Her ölçüm için EV-to-boncuk oranı hesaplanır. (Örneğin protein unsurlarının için) elektrolit içinde arka parçacıkların miktarı &quot;kalibrasyon taneler, sadece &#39;numunesinin tek ölçümler için, EV-kadar-boncuk oranının ortalaması alınarak hesaplanır. Her numune için, arka plan oranının elde oranı çıkartılmaktadır. Bu adjusteD oranı (: 9.33e7 / mL bu örnekte) numunede kalibrasyon boncuk konsantrasyonu ile çarpılır. EVs ham konsantrasyonunu belirlemek için, elde edilen konsantrasyon (: 2.5 Bu örnekte) toplam AGH seyreltme faktörü ile çarpılır.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing at JoVE.com

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar.

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.2K Görüntüleme.  University Medical Center Utrecht.  Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar. 

Video: Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Biyomühendislik

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Multiplexed Transdermal Elektrokimyasal Algılama Hollow microneedle tabanlı Sensör

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

Organik Elektrokimyasal Transistör Bariyer Doku bozulması ve Algılama

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Biyomedikal Uygulamalar için Mekanik ayarlanabilir ve Biyoaktif Metal iskelelerinin Fabrikasyon

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

Bir Ayarlanabilir Nanopore aracılığıyla Nanopartikül Translokasyon Hızları aracılığıyla Zeta Potansiyeli Belirlenmesi: Bir Örnek olarak DNA modifiye Parçacıklar kullanma

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...