Bu protokol, alt akım ex-vivo analizleri için tüm doku örneklerinden küçük hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve izolasyonu için titiz ve tekrarlanabilir bir teknik sağlar. Şu anda ulaşılabilir saflık en yüksek düzeyleri arasında, Bu yöntem tümörler de dahil olmak üzere çeşitli doku örnekleri içine salgılanan interstisyel veziküller doğrudan morfolojik, immünohenotipic ve derin karakterizasyon kolaylaştırır. Burada, doku EVs beyin ve akciğer tümör örneklerinden izolasyon göstermek.
Ancak, bu teknik çeşitli kullanarak çalışmalara uygulanabilir, iyi huylu, veya diğer tümör örnekleri de. Başlamak için, her 0,4 ila 1,0 gram doku için Hazırda Bekletme-E ortamda 10 mililitre ayrışma tamponu hazırlayın. 50 mililitrelik bir tüp tampon için tüm taze veya dondurulmuş doku ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 derece santigrat sıcak su banyosunda kuluçka.
Bundan sonra, dissosiasyon tampon son 1x konsantrasyonu için proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin. Gevşek bir uyum homogenizer içine doku ile çözelti dökün. Dokuyu hafifçe ayrıştırmak için numune başına yaklaşık 30 yavaş vuruş kullanın.
Daha sonra, 50 mililitrelik konik tüp için ayrışmış doku ve tampon çözeltisi aktarın. 500x g ve dört derece santigrat beş dakika hücre ve kalan lifler veya uyumlu doku parçaları pelet için santrifüj. Süpernatant'ı temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 2, 000x g'de ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca büyük hücresel enkazı atın.
Temiz bir 50 mililitre konik tüp bu supernatant aktarın, ve santrifüj 10, 000x g ve dört derece santigrat 40 dakika herhangi bir istenmeyen büyük veziküller veya küçük apoptotik organları pelet. Süpernatant'ı 0,45 mikrometrelik bir filtreden temiz 12 mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne boşaltın. Daha sonra, ultracentrifuge örnek 100, 000x g ve dört derece santigrat iki saat boyunca, küçük EVs pelet.
Supernatant decant ve ultracentrifugation tüpleri beş ila 10 dakika ters bırakın, tüplerin yanlarında herhangi bir kalıntı sıvı kaldırmak için sık sık dokunarak. Daha sonra, 0,25 molar sakaroz tampon 1,5 mililitre EV pelet resuspend. Tüpleri Parafilm ile kapatın ve evs'i çözeltiye sokun.
Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika ultracentrifuge tüpleri sallayın. Ve sonra girdap bir kez daha. Kısaca tüpleri 1,000x g'den daha düşük bir hızda santrifüj edin ve tüpün altındaki sıvı süspansiyonu geri edin.
Gerekirse, süspansiyonu bir gecede dört derece saklayın. İlk olarak, % 30 iodixanol içeren nihai bir çözüm oluşturmak için EVs içeren sakaroz tris tampon 1.5 mililitre% 60 iodixanol 1.5 mililitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez iyice çözelti karıştırmak için.
Bu çözeltiyi 5,5 mililitrelik ultrasantrifüj tüpünün dibine aktarın. Daha sonra, ultra saf su ile % 60 iodixanol stok karıştırın hem% 20 ve% 10 iodixanol çözeltisi en az 1,5 mililitre hazırlamak için. Bir şırınga ve 18 gauge iğne kullanarak, ölçü 1.3 mililitre 20%iodixanol çözeltisi ve dikkatle alt degrade üstüne katman.
İğnenin yamacını tüpün içiyle temas halinde tutun, menisküsün hemen üzerinde ve yoğunluk arabirimindeki katmanları karıştırmamak için çözelti yitirme yi ekleyin. Daha sonra, katman 1.2 mililitre 10% iodixanol çözeltisi% 20 tabaka üstüne, aynı tekniği kullanarak. Ultracentrifugation tüplerini rotor kovalarına dikkatlice dengeleyin ve yükleyin.
Bir salıncak kovarotorunun hızlanma ve yavaşlama hızlarını minimum hızlara ayarlayın ve santrifüjü 268, 000x g ve 4 derece santigrat derecede 50 dakika ayarlayın. Örnek santrifüj edilirken, yoğunluk degradesinin 1'den 10'una kadar kesirlerle karşılık gelecek her numune için 10 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri etiketle. Santrifüj tamamlandıktan sonra, tüpleri rotor kovalarından hafifçe çıkarın ve sabit bir tutucuya yerleştirin.
Pipet 10 seri fraksiyonları 490 mikrolitre degrade nin üstünden ilgili tüplere. Bir refraktometre kullanarak, kesirlerin kırılma indekslerini ölçün. Sonra, temiz bir 12 mililitre ultracentrifugation tüp her kesir aktarın.
Her tüp ve pipet yukarı ve aşağı yavaş yavaş karıştırmak için beş mililitre 1x PBS ekleyin. Tüpün üst kısmında 1x PBS ek altı mililitre ekleyin ve dikkatlice tekrar karıştırın. Ultracentrifuge tüpler 100, 000x g ve dört derece santigrat küçük veziküller yeniden pelet.
Protein analizi için vezikülleri eritmeden veya morfolojik analiz için EVs'leri yeniden sumadan önce süpernatantı dekantın ve tüpleri kurutun. EVs protein analizi için lyse için, EV peletproteaz inhibitörü içeren güçlü lysis tampon 40 mikrolitre ekleyin. Parafilm'i her tüpün üzerine yerleştirin ve girdap ları şiddetle yerleştirin.
Sonra, tekrar oda sıcaklığında ve girdap 20 dakika tüpleri sallayın. Numunenin tamamını kurtarmak için numuneyi 30 ila 60 saniye boyunca 1,000x g'de kısaca santrifüj edin. Her numuneyi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve daha fazla işleme hazır olana kadar 20 ila 80 santigrat derece arasında bir sıcaklıkta saklayın.
İmmünoblot analizi için saflaştırılmış lysates hazırlamak için, 1x son konsantrasyon için numunelere 5x Laemmli örnek tampon ekleyin. Numuneyi 95 derecede 5-10 dakika kaynatın. Daha sonra, 10% SDS sayfa jel içine kesirler 1 ile 10 eşit hacimli yükleyin.
Eşit miktarda doku homojenate yükleyin. Saflaştırılmış lizatlarda EV proteinlerini doğrulamak ve kesirlerde göreceli EV bolluğunu karşılaştırmak için elektroforez ve Batı leke analizi yapın. Bu çalışmada, ekstrasellüler ayıklanır ve tüm dokudan saflaştırılır.
%10-30 iodixanol degradesinin ultrasantrifüjünün ardından, ışık lı EV popülasyonunun ikinci kesire kadar göç etmesi görülürken, doku tipine bağlı olarak yoğun EV popülasyonunun beş kesire kadar göç yaptığı görülebilir. Degrade fraksiyonlarının temsili immünoblots fraksiyonu 5 küçük tümör türemiş EVs verimli ayırma ve saflaştırma sergiler. Özellikle, akciğer tümörü örnekleri daha önce tüm beyin dokusundan hasat edildi ışık EVs ile karşılaştırıldığında yoğun EVs zenginleştirilmiş görünür.
Temsili nano partikül izleme analizi ve fraksiyon içeren baskın vezikül doku kaynaklı veziküllerin elektron mikroskobu tüm veziküllerin zenginleşmesini ve korunmasını göstermektedir. Küçük EV'lerin bilinen boyutu ve yapısıyla tutarlıdır. Interstisyel EVs yeni tanı veya prognostik biyomarker tahlilleri gelişimi için umut verici hedefleri temsil eder.
Bu teknik, araştırmacılara veziküllerin aşağı akım için çıkarılması ve saflaştırılması için araçlar sağlar. Tüm veya lysed doku EVs çıkarılmasından sonra, proteomik dahil veziküllerin geniş karakterizasyonu, genomik, ve lipidomik analizler yapılabilir. Ayrıca, örnekler daha hedefli yaklaşımlar için kullanılabilir.
Doğrudan doku örneklerinden izole edilen veziküller, tümör oluşumu da dahil olmak üzere hastalık mekanizmaları hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ve gelecekte önemli tanısal veya prognostik araçlar sağlayabilir.
