Bu yöntem, alandaki yaygın bir sorunu giderır ve hızlı izolasyon ve belirli ilgi belirteçleri ile tek hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu için tam bir iş akışı sağlar. Nanoparçacık izleme analizi yarı otomatik bir yöntemdir. Bu ekstrasellüler veziküllerin boyut dağılımını analiz etmek için ışık saçılma ve Brownhareketin özelliklerini kullanır.
Prosedürü gösteren Vera Schmidt, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi olacak. Hücre dışı vezikülleri izole etmek için, serum ayırıcı tüpler içine insan tam kan iki mililitre örnekleri topladıktan sonra, örnekler in oda sıcaklığında 15 dakika pıhtılaşmak için izin santrifüj ile serum hücreleri ayırmadan önce. Trombositleri çıkarmak için santrifüj için her örnekten bir mililitre serumu ayrı ayrı 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın ve trombosit-fakir plazmanın 100 mikrolitresini yeni 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın.
Daha sonra, plazma ve girdap iyice örnekleri ekzozom çökelti 25 mikrolitre ekleyin. Buz üzerinde 30 dakikalık bir kuluçka dan sonra, santrifüj ile ekstrasellüler veziküller toplamak. Pelet bej veya beyaz renk olarak görünür.
Süpernatant aspire ve tekrar örnek santrifüj. Daha sonra, sıvı tüm translar çıkarın ve PBS 100 mikrolitre pelet resuspend. Veziküllerin hücre zarlarını boyamak için, yeni hazırlanmış PKH67 etanolik boya çözeltisi 50 mikrolitre EV süspansiyon 10 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın.
Karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika sonra, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde 2,5 mililitre distile su ile lekeli ekstrasellüler vezikül süspansiyon 50 mikrolitre seyreltin, iyice karıştırma ile. Antikorlar ile veziküller etiketlemek için, seyreltmek 10-20 mikrolitre lekesiz ekstrasellüler vezikül süspansiyon ile 50 mikrolitre distile su 1.5 mililitre reaksiyon tüpü, iyice karıştırma ile. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için, reaksiyon tüpüne ilgi antikor 2,5 ila beş mikrolitre ekleyin, iyice karıştırma ile.
Daha sonra, etiketli veziküllerin 50 mikrolitresini, tabloda belirtildiği gibi, uygun deneysel distile su hacmini içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Lekeli veya etiketli hücre dışı vezikülleri analiz etmeden önce, floresan filtresini önce mikroskop ve kameranın optik yoluna taşıyın ve otomatik uygulama için ekrandaki talimatları izleyerek programı başlatın. Hücre Denetimi sekmesinin altında, lazer ve mikroskopun ortak bir odak noktası olduğunu doğrulamak için floresan ölçümü için doğru Hücre Numarasını ve optik için referans konumunu seçin.
Hücre kanalını 10 mililitre distile suyla yıkamak için bir şırınga kullanın, ölçüm hücresinin hava kabarcıklarından arındırılmış olduğuna ve hava kabarcıklarının sisteme enjekte edilmemelerine dikkat edin. Daha sonra, 990 mikrolitre distile su damıtılmış su içinde 200 nanometre büyüklüğünde floresan etiketli polistiren parçacıkların 10 mikrolitre seyreltin ve 10 mililitre distile su içeren 15 mililitrelik bir tüp içine bu parçacık süspansiyon 10 mikrolitre ekleyin. Ardından, ilk seyreltilmiş parçacık çözeltisinin 2,5 mililitresini hücre kanalına enjekte edin ve kamerayı ayarlamak için Odak'ı Optimize Edin'e tıklayın.
Örneği ölçmek için hücre kanalını 10 mililitre distile suyla birden fazla kez temizleyin ve lekeli hücre dışı vezikül süspansiyonunu enjekte edin. Başvuru konumunu kullanarak, tabloda belirtildiği gibi Hücre Denetimi sekmesi altında uygun edinme parametrelerini ayarlayın. En uygun duyarlılık aralığını belirlemek için Parçacık Sayısı vs'yi tıklatın.
Duyarlılık, farklı duyarlılık düzeyleri için ekran başına ölçülen parçacıkların bir eğri görüntülemek için. Deklanşör parametresi için, kameranın ışığın belirli bir aralıkta geçmesini sağladığı süreyi ayarlayın. Postacquisition Parametreleri için en az 20 parlaklık, en az 20 nanometre boyutu ve maksimum ölçüm boyutu 500 nanometre'yi seçin.
Ekranın görüş alanında algılanan parçacıkların sayısına dikkat edin. Saçılma çubuğu yeşilden turuncuya, 50 ila 300 partikül aralığında olmalıdır. Sıfır Volt'ta Parçacık Drift'i Denetle'yi tıklatın ve Ölçüm sekmesini açın.
Video Edinmeyi Çalıştır'ı tıklatın ve Deneme Sayısını üç ila beşe, denemeler arasındaki Zaman Gecikmesini sıfır dakikaya ayarlayın. Parçacıkların analiz edildiği her ölçüm pozisyonunda tek tek alt hacim konumlarının sayısını 11'e ve ölçüm döngülerinin sayısını 10'a ayarlayın. Ardından, bir klasör seçin, yeni bir dosya adı oluşturun ve ölçümü başlatmak için Tamam'ı tıklatın.
Çözümlemenin sonunda, sonuçları gözden geçirmek için Çözümsekmesini açın. Daha sonra, konum başına düşen ortalama parçacık sayısını, izlenen parçacıkların toplam sayısını ve parçacık konsantrasyonunu, parçacıkların dağılım genişliğini ve ortalamanın değerini ve standart sapmayı kontrol edin. Ölçümün ayarlanması ve kalibrasyonu için floresan boncukların kullanılması optimum ayar hassasiyeti sağlar 85%Bu ayarları kullanarak, kamera keskin bir resim görüntüler ve tekrarlanan ölçümler düşük standart sapma gösterir.
Hücre zarının lipid bölgelerine uzun, alifatik kuyrukları içeren bir floresan hücre bağlayıcısı içeren bir hücre bağlayıcı kiti ile boyama, duyarlılık ve ölçülen parçacıkların sayısı arasında güçlü bir korelasyon ortaya koymaktadır. Ekstrasellüler vezikül lezülü nin bir proteine karşı antikor le boyanması, maksimum 541 nanometrelik maksimum büyüklüğü 220 ile 145 nanometre arasında bir parçacık dağılımını gösterir. Kontrol vezikülsüz suyun antikor lekesi sonrası ekstrasellüler vezikül tespit edilmez, %100'e yakın bir duyarlılığa kadar eğer sürüklenme saniyede 5 mikrometreden büyük olduğunda ölçüme başlanırsa, bireysel tekrarlar belirgin sapmalar gösterir.
Bu florofor hızlı fotobeyazrmaya yatkın olduğundan, florotiyosiyanatın florokrom olarak kullanılmasının yanlış ve tekrarlanamaz ölçümlerle sonuçlanması gerektiğini unutmayın. Bu protokol, belirli belirteçler kullanarak, tek hücre dışı veziküllerin hızlı bir karakterizasyonu için bu alandaki birçok araştırmacının önde gelen talebini giderır. Son on yılda yöntemlerönemli ölçüde iyileşmiş olmasına rağmen, tek hücre dışı veziküllerin analizi için henüz standart bir protokol bulunmamaktadır.
Hücre dışı vezikül biyolojisi üzerine yapılan araştırmaların gelecekteki ilerlemesine bakılmaksızın, bu yöntem belirli belirteçler kullanılarak tek hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu için hızlı ve güvenilir bir protokol sağlar. Mevcut protokollerimiz uzun işlem süreleri veya emek yoğun adımlar içermediğinden, yüksek numune verime için de uygundur.
