Bu çalışma Proje Destek # 1010395 (BQ ve CP) ve # 525431 (CR), ve Avustralya, Hepatit ve HIV Viroloji EOI için bir Avustralya Merkezi Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, bir Programı Hibe # 455395 (CP) tarafından desteklenen 2012 hibe (CR ve RJJ) ve Gordon ve Gretel Çoban Vakfı (BQ ve CR) bir hibe. Biz JCSMR FACS laboratuvar mükemmel bakımı için Harpreet VOHRA ve Michael Devoy teşekkür etmek isterdim, peptid sentezi için Avustralya Kanser Araştırma Vakfı Biyomoleküler Kaynak Tesisi, JCSMR, IAS, ve Dr David Boyle, CSIRO Hayvan Sağlığı Laboratuarları, Geelong, Avustralya ana HIV aşısı stokları sağlamak için.

Not: Bu protokol altında kullanılan Fareler Avustralya Ulusal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu kurallarına ve farelere göre ele alındı ​​servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı. 1.. Boya ve Peptid hazırlanması <ol><li> Boya hazırlanması Not: Boyalar ayrık floresan yoğunluklarda hücre etiketleme izin farklı konsantrasyonlarda ovalanır edilir. CFSE 3.5-kat seri seyreltmeler ile yapılan yedi konsantrasyonlarda kullanılır ve CTV ve CPD (2-4 bakınız Tablolar), 3.7-kat seri seyreltmeler ile yapılan altı farklı konsantrasyonda kullanılmaktadır. Tablolar 2-4 listelenen boyaların stok konsantrasyonları Tablo 2-4 &#39;de listelenen nihai boya konsantrasyonlarda hedef hücreleri etiketlemek için kullanılacaktır. Boyalar, sulu çözeltiye maruz kalma üzerine reaksiyona girmektedir. Bu küçük şişeler önce yoğunlaştırmaya maruz boyaların en aza indirmek için açılması için, oda sıcaklığına kadar dengelenmiş olması önemlidir. <ol><li> CFSE Not: CFSE carboxyfluorescein diasetat süksinimidil ester (CFDA, SE, MW 557,47) olarak satın alınan tipik olarak 25 mg / şişe olarak,. <ol><li> , 10 mM stok çözeltisi elde etmek için 4.48 ml DMSO içinde 25 mg CFSE yeniden süspanse edin. </li><li> Seri olarak CFSE seyreltik: DMSO içinde 87.5 ul içine 10 mM stoklar CFSE 35 ul eklenir ve Tablo 3 &#39;de her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> CTV Not: CTV, tipik olarak bir boya 10 mM çözelti elde etmek için 10 ul DMSO ile yeniden olabilir, her biri 9 küçük şişeler, büyük paketler halinde satın alınır. <ol><li> Sulandırın ve bir 10 mM çözelti vermek üzere 90 ul DMSO ile CTV&#39;nin 9 şişe havuz. </li><li> Seri olarak seyreltilmesi, CTV: DMSO içinde 29.7 ul içine 10 mM stoklar CTV 11 ul eklenir ve Tablo 2 &#39;de her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> CPD Not: CPD (MW 792,6) tipikly 0.5 mg / şişe olarak satın. <ol><li> 10 mM bir çözüm elde etmek için 63 ml DMSO içinde yeniden süspanse CPD 0.5 mg. </li><li> Seri olarak CPD seyreltik: DMSO içinde 29.7 ul CPD içine 10 mM stoklar 11 ul eklenir ve Tablo 4 &#39;de, her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. Not: Boya hisse senetleri, birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir ve işlevde önemli bir kayıp olmadan birkaç kez çözündürüldü ve refrozen edilebilir. </li></ol></li></ol></li><li> Peptid hazırlanması Not: 1 uM (Tablo 5), bir başlangıç ​​konsantrasyonundan 10 misli seyreltmeler kullanılarak yapılan MHC sınıf-I-bağlama peptidleri genellikle 6 farklı konsantrasyonlarda hedef hücreler pals için kullanılır. 400 uM (Tablo 5), bir başlangıç ​​konsantrasyonundan 3 kat seyreltmeler kullanılarak yapılan MHC sınıf II-bağlama peptidleri genellikle 6 farklı konsantrasyonlarda hedef hücreler pals için kullanılır. Her bir peptit PBS gibi tha 2x son konsantrasyon yapılırt, her peptid konsantrasyonu 250 ul bir minimum hacme sahiptir. Peptid stokları önce FTA yapı hazırlanmış ve işlevde önemli bir kayıp olmadan -20 ° C&#39;de saklanabilir. <ol><li> Hazırlama stok MHC sınıf-I-bağlama peptidleri </li><li> 2 uM stok çözeltileri (2 x 1 uM) için her bir peptit epitopunun en yüksek konsantrasyon hazırlamak </li><li> Seri olarak MHC sınıf-I-bağlama peptidleri seyreltik: PBS içinde 400 ul içine 2 uM peptit stok çözeltisi 44.4 ul ekleyin. Tablo 5 &#39;de her bir peptit konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın. </li><li> Hazırlama stok MHC sınıf-II-bağlama peptidleri </li><li> 800 uM stok çözeltileri (2 x 400 uM) için her bir peptit epitopunun en yüksek konsantrasyon hazırlayın. </li><li> Seri olarak MHC sınıf II-bağlama peptidleri seyreltik: PBS içinde 300 ul 800 uM peptid içine çözeltisi 150 ul ekle. Tablo 5 &#39;de her bir peptit konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarla </stRong&gt;. </li></ol></li></ol> 2.. FTA Hazırlık Not: Aşağıdaki prosedür 252 belirgin bir hücre kümeleri vermek üzere 6 kez tekrar 6 farklı konsantrasyonda (. Örneğin, hücre kümeleri 42) 7 farklı peptit epitopları ile pulse hücre içeren bir FTA yapımını açıklamaktadır. Her bir tekrar içinde, herhangi bir epitop (Nil) ile doldurulan bir zigot, bir kontrol olarak dahil edilir. FTA analiz zamanda antikor etiketleme alıcı hücrelerin kendi ayrımı sağlamak için bir ev sahibi hayvanlar, bir CD45 allotip fark sahip olması yararlıdır. Aksi takdirde, FTA (adım 2.6 de tarif edilmiştir), bu amaçla örneğin PKH-26 gibi diğer boyalar ile etiketlenebilir. Tipik olarak, FTA hazırlama işlemi bir oturma süresince baştan sona gerçekleştirilir. <ol><li> Etiket 42, 10 ml konik (örneğin, Tablo 1 &#39;de olduğu gibi) Plastik borular 1-42 dipli. </li><li> Hücrelerin hazırlanması <ol><li> Dalak ve / veya lymp izolefarelerden hnodes. 5 ml şırınga pistonu ile elek gözenekli bir 70 mikron ile ezme dokuların tek hücre süspansiyonu hazırlayın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> (RPMI ya da eşdeğeri),% 5 fetal buzağı serumu (FCS) ihtiva eden Rochester Park Memorial Institute 1640 11.5 ml 200 x 10 6 hücre / ml &#39;de yeniden süspanse lenfositler. Not: Bu hücre 3&#39;e boya toksisitesini en aza indirmek için, yüksek amin içerikli bir tampon kullanmak önemlidir. </li></ol></li><li> CTV etiketleme Not: Hücreler başlangıçta CTV&#39;nin 6 konsantrasyonları ile etiketlenir. <ol><li> Iyice tüpü birkaç kez ters çevrilerek hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. Tüplerin üst yarısı ıslak dikkat ederek, 37-42 etiketli 10 ml tüpler 6 hücre süspansiyonu, 1.9 ml ilave edilir. </li><li> CTV ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS içinde 83 ul ve bu stok CTV 17 ul ekle (TAB bakınızStok Çözelti tüp) atanmış olduğu için le 2. Not: A non ıslatılmış tüp boya çözeltisi ile hücre süspansiyonu hareket ve hücre çözeltisinin prematüre karışmasını önlemek için önemlidir. </li><li> Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır. </li><li> Adımları tekrarlayın 2.3.2-2.3.4, Tablo 2&#39;de tarif edilen tayin tüplerine CTV&#39;nin stok çözeltileri için. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin. </li></ol></li><li> CFSE etiketleme <ol><li> CTV etiketleme işleminden sonra, her bir tüpe,% 5 FCS ihtiva eden RPMI içinde 5 ml ekleyin ve iyice girdaplanır hücreleri tekrar süspansiyon. <ol><li> Tüp 37 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 31, 25, 19, 13, 7 ve 1. </li><li> Tüp 38 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 32, 26, 20, 14, 8 ve 2. </li><li> Tüp 39 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 33, 27, 21, 15, 9 ve 3. </li><li> Hücrenin boru 40 devir, 1 ml kaynaktantüpler 34, 28, 22, 16, 10 ve 4 süspansiyonu. </li><li> Tüp 41 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 35, 29, 23, 17, 11 ve 5. </li><li> Boru kaynaktan 42 ve transfer tüpleri 36, 30, 24, 18, 12, ve 6&#39;ya hücre süspansiyonu 1 mi Not: adımları 2.4.1.1-2.4.1.6 sırasında tüplerin üst yarısını ıslak dikkat edin. </li></ol></li><li> CFSE ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS 103 ml ilave edilir, ve buna, (stok çözelti ki boru tahsis edildiği için bakınız Tablo 3) stok CFSE 7 ilave edin. </li><li> Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır. </li><li> Tablo 3 &#39;de tarif edilen tayin tüplerine CFSE stok çözeltileri için adımlar 2.4.2-2.4.4 yapın. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin. </li><li> Hücreler Yıkama: 20 ° C&#39;de 9 ml hücre süspansiyonu ile seyreltinRPMI% 5 FCS, 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile katı madde ve bir transfer pipeti ile aspirasyon ile süpernatantlar çıkarın. </li></ol></li><li> Peptit pulsing ve hücre yıkama Not: hücreler CTV ve CFSE ile etiketlendi sonra, MHC sınıf I ve / veya MHC sınıf II (1.2 hazırlandı) bağlama peptidleri ile birlikte titreşim uygulanır. Hücre popülasyonlarının Bir de (Tablo 1 &#39;de, örneğin. Nil) peptit ile doldurulan ve T hücre yanıtlarının hesaplanması için bir negatif kontrol olarak kullanılmamalıdır. <ol><li> Peptit darbeli <ol><li> % 5 FCS içeren RPMI, 250 ul toplam hacim içinde süspanse hücreler. Not: Genellikle hücre süspansiyonu, 50 ul, aşama 2.4.7 sonunda, süpernatan aspire sonra kalan bu nedenle pelet hücre ortamının 200 ul ekleyin. </li><li> Uygun (Tablo 1 gibi) tüpler belirlenen için (Tablo 5 gibi) önceden hazırlanmış peptid stoklarının 250 ul ekleyin ve olmak surPBS kontrol tüpünü eklemek için bir e Nil kontrol olarak peptid olmadan tek başına ilave edildi. </li><li> Bir girdap ile hücre süspansiyonları karıştırın. Not: Bu, her bir peptit epitopunun, ve her bir peptid konsantrasyonu tek bir tüp ve atanan kritik olan bu kümenin floresan imza Tablo l&#39;de olduğu gibi (bu peptidi tanımlayan çünkü bu boru içinde, hücrelerin floresans beklenen göre net bir şekilde kaydedilir örneğin, 1). </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> Hücre yıkama <ol><li> Buzla soğutulmuş 5 ml (4 ° C) RPMI tüp ters çevrilerek hücre süspansiyonu ve tekrar süspansiyon hücreleri,% 5 FCS içeren ekleyin. Dikkatlice buzla soğutulmuş (4 ° C) FCS 3 ml hücre süspansiyonu altında yatan. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu FCS arayüz sağlamak için yavaş hızlanma ve fren kullanma ve hücre süspansiyon solüsyonu korunur. </li><li> Sonra dikkatle RPMİ&#39;de aspire verahatsız yıkanmış hücre peletleri kalacak şekilde bir transfer pipeti ile FCS,. Not: Hücreleri yıkamak için bir altlık FCS kullanılması kadar peptid solüsyonu mümkün olduğu, hücrelerden çıkarılır sağlamak için yardımcı olur ve hücreler toplanmış olduğunda böylece çok sayıda serbest peptidler hücre popülasyonlarının maruz kalmasını kısıtlar. </li><li> Yine hücreler yıkayın:% 5 FCS ihtiva eden RPMI 4 ° C, 10 ml hücre topakları yeniden süspanse edin. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu Süpernatantlar kapalı dökün. </li><li> Havuz tüm cep birlikte,% 5 FCS ihtiva eden RPMI 4 ° C arasında 6 ml kullanarak bir pipet ile tek bir tüp içine popülasyonu. Tortu, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplandı Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. </li></ol></li></ol></li><li> CPD Hücre etiketleme Not: Bu noktada, altı intra tahlil replika CPD 6 farklı konsantrasyonları ile etiketleme, peptit darbeli hücreleri tarafından üretilebilir. <ol><li> 20 ° C&#39;de 11.4 ml ekleyinRPMI iyice bir pipet kullanılarak bir araya getirilmiş ve hücre peleti tekrar süspansiyon% 5 FCS ihtiva etmektedir. </li><li> Tüplerin üst yarısı ıslak dikkat ederek, 10 ml tüpler AF etiketli, 6 hücre süspansiyonu, 1.9 ml ilave edilir. </li><li> SMG ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS içinde 92 ul ve bu için (her bir tüpe tahsis stok çözeltisinin miktar için Tablo 4) hazır CPD ekleyin. </li><li> Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır. </li><li> . CFSE ve CTV farklı olarak, CPD etiketleme konsantrasyonu tam olarak doğrusal etiketlenmiş hücrelerin, elde edilen flüoresan yoğunluğu ile ilgili değildir ve: Tablo 4&#39;te tarif edilen tayin tüplerine CPD stok çözeltileri için adımlar 2.6.3-2.6.5 not mi çok çeşitli etiketli popülasyonlarının eşit floresan tepe elde etmek için kullanılan etiketleme konsantrasyonu olmuştur(bkz. Tablo 4) ampirik olarak belirlenir. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin. </li><li> Iki kez hücreleri yıkayın: süspanse hücreleri 10 ml 20 ° C RPMI% 5 FCS içeren. 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. Tekrarlayın. </li><li> Havuz birlikte bir pipet ile% 5 FCS içeren 8 ml 4 ° C RPMI kullanarak tek bir tüp içine tüm hücreler. Tortu, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanmış ve bir transfer pipeti ile Süpernatantı aspire. </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) PKH-26 Hücre etiketleme Not: STA&#39;lar fareler barındırmak için bir CD45 alotipik farkı ifade hücreleri ile inşa edilemiyorsa, bunlar, alıcı hücrelerin kendi ayrımcılığa izin PKH-26 ile etiketli olabilir. <ol><li> Havuza alınan hücre pelletine 2,9 20 ° C ml PBS ilave edin ve bir pipet ile iyice yeniden süspanse edin. </li><li> Bir hayır hücre süspansiyonu ekleyinn tüpünün üst yarısı ıslak dikkat ederek, 10 ml tüp ıslatılır. </li><li> Tüp kapağını çıkarın ve yatay tüp yatıyordu. </li><li> Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına (PKH-26 boya setinde) seyreltici C 58 ul ve bu 1 mM stok PKH-26 42 ul ekle. </li><li> Tüp kap ve iyice karıştırın boya ile hücre çözümü karıştırın. </li><li> , Oda sıcaklığında (20 ° C), 10 dakika içinde en az hücreleri inkübe edin. </li><li> Iki kez hücreleri yıkayın: süspanse hücreleri 10 ml 20 ° C RPMI% 5 FCS içeren. 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tortu Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. Tekrarlayın. </li></ol></li><li> Konak hayvanların içine enjekte STA Not: in vivo T hücresi tepkilerini ölçmek için, FTA aktif bir bağışıklık tepkisi ve en fazla 24 saat boyunca yerinde kalan hayvanlara enjekte edilir. Bu FTA de negatif bir kontrol olarak saf bir hayvan içine enjekte edilir önemlidir.<ol><li> Toplamı ve PBS içinde ml başına 2.5 x 10 8 hücre hücreler tekrar süspansiyon. , Bir kontrol olarak saf bir hayvan da dahil olmak üzere, damar konakçı hücrelerin farelere 200 ul enjekte edilir. </li></ol></li></ol> 3.. Sitometrisi <ol><li> FTA enjeksiyon hasat kan ve dalak (ya da ilgili diğer dokularda) ana farelerden sonra 18-24 saat. </li><li> Bir 70 um ile ezme dokulardan tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması 5 ml şırınga pistonu ile gözenekli elek. </li><li> % 0.1 BSA içeren PBS içinde 65 x 10 6 hücre / ml &#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Antikor etiketleme için bir mikro-titrasyon plakasının oyuklarına hücre süspansiyonu 100 ul alikotları dağıtın. </li><li> CFSE, CTV ve CPD Işıksal uyumlu floresan ile florokromla etiketli antikorlar ve floresan canlılığı probları ile etiket hücreleri. Not: B220 ve bu CD69 gibi aktivasyonu gibi hücre işaretçileri B antikorlar FT kullanılıyorsa B hücresi aktivasyonunu ölçmek için gerekli olanA T H hücresi tepkilerini ölçmek için 2. STA&#39;lar ve ev sahibi fareler bir CD45 alotipik fark varsa CD45.1 ve / veya CD45.2 bir antikor içerir. </li><li> Karıştırın ve 30 dakika boyunca buz (4 ° C) üzerinde inkübe, hücre 100 ul alikotları (% 0.1 BSA içeren PBS içinde) antikor / uygunluğu boyaların 2x stok çözeltisi 100 ul ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler ve süpernatant Sediment çıkarın: hücreleri yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile 200% 0.1 BSA ihtiva eden PBS ul, tortu hücrelerinde hücreler yeniden süspanse edin ve supernatant çıkarın. </li><li> Bir 70 um ağ üzerinden% 0.1 BSA, filtre hücrelerini içeren ve ilgili floresan boyalar ve eşlenikleri saptayabilen bir akış sitometresinde akış sitometrisi ile analiz PBS içinde 400 ul toplam hacim içinde süspanse hücreler. Her FTA hücre küme çözmek için 3 x 10 6 lenfosit olaylara kadar toplayın ve istatistiksel için yeterli hücre eldecal analizi. Not: akışı için (örneğin tek lekeli kontrolleri gibi) tüm tipik kontrolleri olun sitometri istihdam edilmektedir. Tipik olarak, CFSE bir mavi lazer kaynağı (tipik olarak 488 nm) ve 520 nm üzerinde merkezli bant geçiren filtreler ile algılama uyarma gerektirir; CTV mor bir lazer kaynağı (tipik olarak 405 nm) ve 450 nm üzerinde ortalanmış bant geçiş filtreleri ile uyarılmasını gerektirir algılama; ve CPD kırmızı bir lazer kaynağı (tipik olarak 633 nm veya 640 nm) ve 670 nm üzerinde merkezli bant geçiren filtreler ile algılama gelen uyarma gerektirir. </li></ol> 4.. Veri Analizi <ol><li> Standart akış sitometri yazılımı kullanarak veri akış sitometri analiz (istihdam yolluk strateji türüne bir örnek için temsili bir sonuç bakınız). </li><li> % Spesifik öldürme için, MHC sınıf-I ve-bağlama peptidleri (&quot;Nil&quot;) pulse peptidler değildi FTA kümeleri ile doldurulan her FTA hücre kümedeki hücre sayısını hesaplar ve hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılarak% Spesifik Öldürmek. % Spesifik Killing <img alt="Formül" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51627/formula.jpg" width="200" /> Not: &quot;astar&quot;, yukarıdaki formül &quot;naif&quot;, &quot;peptit&quot; ve peptidler &quot;sıfır&quot; ile darbeli hedefleri belirtir, naif hayvanları hedeflere belirtir, hedef peptide karşı bir bağışıklık tepkisi olduğu düşünülen hayvanlardan hedefler belirtir olarak Herhangi bir peptidlerle pulse olmayan hedeflere anlamına gelir. </li><li> B hücre aktivasyonu, T H aktivitesinin bir ölçüsü olarak, en GMFI çıkarma &quot;prime&quot; hayvanlarda MHC sınıf II-bağlama peptidleri ile ve bu darbeli FTA B hücrelerinde CD69 antikor Horasanın geometrik ortalama floresan yoğunluğu (GMFI) hesaplamak T H etkinliğinin bir ölçüsünü vermek üzere &quot;naif&quot; hayvanlarda karşılık gelen FTA B hücreleri üzerinde CD69 ekspresyonu. </li><li> Adımları 4.2 ve 4.3, kullanım üretilen istatistiklerindenBu tür eğri ve EC 50 altındaki alanda (EAA bu hesaplamalar için yapılır nasıl derinlemesine açıklama gibi diğer nicel ve nitel parametreleri hesaplamak için böyle GraphPadPrizmasındaki gibi matematiksel hesap tablosu yazılımı bulunabilir http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm ve EC50 için: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm). </li></ol>

<ol>
	<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+target+array+killing+assay:+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo.">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+target+array+T+helper+assay:+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4++T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo.">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li><li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes.">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li><li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens.">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li><li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+multi-gene,+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines.">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li><li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb/C+mouse+model.">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li><li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule.">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry.">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li><li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+(CFSE)+to+monitor+lymphocyte+proliferation.">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VITAL+assay:+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo.">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li><li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection.">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li><li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response.">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li><li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer/antigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays.">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li><li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells.">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies.">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li><li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+(ELISPOT)+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells.">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li><li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells.">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance.">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

FTA bazlı deneylerde avantajı, akış sitometrisi ile, tek bir konak hayvandan&gt; 250 uygulanabilir ve tamamen işlevsel bir hedef hücre popülasyonlarının ayrımcılık sağlamasıdır. Bu, daha önce mümkün olmamıştır in vivo akış sitometri esaslı tahliller için karmaşıklık düzeyi sağlar. Bu 6 konsantrasyonlarda 7 farklı viral epitoplara yanıtlar, AUC ve EC 50 gibi parametreler in vivo T hücresi tepkileri için belirlenecek izin veren tek bir hayvanda aynı anda 6 te...

T hücreleri, adaptif bağışıklık yanıtında merkezi bir rol oynar ve genellikle immünoterapide manipülasyon için hedeflenir. CD4 + efektör T hücreleri, bağışıklık birçok yönlerini düzenleyen ve aynı zamanda doğrudan antikor üretimi için B hücrelerinin yardımcı olabilir sitokin salgılayarak yabancı antijene yanıt. CD8 + sitotoksik T hücreleri (CTL &#39;ler) aynı zamanda sitokin salgılayarak hem de doğrudan yabancı bir antijeni eksprese eden hücreleri öldüren bir rol oynayarak, yabancı antijene yanıt verebilir. Bu T hücre efektör işlevi başlatır temel etkileşim hücre yüzeyi üzerinde MHC molekülleri üzerinde görüntülenen yabancı peptidler ile T hücre reseptörü (TCR) etkileşimini içerir. CD4 + T hücreleri, tipik olarak bir mikrop bulaşmış hücreler üzerinde gösterildi MHC sınıf I molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin kabul antijen sunan hücreler ve CD8 + T hücreleri üzerinde MHC sınıf II molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin tanır. SıraylaT hücreleri, bir immün tepkisi oynadıkları rolünü değerlendirmek için, onların efektör fonksiyonları, güvenilir ve hassas tekniklerle ölçülür esastır. T hücresi yanıtı değerlendirilmesi için yaygın yöntemler arasında; MHC class-I/II/peptide Tetramer tepkime; ELISPOT ve hücre içi sitokin lekelemesi ile sitokin üretimi; ve 51 Cr-salım deneyleri ile öldürme kapasitesi. Bu deneyler, ancak, tipik olarak in vitro stimülasyon ile ex vivo olarak veya T hücre fonksiyonunun içine sınırlı bir bilgi sağlar edilir. T hücresi tepkilerini ölçümü için in vitro uyarılması yoluyla oluşabilir fonksiyonel parametreler değişiklikleri önlemek için bu nedenle T hücrelerinin herhangi bir manipülasyon ile, ortaya İdeal olarak, bu in vivo, in situ onları değerlendirmek için yararlı olacaktır. En sık vivo T hücresi işlevsel tahlillerde kullanılan bazı in vivo olarak numaralandırılır MHC sınıf I-bağlama peptidleri ile darbeli hedef hücrelerin CTL aracılı öldürme, ölçme dayanmaktadırBöyle CFSE gibi hayati boyalar ile floresan etiketleme yoluyla algılama ile. Bunlar, in vivo deneylerde ne zaman bu tür hedefleri CTL aracılı öldürme izleyebilir olsa da, daha önce nitel parametreleri, izin vermek için gerekli olan, farklı konsantrasyonlarda ve peptit epitoplarının farklı sunulması, birden fazla hedefin öldürülmesini değerlendirmek için nispeten sınırlı bir kapasiteye sahip olması fonksiyonel aviditesi ve epitop varyant çapraz reaktivite değerlendirilecektir. Bu deneyler, aynı zamanda CD4 + T hücre aracılı tepkiler üzerinde herhangi bir bilgi vermemektedir. Son zamanlarda tek bir hayvanda aynı anda&gt; 250 hedef hücrelere karşı T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar floresan hedef diziler (STA) göre çok katlı bir analiz geliştirdik, T hücresi tepkilerini değerlendirmek için kullanılan mevcut yöntem ile sınırlamaları birçok üstesinden gelmek için, 1, 2 akım sitometri. FTA sev ile etiketlenmiş lenfosit oluşmaktadırBenzersiz floresans&gt; 250 hücre kümeleri elde edilecek sağlayan CFSE, CTV ve CPD gibi vital boyaların eral konsantrasyonları ve kombinasyonları yer alır. Bu hücreler, canlı ve bütünüyle işlevsel olarak kalmaları için, bunlar, in vivo 3 efektör T hücreleri ile etkileşimi izlenmesini sağlamak için hayvanlara enjekte edilebilir. Örneğin, FTA hücre kümeleri, hedef hücrelerin 1 antijen spesifik CTL aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için MHC sınıf-I-bağlama peptidleri ile pulse edilebilir. Buna ek olarak, FTA hücre kümeleri imkan veren, MHC sınıf II-bağlama peptidleri ile doldurulan edilebilir antijene spesifik T yardımcı hücresi örneğin CD69, CD44 ve / veya aktivasyonu ile değerlendirilmesi (aktivasyonunun değerlendirilmesi ile (T H) aktivitesinin değerlendirilmesi soydaş peptid 2 taşıyan FTA içinde B hücrelerinin CD62L). 250&#39;den fazla hedefler aynı anda tespit edilebildiğinden, bu n ile doldurulan çok sayıda hedef hücre kümeleri karşı CTL ve T H tepkilerini ölçmek mümkündürfarklı konsantrasyonlarda ve pek çok kez tekrarlanabilir ve de dahil umerous peptidler. FTA tahlil bu nedenle in vivo T hücre efektör cevabının değerlendirilmesinde görülmemiş bir düzeyi sağlar. Burada ayrıntılı olarak FTA yapımını tarif ve in vivo olarak T hücresi tepkilerini değerlendirilmesi uygulanabilir şeklini göstermektedir. Prosedür, MHC sınıf I ve II-bağlama peptidleri ile doldurulan 42 hücre kümelerinin 6 tekrarlar oluşan üç vital boyaların kullanımı yoluyla 252 belirgin bir hücre kümeleri içeren bir FTA birlikteliğinin yapımını da açıklar. Etiketleme miktarını azaltmak için gerekli olan 42 hücre kümelerinin etiketleme tüpleri dipli, 10 ml konik ortaya çıkar ve bu da Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi bir tüp rafa bu hazırlamak için yararlıdır. Bu yöntem, ayırt kümelerinin daha küçük sayıları için ayarlanabilir her bir boya 1 uygulandı. Biz, bu tepkiler kazanmakla ölçebilir gösteren ile tahlilin programı vurgulamakFarelerin bir küçük hasta birden fazla epitoplara karşı rekombinant çiçek hastalığı virüs aşısı tarafından üretilen es. Bu, FTA deney sırasıyla yoluyla eğrisi (AUC) değerlendirmeleri ve yarı maksimal tepkileri (EC 50) oluşturmak için gerekli etkili peptid konsantrasyonunun ölçülmesi altındaki alan kullanımını kümülatif yanıtları ve fonksiyonel avidite ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:71px;">Serana</td>
			<td style="width:119px;">FCS-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CTV</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C34557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CFDA, SE</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CPD</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0840-90</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-B220 PerCp-Cy5.5</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">110730</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-CD69 brilliant violet 605</td>
			<td style="width:71px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104529</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">PKH-26</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Material Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source)</td>
			<td style="width:71px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of fluorescent target arrays for assessment of t cell responses in vivo

In vivo T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi ve immünoterapilerin tasarımı için önemlidir. Ve kırmızı lazer heyecanlı boyalar (Hücre Çoğalma Boya eFluor 670: İşte biz böyle carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE), mor lazer heyecanlı boyalar (CTV CellTrace Violet): hayati boyalar kullanır floresan hedef array (FTA) teknolojinin kullanımını tanımlamak CPD )&gt; 250 belirgin bir floresan hücre kümeleri haline etiketli fare lenfositlerinin kombinasyon yöntemiyle için. Bu STA içinde hücre kümeleri ana doku uyumu (MHC) sınıf-I ve MHC smıf-II bağlama peptidleri ile doldurulan ve bu şekilde sırasıyla CD8 + ve CD4 + T hücreleri için, hedef hücre olarak hareket edilebilir. Bu hücreler, FTA uygulanabilir ve tamamen işlevsel kalır ve bu nedenle, FTA hedef hücreler ve CD4 + T hücresi tasarlandığını yardımseverli CD8 + T hücre aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için farelere verilebilirlerakış sitometrisi ile in vivo gerçek zamanlı olarak FTA B hücresi, hedef hücrelerin, s. &gt; 250 hedef hücreler aynı anda değerlendirilebilir bu yana, çeşitli teknik konsantrasyonlarda ve birden fazla kez tekrarlanmış çeşitli epitoplara karşı antijen T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, bu teknik, bir sayısal (yanıtın örneğin kümülatif büyüklük) ve niteliksel (örneğin,. Fonksiyonel aviditesi ve yanıtı epitop çapraz reaktivite) seviyesinde hem de T hücresi tepkilerini ölçebilir. Burada, bu FTA inşa edilmiş ve bir rekombinant çiçek virüsü aşısı ile uyarılan T hücresi tepkilerini değerlendirmek için uygulanabilir bir örnek vermek vardır açıklanmıştır.

FTA deneyinin kullanımına ilişkin bir örnek olarak, BALB / c fare, HIV-I CTL epitopuna HIV-I epitopların (VV-HIV) ile ifade edilmek rekombinant aşı virüsü (VV) ile bağışıklı hale getirilmiştir, Gag, Gag mut, Env ve Pol, VV CTL epitopları F2L ve F2L mut ve HIV-I T H hücresi epitopu, Gag Th (2 de tarif edildiği gibi) bir 252 parametre FTA deneyi (Şekil 1 B) kullanılarak değerlendirildi. Gag (Gag mut) ve F2L (F2L mut) epitop varyantları VV-HIV vektörü içinde i...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo at JoVE.com

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak&gt; 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

the-use-fluorescent-target-arrays-for-assessment-t-cell-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

14.3K Görüntüleme.  Australian National University.  In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak> 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder. 

Video: The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...