This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1.. Fly Kültürler, Çözümleri ve Embriyo Taşıma Cihazlar hazırlanması <ol><li> Drosophila bir kafes kültürü hazırlayın. 10 cm üzüm-agar plakası ve maya macun bir nokta ile donatılmış bir kafes nüfus istenen soyunun 500 + çiftleşme sinekler yerleştirin. 25 ° C nem kontrollü inkübatör kültürünü korumak. Not: &#160; Cage kültürler tutarlı embriyo döşeme desenleri elde etmek için klima bir veya iki gün gerektirir. Maya hamur ile üzüm plakaları klima sırasında sabah ve bir kez akşam bir kez değiştirilir. </li><li> EPS hazırlayın. 37 ° C de yüzey aktif maddeler (kokamid DEA ve etoksillenmiş alkol) sıcak çözeltiler Pipet Küçük bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir cam sintilasyon şişesine d-limonen 18 mi. Pipet d-limonen 1 mi, iki yüzey (her biri% 5 nihai konsantrasyon) her biri. İyice karıştırın ve karıştırma çubuğu çıkarın. Not: EPS Bu stok çözeltisi, oda sıcaklığında yaklaşık 2 ay için iyidir. Çözelti37 ° C&#39;de ısıtıldı ve tam kullanımdan önce yüzey aktif çözünür hale getirmek için döndürülmüştür olmalıdır. Zaman içinde bir plastik çözülür gibi EPS ve d-limonen, bir cam kap içinde saklanmalıdır. </li><li> Embriyo dechorionation çözüm, kuluçka ortamları, boya ve ilaç çözümler hazırlayın. 25 ml H2O ve sığ bir kaba yer ağartıcının 25 ml karıştırın. Önceki reçeteye 1,12 göre modifiye temel kuluçka ortamını (MBIM) ve MBIM-T hazırlayın. Shields hazırlayın ve (Malzeme listesi) üreticinin protokolüne göre M3, hücre kültür ortamı ve PBS Sang. DMSO içinde 10 mM konsantrasyonu permeabilizasyon boyasının bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> Embriyo işleme cihazları ve malzemeleri birleştirin: <ol><li> Dechorionation ve EPS tedavi sepeti (Şekil 1A bakınız) hazırlayın. Ince dişli bir testere ile bir tek 50 ml polipropilen santrifüj / kültür tüpü bir 3 cm bölümü kesin. Yapıştırılır Zımpara üzerinde tüp bölümü sürtünme tarafından kaynak yüzey floş olunbir tezgah üstü yüzeye. Kaynak, bir alev üzerinde tüp bölümün ağız eritilmesi ve bir cam plaka üzerine örgüye basarak Nitex naylon elek tüp bölümü. Serin edelim ve ekstra örgü keserek. NOT: Sırf taraf ve alt ilgili adımlar artık çamaşır suyu ve EPS kapalı hızlı ve tam durulama için izin verir. Kaynak adımlar, davlumbaz altında gerçekleştirilmelidir. </li><li> Bir gelişme sepet hazırlayın. Kapağın kenarı ile aynı hizada bir 50 ml santrifüj / kültür tüpünün üst kısmı kesin. Çıkarın ve Şekil 1B&#39;de gösterildiği gibi, kenar boyunca bir orta açıklık ve çentiklere keserek kapağı değiştirin. Tel üzerinde ve kesilmiş boru bölümünün konuları üzerinde vidalı kapaklı ve ekstra örgü kırpın. Not: kapak 60 mm rezervuar çanak (Şekil 1 B &#39;)&#39; de yer alan zaman bulk ortamına difüzyon izin jant çentikler içermektedir. </li><li> Bir slayt odasının bileşenleri hazırlayın. Daha büyük olan DO membran bir kare kesilmişslayt odası açma. Açıklığın iç dudak vakum gres çok ince bir tabaka uygulanır. Tutma halkası ile yağ karşı sızdırmazlık ağzına DO membran yapıştırın. Yakın tutma halkası için geri keserek aşırı DO membran kesin. NOT:. Slayt odası için Özellikler Kiehart ark 13 bulunabilir Bu bölme ticari olarak mevcut değildir ve bir makine atölyesi ile özel imalat gerektirir. </li></ol></li></ol> 2.. Sahneleme, dechorionation ve Embriyolar EPS Tedavisi <ol><li> Zamanlanmış bir kolleksiyon ile embriyolar evreleme. AM sinek kültür kafesine taze üzüm / maya plakasını ayarlayın. Embriyolar 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca döşenecek Veren Bu plaka atın ve 25 ° C&#39;de 2 saat daha sonraki bir embriyo döşenmesi için yeni bir üzüm / maya plakası ile değiştirin Daha gelişimsel evreleme için 18 ° C inkübatör bu plaka ve yeri toplayın. NOT: 25 ° C&#39;de 1 saat geliştirme gelişim 2 saat eşittir18 ° C&#39;de Geç dönem embriyo, EPS geçirgenliği muhafaza 25 ° C karşısında 18 ° C &#39;de yaşlanma etkisi Şekil 2&#39;de görülebilir. </li><li> Dechorionation. Yavaşça 25 ° C musluk suyu ve bir fırça kullanarak örgü sepet içine üzüm plaka kapalı embriyolar durulayın. Musluk suyu yumuşak bir akışı altında sepete embriyolardan aşırı maya durulayın. 2 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile sepet bırakın. Iyice musluk suyu akışı altında embriyolar yıkayın. NOT: hafifçe aralıklı plastik bir pipet kullanarak embriyolar üzerinde çamaşır suyu fışkırtma. 2 dakika tam Dechorionation için genellikle yeterli iken, kuluçkalama süresi, doğrudan incelenmesi ile kontrol edilir ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır. Musluk suyu içine daldırılmış sepete dechorionated embriyoların bakımı ve EPS aşamasından hemen devam edin. </li><li> EPS Tedavi <ol><li> Her PBS yaklaşık 10 ml ile 60 mm altı yemekler hazırlayın. 2.925 ml MTE 75 ul EPS eritilerek EPS seyreltme hazırlayınDöndürme ile bir 50 ml&#39;lik bir cam çanak içinde M (1:40). Not: Bu karışımdan beyaz bir emülsiyon biçimleri. </li><li> Silin bir laboratuvar ile örgü sepetin altından aşırı su kurutun. Beher içinde seyreltilmiş EPS sepet daldırın ve hemen sepetin alt EPS çözelti içinde embriyo dağıtmak için girdap. 30 saniye boyunca hareket dönen devam ediyor. Not: EPS seyreltmeler ve maruz bırakma süreleri geçirgenliği kontrol etmek için değiştirilebilir. Bu, en uygun EPS seyreltmeler ve tedavi süresi kullanılan sinekler suşları ile empirik olarak tayin edilmesi önerilir. 60-90 sn pozlama süresini artırmak aşamada 12 ve üzeri embriyolar için uygundur. </li><li> , Sepet kaldırmak silin bir laboratuvar ile aşırı EPS uzakta kurulayın. 60 mm tabaklar PBS, 10 ml altı ardışık yıkama devam edin. Yavaşça, altı yıkama her PBS ile embriyolar fışkırtma için plastik bir pipet kullanın. Boya geçin ve ilaç tedavisi adımlar. Not: EPS lavabo aşağı bertaraf edilebilir. </li></ol></li></ol>Permeabilize Embriyolar 3.. Boya ve İlaç Tedavisi <ol><li> Boya Tedavi <ol><li> 10 mM CY5 karboksilik asit boya *, bir 1.5 ml mikrofüj tüpe ve karıştırmak için girdap MBIM-T (50 uM son konsantrasyon) ve 1 ml 5 ul ekle. NOT: * boya seçimi alt analizi bağlıdır. CY 5 karboksilik asit tespit ve immüno-lekeleme kullanılarak daha sonraki analizler için etkilidir. Rhodamine B canlı embriyo analizi için yararlıdır. Rodamin B kırmızı emisyon ve onun metabolitleri 1 yeşil emisyon, floresan kullanan alt uygulamalar ile bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Ilaç veya toksini içerir, bu aşamada tedavi başlatmak için ya da bu aşamada bir pals için ilaç / toksin tedavisi sınırlamak için boya çözeltisine ilave edilebilir. Bakım MSDS ve çevre güvenlik standartlarına uygun olarak işlemek ve uyuşturucu ve toksinlerin atılması için alınmalıdır. </li><li> Bir fırça ile boya çözeltisine örgü sepet embriyolar aktarın. Tüpü Cap ve sağlamak için tekrar tekrar tersembriyolar boya çözeltisi içinde süspansiyon içinde serbestçe yüzer. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir sallanan rocker tüpü yerleştirin. </li><li> Nutator dan tüpünü çıkarın ve embriyolar razı olsun. Ince bir pipet ile boya çözeltisini çıkarın ve yıkama MBIM-T&#39;nin, 1 ml ile değiştirin. Tamamen embriyolar yeniden askıya tüp ters. Embriyolar razı olsun ve daha üç MBIM-T yıkar tekrarlayın. Son durulama tüm MBIM-T çıkarın ve inkübasyon adıma geçin. </li></ol></li><li> Embriyo Gelişimi için inkübasyon <ol><li> Gelişme sepet veya slayt odası: iki odadan birine embriyolar transfer. Not: gelişimi sepet uzun süreler boyunca gelişim tercih edilir, ve daha sonra sabitleme ve immüno-lekeleme adımları yürütülecek ise gereklidir. Slayt odası yüksek çözünürlük time-lapse görüntüleme için en uygun ve kısa gelişim dönemleri (örneğin, erken embriyonik olaylar) için etkilidir. Ilaç veya toksini çeşitli konsantrasyonları ve embriyo d ortama eklenebilirevelopment standart fiksasyon kullanarak ve protokolleri immünolekeleme canlı embriyolar veya bir ucundaki gerçek zamanlı olarak izlenebilir. </li><li> Sepetleri Kalkınma <ol><li> % 70 etanol ile oyuncak bir gelişme sepet temizleyin, de-iyonize su ile iyice yıkayın ve silin laboratuvar ile kuru kurulayın. Ilaç veya toksini istenen konsantrasyonuna sahip inkübasyon ortamının 6 ml hazırlayın. Kafes tabanının altında 60 mm çanak alarak bakım için değil tuzak hava kabarcıkları ortam içinde gelişme sepetini yerleştirin. Not: Two ortam yaygın olarak kullanılır: 50:50 karışımı içinde tek başına MBIM veya MBIM/M3, ikinci daha uzun gelişme dönemlerinde daha etkili olması. </li><li> Bir fırça ile sepet bazında yüzey mesh geçirgenleştirilmiştir embriyolar transfer. Yavaşça çevreleyen rezervuar medya ile embriyolar fışkırtma. Bu ağ üzerinde bir tek tabaka içinde böylece fırça ile embriyolar dağıtılır. Not: Mikroskopi görüntüleme geçin ve pr Permeabilization ve canlılık özelliklerini değerlendirmekAyırma (adım 4). </li></ol></li><li> Slayt Odası Kalkınma <ol><li> Slayt odası ters çevirin ve açıklığın çevre üzerinde vakum yağ küçük bir boncuk uygulanır. Açıklık ÇO zarın yüzeyi üzerinde ilaç ya da toksin istenen miktarda ortam 150 ul koyun. Not: Two ortam yaygın olarak kullanılır: 50:50 karışımı içinde tek başına MBIM veya MBIM/M3, ikinci daha uzun gelişme dönemlerinde daha etkili olması. </li><li> Bir fırça ile medya damlasına geçirgenleştirilmiştir embriyolar transfer. Onları damla içinde zar üzerinde yerleşmek yapma embriyolar dağıt. </li><li> Dikkatlice böylece orta düzleştirme ağzına 25 mm dairesel bir lamel uygulanır. Yağ ile bir conta oluşturmak üzere lamel çevresi boyunca yavaşça bastırın. Not: (Adım 4) hazırlanması Permeabilization ve canlılık özelliklerini değerlendirmek için görüntüleme mikroskop geçin. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identipermeabilize Canlı Embriyolar bahsedilmekte <ol><li> Permeabilize embriyolar tespit. Bir dijital kamera ile donatılmış bir mikroskop ile epifluoresan altında embriyolar gözlemleyin. Sabit mikroskop ve kamera ayarlarını kullanarak çeşitli alanları (profil sarısı otoflüoresanı belirlemek için mavi dalga boyunda) görüntü kazanır. </li><li> Nispi floresan yoğunluğuna göre embriyo geçirgenliği belirler. Sepeti karşılamak için ve embriyoların manipülasyon sağlamak için büyük bir çalışma mesafesi olan bir stereo mikroskop kullanarak. Mikroskop programlanabilir XYZ aşamada, epifluorışıma aydınlatma ve bir dijital kamera ile donatılmış olmalıdır. Görüntü daha sonraki bir zaman noktasında aynı embriyoların yeniden değerlendirilmesine olanak maruz ve her embriyo görüntünün sahne pozisyon parametreleri kaydetmek için özen embriyolar (Şekil 3 temsili bir sonuç bakınız). Not: Boya alımı şekilleri, kullanılan boyanın, maruz kalma ve embriyo yaşı uzunluğuna bağlı olarak değişir. Geniş bir yelpazedetek bir preparat içinde boya alımı üzerinde tipik ve nüfuziyet derecesindeki varyasyonu göstermektedir. </li><li> , Embriyo tanımlayın. Permeabilize embriyo konumunu işaretlendikten sonra, oda sıcaklığında ya da 25 ° C &#39;de devam embriyo gelişimi Mikroskop için sepet veya slayt odasına dönün. Kanal mavi floresan altında gözlemlemek ve önceden belirlenen geçirgenleştirilmiştir embriyoların sarısı otofloresanm görüntü kazanır. Yumurta sarısı dağılım normal ilerleme göre uygunluğunun değerlendirilmesi (Rand ve diğerleri. 1 ve Şekil 3 &#39;de temsili bir sonuç bakınız). Not: Aydınlık mikroskopi ile gözlenir embriyo diğer morfolojik özellikleri uygulanabilirliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu canlılığı ile uyumlu geçirgenlik düzeyini kuran her bir boya ve ikinci sineği suşu ile deneysel olarak tespit edilmesi önerilir. </li><li> Permeabilize canlı embriyoların ilaç veya toksin etkilerini değerlendirir. </li><li> Prosedürü EmbriyolarYukarıdaki protokol geleneksel bir dizi için hazır edilir ile bastırılacaktır ilaç veya toksini maruz kalma sonucu daha sonra analiz eder. Analizlerin çeşitli türlerde birçok aşağıda Tartışma kabul edilir ve doğrudan canlı embriyoların morfolojilerinden gözlem yanı sıra post-tespit İmmünoboyama analizleri içerir. Bu yaklaşımların her ikisi de gen ekspresyonu ve hücre soy ve morfolojisi profillerini ortaya vital boyaların (örn., GFP) kullanılarak geliştirilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis.">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li><li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation.">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li><li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes.">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li><li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique.">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li><li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microscopic+methods+for+the+analysis+of+cellular+movements+in+Drosophila+embryos.">High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos.</a> Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).</li><li>Patel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology.">Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yukarıdaki yöntem, geniş bir gelişim aralığında küçük molekül tedavileri için erişilebilir uygun bir Drosophila embriyoların elde edilmesi için bir yöntem açıklar. Bu yöntem daha önce sadece erken evre embriyolar görüldüğü gibi 18 ° C&#39;de embriyolar yaşlanma aynı etkinlikte geç evre embriyoların geçirgenliği sağlayan yeni ve basit bulma tanıttı. Buna ek olarak, geçirgenlik göstergesi olarak uzak-kırmızı boya CY5 karboksilik asidin kullanımı sonrası düzeltme uygulam...

Drosophila embriyo gelişimi 2 temel mekanizmalarının araştırılması için bir ilk örnek olmaya devam ediyor. Bu güçlü model, herhangi bir zaman noktasında ve herhangi gelişen organ içinde esasen herhangi bir genin manipülasyonlara izin moleküler genetik araçları geniş bir yelpazede tarafından desteklenmektedir. Drosophila embriyonun morfojenezinin küçük boyutlu, hızlı bir gelişme ve kapsamlı karakterizasyonu bu temel gelişimsel geçitler 3,4 ortaya birçoğu genetik ekranlar için seçim bir model olun. Drosophila embriyo çok sayıda fenotipleri özelliği ve kolay yorumlanabilir, genellikle anormal bir özellikten sorumlu yatan moleküler genetik mekanizmaları tanımlamak için bir araç temin edilmiştir. Tarihsel olarak, uçucu embriyo modelinin bir eksiklik embriyonik dokular için küçük moleküller tanıtan zorlanmasıdır. 1) bize: Bu engel üzerine sınırlamalar poz vardırsondalar gelişimsel mekanizmaları sorgulamak ve 2) uncharacterized küçük moleküllerin teratojenik veya farmakolojik aktivitesini değerlendirmek için Kurulan bu modeli kullanarak olarak bilinen biyoaktif küçük moleküller ing. Bunun bir sonucu olarak, sinek embriyonun tarama olası küçük molekül aktivitesinin karakterizasyonu atıl edilmiştir. Kabuğu 1) permeabilizasyon ve 2) mikroenjeksiyon: sinek embriyoya küçük moleküllerin teslim iki yöntem ile elde edilebilir. Bu makalede, bir Drosophila geleneksel laboratuar ortamında çalıştırmak kolay nüfuziyet yöntemine avans sunar. Bu teknoloji ile mikro-enjeksiyon ve arayüz yöntemlerinde son gelişmeler, aynı zamanda embriyo 5,6 bileşiklerin tanıtılması için yöntemler ile katkı olduğu not edilmelidir. Embriyoya molekülleri Tanıtımı kabuğu 7 bir yapışkan tabakası ile önlenir. Drosophila yumurta kabuğu beş tabakadan oluşur. Itibareniçten dışa bunlar: vitellin membran, mumsu tabaka, iç koryon tabakası, endochorion ve exochorion 8. Üç dış koryonik tabakalar seyreltik ağartıcı embriyonun kısa daldırma yoluyla kaldırılabilir bir adım Dechorionation olarak anılacaktır. Bu temel vitellin zar ile kaplı kalır maruz yapışkan katman daha sonra, geçirgen hale dechorionated embriyo gibi heptan ve oktan 7,9 gibi organik çözücüler, maruz bırakılarak tehlikeye girebilir. Bununla birlikte, bu çözücülerin kullanımı da toksisite ve embriyo canlılığı 9,10 Stark olumsuz etkileri vardır, her ikisi de güçlü su-geçirimli eylem düzenlenmesinde zorluğu nedeniyle komplikasyonlar getirmektedir. Çözücü, bir bileşim olarak adlandırılan embriyo geçirgenliği (EPS) kullanılarak nüfuziyet için bir yöntem olup, daha önce tarif edildiği 1 olmuştur. Bu çözücü miscibl olmak için solvent olanak d-limonen ve bitki-türevi yüzey aktif maddeler oluşmaktadırSulu tampon maddeler ile örn. D-limonen ve arzu edilen konsantrasyonlara kadar çözücünün seyreltilmesi için yeteneğinin düşük toksisiteye yüksek canlılığı 1 ile geçirgen embriyolar oluşturmak için etkin bir yöntem vermiştir. Bununla birlikte, iki endojen faktör uygulamaya sınırlamalar getirmek için devam etmiştir. İlk olarak, embriyolar ilgilenmek kapatmak gelişimsel evreleme korumak için alındığında bile, EPS tedaviden sonra geçirgenliği heterojenite göstermektedir. İkincisi, yaklaşık sekiz saatten daha eski yumurta 11 döşeme sonra ortaya kabuğunun bir sertleşme ile tutarlı, geçirgenliği zor kanıtlanmıştır embriyolar. Burada tarif EPS yönteminde gelişmeler bulunmaktadır: 1) sabitleme parçaları ve immüno-lekeleme adımlar yürütülür ve 2)&gt; (geç gelişim zaman noktalarında, 8 saat, sahne embriyo geçirgenliği sağlayacak sonra bile, yakın aynı permeabilize embriyolar tanımlanması ve analiz yardımcı 12 ve üzeri). Spesifik olarak, bir uzak-kırmızı boya uygulanması,CY5 karboksilik asit, geliştirme sırasında ve formaldehit tespit sonrası embriyo devam geçirgenlik göstergesi olarak hizmet vermektedir tarif edilir. Buna ek olarak, 18 ° C &#39;de embriyolar yetiştirme geç dönem embriyo (aşamalar 12-16) geçirgenliği sağlayan, bir EPS hassas halde yumurtaların muhafaza gösterilmiştir. Bu gelişmeler EPS metodoloji için daha önce sözü edilen sınırlamalarının üstesinden gelir. Bu uygulama, bu nedenle canlılığını korurken farklı gelişim zaman noktalarında embriyo ilgilendiren küçük moleküller tanıtmak için bir araç ile araştırmacılar sağlayacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

Drosophila embriyo uzun gelişimini kontrol moleküler ve genetik mekanizmaları ortaya çıkması için güçlü bir laboratuvar model olmuştur. Bu modelle genetik manipülasyon kolaylığı diğer hayvan modelleri ve hücre bazlı deneylerde olağan farmakolojik yaklaşımlar yerini almıştır. Burada gelişmekte olan meyve sineği embriyo küçük moleküllerin uygulama sağlayan bir protokol son gelişmeleri açıklar. Yöntem, embriyo canlılığını korurken kabuğunun geçirimsizliği aşmak için adımlar ayrıntıları. Gelişim aşamaları, geniş bir yelpazesinde Eggshell permeabilizasyon çözücü, daha önce tarif d-limonen embriyo nüfuziyet (1 EPS) uygulanmasıyla ve (18 ° C) daha önce uygulanan tedavilerin indirgenmiş sıcaklıkta yaşlanma embriyoların elde edilir. Buna ek olarak, bir permeabilizasyon göstergesi olarak bir uzak-kırmızı boya (CY5) kullanımı standart kırmızı, yeşil ve gribi kapsayan alt uygulamaları ile uyumlu olan, tarif edilmektedirCanlı ve sabit preparasyonlarda orescent boyalar. Bu protokol, gelişim mekanizmaları sonda olarak karakterize edilmemiş, küçük moleküllerin ya da teratojenik farmakolojik etkinliğini değerlendirmek amacıyla çalışmalar için biyoaktif bileşiklerin kullanılması çalışmaları için de geçerlidir.

Embriyo taşıma cihazları yukarıdaki Protokoller&#39;de manipülasyon için &quot;ev yapımı&quot; cihazları görselleştirme yardımcı olmak için Şekil 1&#39;de resmedilmiştir. Şekil 2&#39;de görülen sonuçlar gelişiminin geç safhalarında EPS ile geçirgen olması kabiliyetleri üzerinde 18 ° C &#39;de embriyolar yetiştirme güçlü etkisini gösterir. Bu durum protokol aşama 2.1 &#39;de uygulanır. Tipik olarak muamele edilmiş EPS embriyolar görülen geçirgenlik ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir.

Geçirgenliği için bir yöntem<em&gt; Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için&gt; Embriyolar

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.3K Görüntüleme.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir. 

Video: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biyoloji

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

, Epilepsi Mutants Nöbetler Neurocircuit Tahliller Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...