Yazarlar Deborah Harris ve Danielle MacKay özellikle borçlu. Bu iş için destek ve CWRU Sanat ve Sosyal Bilimler Fakültesi Biyoloji Bölümü tarafından sağlanan ve biyolojik bilimler alanında lisans eğitimi desteklemek için HHMI hibe numarası 52005866.

1. Görüntüleme Metodoloji <ol><li> Homojen bir sıvı hale gelene kadar 20-30 dakika boyunca 55 ° C derecede su banyosunda jöle gliserin eritin. Girdap, ancak kabarcık oluşumunu önlemek için, şişe sallamayın. </li><li> Jöle erir iken, gliserol, temiz bir cam slayt (isteğe bağlı) bir Kimwipe kullanılarak ince bir tabaka uygulanır. </li><li> Eritilmiş gliserin Pipet 1 ile 1,5 ml sütü slayt yüzeyde ince bir katman yaratmak için bir kesim P1000 pipet kullanarak. Kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde Pipet. </li><li> Jöle yatay bir yüzey üzerine 5 dakika, 5 dakika sonra -20 ° C&#39;de slayt yerleştirmek ve embriyo uyumuna devam katılaşmaya. Alternatif olarak, Saran Wrap slayt kapak ve 5 güne kadar 4 ° C&#39;de yerleştirin. </li><li> Pipet jöle yatak tarafında% 70 gliserol / PBS veya diğer antifade gliserol tabanlı montaj ortam (örneğin Slowfade veya Vectashield) lekeli embriyoların küçük bir damla. </li><li> Jöle yüzeyine açılan tek tek aktararak embriyolar ön hizalama başlayın. Eğimli tarafı bir kaşık kullanarak, eğimli bir derialtı iğne kullanarak aktarabilirsiniz. </li><li> Kabaca embriyoların 2 ile 3 sütun boyunca yerleştirin. Bir embriyo iğne takılıyor içeren diğer embriyolar serbest bırakmak için açılan karıştırın. Bu noktada dikkatli bir şekilde hizalamak zaman israf etmeyin. Sütunlar arasında biraz boşluk bırakın. </li><li> Derialtı iğne yardımı ile jöle orta yatay sürgülü embriyolar hizalayın. Iken sürgülü, yönlendirmek, aynı yönde başları ve kuyrukları. Sütun boyunca birbirine paralel olun. Bükülmüş Kimiwipe bir parça bir iz olarak sol PBS gliserol fazla çıkarın. Not: Fazla gliserol, iki jöle tabakalarının ayrılması zor kesilmiş ve monte etmek için, embriyolar jel içinde gevşek kaplı olması neden olacaktır. Tersine, çok gliserol kaldırarak kuru ve embriyolar dümdüz olacak. </li><li> Embriyolar (50-150 mcL kaç uyumlu hale getirilmiştir bağlı olarak) üzerinde ince bir tabaka jöle yaymak için bir kesme sarı ucu kullanın. </li><li> Yeri -20 ° C derin dondurucuda 10-20 dakika süreyle 4 ° C gecede slayt veya depolamak. Jöle tamamen kesmeden önce sert emin olun. Aksi takdirde, embriyo blok tüketim için çok zor olacak. Kesim için en iyi sonuçları ertesi gün elde edilir. </li><li> Diseksiyon kapsamında, jöle ile hizalanır embriyoların her iki tarafta tamamen kesmek için jilet kullanın. Jileti düz kesimler yapmak için bir 90 ° açıyla tutun. Önlemek için aşırı jöle görüntüleme engel olabilir embriyoların ön ve arka kutupları çok yakın kesimler yapılmalıdır. </li><li> 100-200 mcL soğuk PBT (4 ° C, PBS +0.1% Tween 20) keser ve dikkatlice bir spatula ile embriyoları arasında jöle kazıyın. Not: PBT olarak deterjan, jöle embriyoların zarar vermeden slayt çıkarılması yardımcı olur. </li><li> Bir iğne kullanarak, daha fazla kesim için temiz bir slayt gömülü embriyolar ile jöle blok transferi. 5-7 embriyolar ile küçük blokları kesin. PBT jöle blok etrafında kolayca taşımak için kullanın. Alternatif olarak, tam gerekirse, jöle kırparak için daha fazla istikrar yaratan cam, verdikleri izin vermek, kuru bir cam yüzey blok yerleştirin. </li><li> Dik bir jilet ve bir iğne yardımı ile jöle gömülü embriyolar çevirin. Mikroskop altında görselleştirme için kullanılan standı mikroskobun tipine göre, aşağıdaki iki adım ikisinden biri ile devam edin. </li><li> Ters mikroskop yer dik bir pozisyonda embriyolar, embriyo blokları uzun bir lamel üzerine tamamladı. Jöle en az miktarı ile embriyonun tarafına amacı ile daha yakın temas halinde olmasını sağlamak. </li><li> Dik mikroskop: &quot;destekler&quot; olarak kullanılan ve &quot;destekler&quot; arasında gliserol embriyo blok superglue ile yapıştırılmış dört # 1 lamelleri ile iki yığınlarının olun. Uzun bir lamel kullanarak yığınları Köprüsü. </li><li> Konfokal analizi için kullanılacak hedefleri bulmak için çalışma mesafesi kontrol görüntü embriyo ile tüm yol ya da sadece kısmen olsun. Örneğin, D. melanogaster embriyolar ~ 0.55 mm uzunluğunda ve tamamen Zeiss 20x Plan-Apo veya 40x LD Neo-Fluor amacı kullanarak görüntülü olabilir. Aşağıdaki web sitesi mevcut Zeiss hedefleri hakkında bilgi ve çalışma mesafelere göre hedefleri arama seçeneği sunar: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar Embriyoların değişmeden kalır, çünkü bu yöntem, embriyonun büyüklüğü ve gen ekspresyonu arasındaki mesafelerin hassas ölçümler yapmak üzere kullanılabilir. Şekil 1, biz nükleer leke DAPI (mavi), anti-Dorsal protein (kırmızı), sog mRNA (sarı) ve sna mRNA (yeşil) ile boyanmış bir blastodermin dönem embriyoların göstermektedir. Morfolojik süreçses, mezoderm invajinasyon (Şekil 2A, B) ve mezodermal hücreler (Şekil 3 ve 4) göç gibi aynı zamanda bu yöntemi kullanarak görüntülenmiştir olabilir. DV ekseni boyunca Farklı bir Z-pozisyonları Şekil 2-4 gösterildiği gibi, odak düzlemi değiştirerek elde edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Blastodermin aşamasında sağlam embriyonun Dik optik dilim mRNA ve protein çift boyama. Yerinde sondalar (sog ve SNA) ve primer antikor (anti-Dorsal) ile boyanan protein Hedef mRNA&#39;ların rakam gösterilir. DAPI çekirdekleri etiketlemek için kullanılmıştır. Sog ve sna ifade Dorsal ifade nükleer iken, sitoplazma apikal yer olduğunu unutmayın. Çekirdekleri bulunmaktadır sog doğmakta olan transkript güçlü sinyaller de bu büyütme görülebilir. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Sağlam bir gastrulating embriyo Dik görüntüleme. MRNA problar kullanılır ve kendi renkleri resimde belirtilmiştir. A) Bu aşamada, üç gen aynı Florlu (yeşil sna, sog ve DPP) ile boyandı Not mekansal olarak ayrılmış alanlar olarak ifade edilir. Invaginating mezoderm sna ifade neuroblast tabakası ind ifade ve sog ifade hala sinir sistemi ventral bölgelerinde mevcut ise ektoderm, DPP ifade eder. B) aynı embriyo konfokal daha derin bir düzlemde şiddetle sna ifade invaginating mezoderm taban notu, ancak apikal bölgenin düşük seviyelerde ifade. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Salyangoz, ind ve DPP mRNA&#39;ların (yeşil), dorsal protein (kırmızı); mikrop bant ile sağlam embriyonun Dik görüntüleme sog RNA (sarı) genişletilmiş. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Embriyonun baş yakınındaki A) Odak düzlemi. B), aynı embriyonun gövde bölgede başka bir odak düzlemli. Ventral orta hatta yakın bir mikrop-band uzatılmış embriyonun her iki tarafta yalan yanal göç önce mezodermal hücreler (Şekil 4 karşılaştırmak) Not kitle. Yaymaksızın neuroblasts yeşil (ind ve sna) etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Dik görüntüleme germ bant uzatma süresi boyunca sağlam bir embriyo sog RNA (sarı), salyangoz, ind ve DPP mRNA&#39;ların (yeşil), dorsal protein (kırmızı). A), epitel (ok) yaymaksızın neuroblasts Not Bu aşamada (yeşil) ind ve sna hem boyandı. Sog kısıtlı ifadesi ventral orta hat (sarı) de unutmayın . Bu aşamada DPP İfade embriyo (yıldız) lateral kenarlarında görülebilir. B) aynı embriyo Optik bölüm sonuna yakın, orta-arka bölgeye karşılık gelen embriyo uzunluğu, A gösterilir. Ventral orta hat hücreleri sog lekeli.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Dilimleri 2 veya genellikle floresan renklendirmeler için zararlı mikrotom işleme, gömülü medya kullanımı ya dikkatli bir yandan diseksiyonu gerektirir beri Drosophila embriyoların kesit görüntüleri almak zor olabilir. Alternatif olarak, Z-Konfokal mikroskop yapılan yığınları kesit görüntülerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapmak için kullanılabilir. Ancak, doğru bir 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve photobleaching sorunlu olur, birkaç ince Konfokal dilim yapmak için zaman alıcı. Boylamasına monte edilmiş görüntüleme embriyolar, aynı zamanda, protein ya da mRNA seviyeleri 1 ölçümü amacıyla floresan sinyallerin hassas ölçümler alarak karmaşıklaştırır embriyo, daha derin bölümleri ulaşıldığında meydana gelen ışık saçılması başka endişe konusu. Hatta bir iki foton konfokal mikroskop, ışık saçılması hala sınırlı olmak üzere en iyi örnek şeffaflık için montaj medya seçimi yapar embriyo, ortasında sarısı malzeme opaklık nedeniyle bir konudur. Bu sorunları aşmak için, dikey konumlandırma embriyoların &quot;End&quot; görüntüleme adı verilen yeni bir tekniği son 4 canlı ve sabit örnekleri görüntü için geliştirilmiştir . Bu çalışmada, biz yerinde sondalar 3 birden fazla lekeli herhangi bir boyut ve şekil sabit embriyolar veya dokular basit bir hazırlık ve görselleştirme sağlayan dikey olarak monte edilen embriyolar için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bizim yöntemi jelatinimsi bir tutarlılık içinde uyumlu embriyoların kaplamak için kullanılır montaj medya kullanılarak oluşur. Konfokal mikroskop her türlü görüntüleme önce gömülü embriyoları içeren bu montaj medya kesme taş blokların dik olarak konumlandırılmış olabilir. Embriyoların jöle içine gömme ve dikey olarak konumlandırma, embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca hücreler aynı anda sunulduğu mikroskopisi kullanılarak yatay kesitler almak mümkün. Bu ışık saçılması ve boylamasına monte edilmiş embriyolar geleneksel Z-yığın yeniden yapılanma oluşur floresan boyaların photobleaching artık ortadan kalkar sorunları beri kantifikasyon amaçlar için önemli bir gelişme. Dorsal-ventral zıt pozisyonlarda bulunan hücreler aynı anda ve aynı konfokal Z-pozisyon imaged Böylece, dorsal-ventral eksen boyunca gen ekspresyonu veya protein düzeylerinin ölçümü, doğru. Buna ek olarak, açıklanan yöntem bize DV 6 eksen boyunca farklı pozisyonlarda hücreleri görselleştirmek için karmaşık hesaplama unrolling yöntemleri kullanmadan, 3-D bir embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca tam bir 2-D görüntü elde etmesini sağlar. Bazı kritik adımlar, iki tabaka jöle arasında bölünmüş önlemek için, embriyolar hizaladıktan sonra aşırı gliserol kaldırarak içerir. Ancak, örnek çok susuz ise, elde edilen görüntü şekilsiz olabilir ve yanlış morfoloji var. Buna ek olarak, embriyonun çevresindeki jöle orta yerine düz bir açıyla kesilmiş ise, ortaya çıkan görüntü, 90 derece dışında bir açıyla embriyoların yanlış bir konumlandırma şekli nedeniyle, daha yuvarlak ve daha fazla yumurta görünebilir. Son olarak, jöle, ön / arka ucunda embriyonun yeterince yakından kesmek değilse, amacı, çalışma mesafesi esas jöle ve embriyo içine odaklanmak için kullanılır, çünkü uygun bir görüntü elde etmek mümkün değildir. Önemli bir adım daha görüntüleme geç gastrulating embriyo hizalayarak önce dikkatlice kapsamında ilgi aşamaları sıralamak için zaman gerekli olabilir. Genellikle uzunlamasına bir pozisyonda en kolay kabul edilebilir morfolojik özelliklerine göre, embriyolar sahnelenir. Bu yöntem ile yapılabilir alternatif değişiklikler arasında, bir anti-solmaya reaktifi (örneğin, p-Phenylenediamine&#39;nin veya PPD), floresan boya photobleaching karşı korunmasına yardımcı, jöle, ikinci katmanı içine dahil etmektir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Birkaç iyi bilinen morfogenetik gradyanlar ve hücresel hareketler / dorsal ventral eksen boyunca meydana<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo. Ancak, bu süreçler görüntülemek için kullanılan güncel teknikleri biraz sınırlı. Aşağıdaki protokol, sabit ve etiketli montaj için yeni bir teknik açıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Konfokal görüntüleme ile koronal görüntülemek için embriyo. Bu yöntem, gliserin jöle montaj medya iki kat arasında embriyolar gömme oluşur ve görüntüleme jöle şeritleri dik olarak konumlandırılmış. Embriyolar sandviç için ilk adım, bir slayt üzerinde gliserin jöle ince bir yatak yapmak için. Daha sonra, embriyolar bu yüzey üzerinde dikkatle hizalanmış ve jöle ikinci bir tabaka ile kaplıdır. Ikinci kat katılaşmış sonra, jöle şeritler kesilir ve görüntüleme için dik çevrileceği. Alternatifler embriyoların mikroskop standı kullanılmak üzere türüne bağlı olarak görselleştirmek için açıklanmıştır. Dorsal-ventral eksen boyunca tüm hücreleri tek bir konfokal Z-düzlemi içinde görüntülü olduğu için, yöntem boylamasına monte embriyoların 3D rekonstrüksiyonlar ortak saçılma photobleaching veya ışık olmadan, hassas ölçüm ve floresan sinyallerin karşılaştırma sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Burada lekeli için bir montaj protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Mikroskopisi kullanarak kesit görüntüleme sağlayan bir dik pozisyonda embriyolar.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Burada lekeli için bir montaj protokolü Drosophila Mikroskopisi kullanarak kesit görüntüleme sağlayan bir dik pozisyonda embriyolar.

Video: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biyoloji

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...