Susan Gerbi Heidi Smith ve David Lambert, sırasıyla, Sciara coprophila ve Ilyanassa obsoleta in vivo santrifüj test etmek için malzeme temini için teşekkür ederiz . Biz Welte laboratuar tekniği ve el yazması üzerinde yorum yapmak için üye teşekkür ederiz. In vivo santrifüj testin geliştirilmesi ve arıtma MAW NIGMS hibe GM64687 tarafından desteklenmiştir. Görüntüleri Şekil. 1 ve Şekil. 5E, F, daha önce 2 basıldı ve izni ile yeniden basıldı.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+Drosophila+embryos.">Quantitative microinjection of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 345-359 (2000).</li><li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes.">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li><li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior.">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=unpublished+observations.">unpublished observations.</a> , .</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos.">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport:+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar.">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li><li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos.">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li><li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

Kritik adımlar Agar agar konsantrasyonu yeterince yüksek olduğundan emin olun. Çok düşükse, santrifüj sırasında parçalanır ve embriyoların patlaması ya da rastgele odaklı olacak . Agar konsantrasyonu sadece biraz agar (4.3 adım aşırı AKM yeterince kurutulmuş veya yetersiz kaldırma) ıslak çok düşük ya da eğer varsa, santrifüj sırasında embriyoların deliklerinden dışarı float ve yanlış odaklı hale gelecektir. Agar çok ince dökülür, aynı zamanda çökmesi veya santrifüj sırasında çatlak. Organelleri, tek tek hücrelerin binlerce içinde tecrit olacak embriyolar cellularization aşamalarında ötesinde gelişmiş olduğunu emin olun, aksi takdirde, organellerin ayrılması (Şekil 5C) iş olmaz . Bir hücre aşamada genç embriyoların, organeller büyük mesafeler göç ücretsiz ve onların karakteristik yoğunluğuna göre birikir. Çok eski olan embriyolar analiz önlemek için, emin olun, (i) kadın, eski yumurta (adım 2.4), (ii) (adım 2.5) 3 saat veya daha az embriyolar toplamak, (iii) bırakmak için izin vermek için bir ön toplama agar içine gömmek için görsel cellularization aşamalarında önce embriyolar seçin (adım 4.2), (iv) cellularization (adım 4.6) sonuna kadar gelişimini önlemek için kısa bir süre gömme tutmak, ve (v) (adım 5.6) doğru katmanı yoktu embriyolar iptal . Santrifüj zaman eksik etmeyin. Bazı embriyoların sadece 10 dakika santrifüj sonra bile güzel katmanlarını göstermek rağmen, ayırma embriyo embriyoya tutarsızdır. 30 dakika spin yüksek tutarlı sonuçlar verir. Ayrıca, santrifüj sona erdikten sonra uzun süre santrifüj süresi daha uzun katmanları stabildir. Bu kullanmadan önce daha fazla embriyoların süreci zaman alır, bu uygulamalar için önemlidir (örneğin, nakli deneyleri için konfokal analizi için işlenen veya monte edilmesi gerekiyorsa). Olası değişiklikler Yumurta toplama ve adım 2 ve 3 1, 3, 9 koryon kaldırılması çok farklı protokoller var ve kullanılan embriyoların genç olanlar sürece burada açıklanan yanı sıra iş, yumurta verimi yüksek ve kesir yanlış sahnelenen embriyolar en aza indirilir. Ön-arka hizalama protokol posterior uç agar gömüldü ve ön ucu (Şekil 3) olduğu gibi tüm embriyolar yönlendirir. Bu yönelim, tutarlılık için iyi micropyle santrifüj (Şekil 1, 5) sırasında sivri ucunu bir dönüm noktası olarak kullanmak mümkündür, böylece. Ancak, uygulama ile, parlak alan mikroskobu ile lipit damlacık ve yumurta sarısı katmanları farklı bir görünüm santrifüje embriyoların yönünü ortaya çıkarmak kolaydır. Sonra iki ucunda olan embriyolar monte etmek mümkün olur; bu esneklik montaj sürecini hızlandırır. Yönlenimsiz santrifüj protokolün en çok zaman alıcı ve teknik açıdan zor yönü montaj agar embriyolar (adım 4). Bu iki kez (bir kez deliğe takın ve bir kez santrifüj sonra kurtarmak için) her bir embriyo dokunmadan gerektirir. Alternatif olarak, bir AKM ile dolu mikrosantrifüj tüpler içine adım 4.1 &#39;embriyolar transfer edebilirsiniz. Bu borular, mikrosantrifüj (13.000 rpm, 10-30 dak.) Santrifüj, embriyoları aynı zamanda tipik tabakası 10-13 . Bu değişim, bir çok hızlı bir şekilde aynı anda yüzlerce embriyo süreci sağlar. Ancak, katman olarak tutarlı değildir; embriyoların bir kısmını yukarıda protokol uygulanan daha yüksek santrifüj kuvvetler (~ 16.000 g) rağmen farklı katmanlar ortaya çıkmaz. Daha zorlu embriyoların yönünü değişkendir ve bir büyük embriyo ekseni çeşitli açılardan ayrımı izleyebilirsiniz gerçektir. Bu değişkenlik, deneyci, belirli bir embriyo santrifüj tüpüne nasıl düzenlenmiştir santrifüj sonra dışarı sıralamak için gereklidir. Sarısı otofloresans embriyonun en yoğun bölümü için bir belirteç olarak kullanımı ile güvenilir bir şekilde bunu yapmak için çok daha pratik ve daha fazla karar gerektirir rağmen, bu, çoğu zaman mümkündür. Örnek yeterli embriyolar varsa, bir embriyolar Şekil gibi düzenlenmelidir oldu bu örnekleri sıralamak mümkün olabilir. 1. Kendi yumurta kabuğu embriyoların Santrifüj koryon ilk 2 çıkarmadan adım 4 agar embriyolar gömmek için mümkündür. Bu yaklaşımda, toplama plakası üzerinde embriyolar Halokarbon yağ yerine adım 3.2 (Halokarbon koryon saydam döner)% 50 çamaşır suyu ile kaplıdır. Embriyolar uygun aşamalarında seçilmiş ve cımbız kullanarak yeni bir agar plaka transfer; cımbız, zarar, sadece yumurta filamentler kapmaembriyonun düzgün kaçınılmalıdır. Embriyolar ön yumurta filamentler agar delikten dışarı yapıştırma ile, 4.8 ile adım 4.4 gibi gömülürler. Embriyolar santrifüj ve adım 5.4 agar çıkardı sonra yumurta kabuğu,% 50 çamaşır suyu arıtma ile kaldırıldı. Yumurta kabuğu varlığında Santrifüj fiksasyon sonra devitellinization oranı (adım 6.2) artırabilir, ama santrifüj için doğru aşamalarında seçimi (4.2 adım) daha zordur. Uygulamalar Embriyo santrifüj ko deneyler, yani, eğer belli bir proteinin belli bir büyük organel lokalize sınamak için yararlıdır. Örneğin, Klar protein erken embriyonik lipid damlacıkları bulunan, henüz bu lokalizasyon sağlam embriyolar göstermek zordur. Bölümünde, Klar puncta ve lipid damlacıkları hem de sabit sahte ko ekarte etmek için, embriyo çevre 10 bol çünkü bu. Ancak, farklı bir tabaka haline santrifüj lipid damlacıkları konsantreleri, ve böylece, Klar sinyal ile ko 10 belirginleşmektedir. Benzer analiz, belirli histon gibi şaşırtıcı örnekler de dahil olmak üzere lipid damlacıkları 8, 13-15, 2 ve bir protein yayg mevcut olduğu durumlarda diğer proteinlerin lokalizasyonu net bir şekilde gösterdi, ancak lipid damlacıkları 8 zenginleştirilmiş. Embriyolarının gelişim aşamasında (adım 4.2) tarafından görsel olarak seçilebilir olarak, lipid damlacıkları 8, 15 proteinlerin gelişimsel düzenlenir işe tespit etmek bile mümkün . Çünkü görsel olarak ayrı bir &quot;kap&quot; lipid damlacıkları birikir lipid damlacıkları ile ko için test özellikle kolaydır, böylece başka marker veya leke bu katmanı tanımlamak için gereklidir. Aslında, çünkü kolaylığı ve potansiyel çarpıcı görsel sonuçları (Şekil 1, Şekil 5 D, E), bizim laboratuar aday protein, lipid damlacıkları lokalize olup olmadığını bir ilk test olarak artık rutin olarak bu tekniği kullanır. Prensip olarak, benzer ko çalışmaları Şekil diğer organellerin için çalışması gerekir. 1, muhtemelen dağıtım santrifüje embriyolar diğerleri (hücre içi parazitler de dahil olmak üzere) belgelenmelidir henüz için. Santrifüj sıkı bantlar organelleri konsantreleri bu yana, bu organeller zenginleştirilmiş bir kısmını izolasyonu kolaylaştırır. Bu yaklaşım, zaten içine donör embriyoların 2 nakli için lipid damlacıkları kurtarmak için kullanılır olmuştur. Ayrıca zenginleştirilmiş fraksiyonu (örneğin, 15 fiksasyon sonra embriyolar kapalı katmanları keserek) biyokimyasal analiz etmek mümkün olabilir. Santrifüj 16 (kurbağa, nematod, gömlekliler, halkalı, deniz kestaneleri, yumuşakçalar ve cnidarians da dahil olmak üzere) pek çok farklı türlerin yumurta tabakalandırmak için kullanılabilir yöntemi, burada Drosophila embriyolar ötesinde uygulamalar vardır anlatılan. Kendi laboratuarında, housefly Musca domestica 2 embriyolar için yukarıdaki protokol ve mantar sivrisineği fosili Sciara coprophila 17 ve salyangoz Ilyanassa obsoleta 17 embriyoların analiz yönlenimsiz santrifüj istihdam. Son olarak, bu yöntem embriyolar sınırlı değildir: Santrifüj oosit (örneğin, Drosophila 2, 18 ve sütlü özsuyu olan bir bitki hata Oncopeltus fasciatus 17) gibi diğer büyük hücreler, sınıflandırmaktı yararlı olabilir. Farklı örnek için, tam santrifüj koşulları optimize edilmesi gerekir: Örneğin, 3000 g 10 dakika verimli Musca domestica 2 embriyolar tabakalandırmak için yeterli ve eğer çok daha uzun santrifüj, embriyoların fiksasyon ve immün sırasında dağılma eğilimi gösterir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

Batmaz yoğunluğu farklılıkları onları birbirinden ayırmak için farklı tipte hücre içi organelleri arındırıcı ve izole etmek için önemli bir strateji. Ancak, hücreler santrifüj, proteinler ve yerli olmayan bu ortamda organelleri önce kesintiye çoğu zaman uygunsuz birbirine yapışmaz. Burada, ayrı organelleri sağlam yaşayan Drosophila embriyolar yoğunluk bir metodu tanımlar . Cellularization önce Erken embriyoların nüfus kafeslerden hasat edilir ve dış yumurta kabukları,% 50 çamaşır suyu ile tedavi kaldırılır. Embriyolar sonra agar küçük dikey deliklere, ilk önce küçük bir agar plaka ve eklenen arka sonuna aktarılır. Gömülü embriyoları içeren plakalar 3000g az 30 dakika süreyle santrifüj. Agar embriyoların destekler ve belirli bir yönde tutmaktadır. Daha sonra, embriyolar agar künt bir iğne ile çıkardı. Santrifüj bir tabakalaşma parlak alan mikroskobu ile kolayca görülebilir, farklı katmanlar halinde büyük organelleri ayırır. Floresan belirteçlerin bir dizi canlı embriyolarının başarılı tabakalaşma onaylamak için kullanılabilir. Proteinler belli organelleri ile ilgili ko gösteren belirli bir tabaka güçleniyor. Bireysel katmanlar, donör yumurta içine biyokimyasal analiz veya transplantasyon için telafi edilebilir. Bu teknik, farklı türlerin yumurta ve oosit dahil olmak üzere diğer büyük hücre, organel ayrımı için geçerlidir.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Biz yaşayan organelleri yoğunluğu ile ayrı bir metodu tanımlar<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar gibi. Embriyolar agar gömülü ve santrifüj. Bu teknik, ön-arka embriyo eksen boyunca büyük organellerin tekrarlanabilir ayrılığı ortaya çıkarır. Bu yöntem, biyokimyasal analiz ve nakli deneyleri için ko deney ve verim organel kesirler kolaylaştırır.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K Görüntüleme.  University of Rochester. Biz yaşayan organelleri yoğunluğu ile ayrı bir metodu tanımlar Drosophila Embriyolar gibi. Embriyolar agar gömülü ve santrifüj. Bu teknik, ön-arka embriyo eksen boyunca büyük organellerin tekrarlanabilir ayrılığı ortaya çıkarır. Bu yöntem, biyokimyasal analiz ve nakli deneyleri için ko deney ve verim organel kesirler kolaylaştırır.