Kris Ngai ve bu projeye verdikleri destek ve yardım için Jason Del Rio özel teşekkürler. Bu çalışma RO1 SPG için hibe GM070676 tarafından desteklenmiştir.

Sineklerin Suşlarının satın laboratuarda çoğaltılabilir. Alınan Drosophila kültür şişeleri miktarına bağlı olarak, bir zamanlar sık sık şişeleri maksimum kapasiteye ulaşmış, kültür şişeleri &#39;çevirmek&#39; gerekir. Yaklaşık 50 Drosophila kültür şişeleri dolana kadar amplifikasyon devam eder. Kişi o zaman (kupa alma Fly sonraki bölümde ele alınmıştır) 100 ml bardak ile tricorn fincanları uçmak &#39;yapar. 24 saat sonra, altta yapıştırılmış sinek gıda ile bu kupalarda tohum yeni Drosophila kültür şişeleri için embriyolar kullanın. Oda sıcaklığında, gece embriyo tam büyüdü sinekler için Drosophila embriyo için büyüme zamanı yaklaşık 8,5 gün vardır. Tohumlu embriyoların ilk larva aşamasında içine 12-15 saat sonra yumurtadan çıkar. Larva yaklaşık 4 gün Yumurtadan çıktıktan sonra 24 ve 48 saat, ikinci ve üçüncü larva aşamasında içine iki kez tüy dökme için büyür. Larvalar daha sonra pupariums içine saklanması ve t çıkan kadar 4 günlük bir metamorfoz teslimvarisi pupa durumlarda 1. Her sinek miktarını artırmak için Drosophila kültür şişeleri üç yaklaşık iki gün için daha fazla büyümesi için izin verin. 400 şişe dolu olduğunda, elli yumurtlama bardak (fincan başına 1,000 Hakkında erkek sineklerin) için sinekler yeterli miktarda olacaktır. Sinekler onların yeni ortama uyum için zamana ihtiyacım var. Genellikle bardak devredildikten sonra, koleksiyon için hazır olmak onlar için iki gün sürer. Günlük agar Değiştirilmesi sinekler daha uzun yaşamak için izin verir, sinek bardak temiz tutacağız. (Drosophila bakım ve amplifikasyon daha iyi anlaşılması için, DB Roberts &#39;Drosophila bakınız: Pratik Bir Yaklaşım 2). Drosophila embriyo büyük miktarda elde etmek için iyi bir kaynak ticari olarak mevcuttur nüfusu kafeslerde 3, bulunmaktadır. Nüfus kafeslerinin montaj ve bakım kitabı Drosophila melanogaster bölüm 5 ve 7 görülebilir: PHücre ve Moleküler Biyoloji 4 ractical Kullanımlar. Ancak, nüfus kafesleri pahalı ve bakımı zordur. Nüfusu kafeslerde sinekler bir bol miktarda içerebilir beri, karbon dioksit kullanımı sinekler aktarma ve beslemek için gereklidir. Daha önce de belirtildiği gibi, karbondioksit gibi bakmamasını bunları neden, sineklerin sağlık azaltır. Küçük bir ölçekte, 100 ml&#39;lik beher tricorn kullanılabilir. Elli 100 ml bardak ile dechorionated embriyoların 9 gram elde edilebilir. Amacıyla biz farklı örgü boyutları ile çift katmanlı bir elek alıcı oluşturduğunuz ölü sinek, kullanılmayan maya yapıştırın ve diğer yabancı maddeleri kaldırmak. Ölü sinek gibi bir elek tuzakları istenmeyen malzeme embriyolar (350 mikron gözenek boyutu) geçmesine izin verirken. İkinci bölümde örgü geçecek Drosophila embriyo ve diğer kirlilikler yakalamak için bir anlamı olan bir kafes (120 mikron gözenek boyutu) içerir. 1. Kupası Hazırlık ve Embriyo Toplama Fly <ol><li> ÇevirmekBoş bir plastik bir şişeye birden flakonlarından amplifiye sinekler, dek sinekler miktarı şişeye yüksekliği bir inç ulaşmıştır. Sonra, bir 100 ml yumurta toplama kabı (naylon örgü pencereli Tricon beher) içine bu sinekler aktarın. Sinekler aktarırken sineklerin kaçmasını önlemek için sert bir yüzeye fincan dokunmaya devam edin. Agar içeren maya hamuru ile kap kapak ve sabitleme süresi 24-48 saat bekleyin. </li><li> Elli sinek kupalarda gece agar toplayın ve temiz bir fırça ve su kullanarak elek alıcı için plakalar içeriğini yıkayın. Flesh tüm maya hamur bol su ile elek embriyolar yıkanıp kadar. </li><li> 3 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu onları daldırarak temizlenir embriyolar Dechorionate. </li><li> Embriyoların suyu kokusu gevşek kadar yaygın distile su ile durulayın. Sonra ac kat havlu birden çok kez yerleştirerek embriyolar ile örgü kurulayın. Temiz bir şişeye aktarın ve embriyolar ağırlığı kaydetmek. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Embriyo Homojenizasyon ve Açıklama <ol><li> Buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu 1.5 x hacmi ile Dounce homojenleştiricide dechorionated embriyo yerleştirin. </li><li> Gevşek havaneli 5 vuruş yapın. Temiz santrifüj tüplerine tablet Homojenat. 40 dakika boyunca 15.000 g&#39;de santrifüje. 4 ° C. </li><li> Üst beyaz lipit tabakası veya alt pelet olmadan yüzen berrak sıvı dikkatlice topluyoruz. </li><li> Santrifüj tüplerine temizlemek ve 30 dakika 50.000 g de santrifüj süpernatant aktarın. 4 ° C&#39;de </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi, toplanan çıkan yüksek hızlı süpernatant hemen kullanılabilir veya ay için dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de saklandı oturtun olabilir. </li></ol> 3. Mikrotubul Polimerizasyon ve kinesin Bağlama <ol><li> Oda sıcaklığına kadar donmuş yüksek hızda süpernatan çözünmesi. , Mikrotübüllerin polimerize GTP (0.3 mM) ve taksol (20 uM) ekleyin ve 20 dakika için oda sıcaklığında yavaşça karıştırmaDöner çalkalayıcı. </li><li> Kinesin bağlamak için, döner bir çalkalayıcı içinde oda sıcaklığında 10 dakika karıştırma izledi 2.5 mM ATP nonhydrolyzable analog 5&#39;-adenilat imidodiphosphate (AMPPNP), ekleyin. </li></ol> 4. Mikrotubul ve kinesin Diferansiyel Sedimentasyon <ol><li> 30 dakika boyunca 23.000 g (sw41ti rotor, TLS-55) santrifüj ile eşit hacimde bir sükroz tampon (ekstraksiyon tampon içinde% 20 sukroz ve 10 uM taksol) vasıtasıyla katı madde. 4 ° C. </li><li> 10 uM Taksol ve 75 mM NaCl içeren ekstraksiyon tamponu orijinal homojenatında hacminin% 10 tabanda tarafından pelet yıkayın. </li><li> Adım 4.1 gibi başka bir eşit miktarda sükroz yastık sedimantasyon tekrarlayın. </li><li> 20 uM taksol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, ve 10 mM ATP ile% 5 ekstraksiyon tampon tuzu yıkama gelen pelet tekrar askıya. </li><li> 4 az 20 dakika ° C 120.000 g (42.000 rpm: 31.000 rpm, TLS-55 sw41ti rotor) de Tortu Supernatant (kinesin toplayınkesir). </li><li> 4 de 15 dakika boyunca 14.000 g&#39;de santrifüj filtrasyon ° C. gerçekleştirmek Konsantre örnek Kurtar ve 30 dakika boyunca yukarıdaki gibi yeni bir filtre ile filtrasyon tekrarlayın ve konsantre örnek toplamak. </li><li> Konsantrasyonunu belirlemek için, bir protein metodu gerçekleştirmek. Kısaca, bilinen bir protein konsantrasyonları değişen (sığır serumu albümini; BSA) Bradford reaktifin, bilinen bir hacmi ile karıştırılır ve dalgaboyu 595nm de optik yoğunluk ölçüldü. Sonra bir optik yoğunluk karşısında konsantrasyon standart eğri standart BSA örneklerinin olduğu gibi benzer koşullar altında ölçülen bu örnek optik yoğunluk kinesin fraksiyonu saflaştırılmış bilinmeyen konsantrasyonu hesaplamak için kurulmuştur. Jel elektroforezi gibi Western blot da saflaştırılmış kinesin bilinen bir miktarda kullanılarak gerçekleştirildi. </li><li> Sıvı azot içerisinde istenen konsantrasyon ve erken donma küçük birimlere tablet kinesin fraksiyonu -80 de saklamak için ° C </li></ol> Tam uzunluktaki işlevsel kinesin Drosophila embriyosu saflaştırıldı. Şekil 1 saflaştırılması sırasında farklı fraksiyonlar gösteren gümüş lekeli jel tasvir etmektedir. Lane 1 açıklama sonrasında yüksek hızlı supernatant (Adım 2.5) bir örnek olduğunu, şeritli 2 açıklama sonrası pelet bir örnek, şerit 3, sakaroz minder ile ilk sedimantasyon (adım 4.1) sonra 4 şeritli süpernatant bir örnek pelet bir örnek ilk sedimentasyon sonra şeritli 5 ikinci sedimantasyon (adım 4.3) sonra süpernatant bir örnek olup, 6 şeritli ikinci sedimantasyon sonrası pelet bir örnek, şerit 7 pelet bir örnek son çökeltme (adım 4.5), şerit 8 saflaştırılmış kinesin örnek, şerit 9 filtre kinesin örnektir ve şerit 10 göstergesidir. 115 etrafında kD az şeritli 8 ve 9&#39;da konsantre grubu Figür ile tutarlıdır kinesin ağır zincirinin 1, olduğue 1, 1988 5 yayınlanan Saxton kağıt şerit 8. Şekil 2 saflaştırılmış kinesin fraksiyonu c western blot temsil kinesin ağır zincir antikor kullanarak algılandı. Antikor AKINO1-A tedavisi diğer kinesin aile üyeleri 6 ile çapraz reaksiyon vermez. Not olduğu halde fraksiyonu kinesin-1 için zenginleştirilmiş iken, diğer potansiyel olarak kinesins ve diğer motor proteinler de dahil olmak üzere kirletici olasılığı vardır, fonksiyonel kinesin iyi bir kaynak Bu protokol sonuçlar,. Biz, filtrasyon ile daha küçük bir kirletici maddeler, çeşitli çıkarıldı. Bildiğim kadarıyla sadece büyüklüğü ile yapılması mümkün olmayan diğer motorlar kaldırarak olarak, arıtma kinesin 7 çalışmak için başkaları tarafından yapıldığını ne benzer olduğunu ve aktif motor çoğunluğu kinesin-1 olduğuna inanıyoruz, ama daha gelişmiş arıtma sağlayacak Bu tür potansiyel olarak motorun kirletici maddeler, uzaklaştırılması Cole ve ark 8 ve Saxton ve arkadaşları tarafından yapılmıştır. 9 </p&gt; Kinesin ve processivity olarak &quot;Motor Proteinler için Motilite Testi&quot; başlıklı 10 Scholey tarafından kitapta daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır vitro tek bir molekül mikrotübül bağlanma analizi, içinde değerlendirilmiştir. Kısaca, bir tek aktif motor ile polistiren boncuklar satüre varlığında (1 mm) ATP, mikrotübül ile temas haline getirildi. Motor mikrotübül bağlı ve lazer tuzak merkezinden uzağa yürümeye başladı. Tuzak merkezi (100 nm) boncuk önceden tanımlanmış bir deplasman lazer ışınının gücünü otomatik motorda yük altında MT yürümek için izin kapatıldı. Film MT yürürken tek kinesin ile boncuk, 500 nm çaplı gösterir. Video ekran uzunluğu 20 um karşılık gelir. Şekil 3 burada sunulan protokolüne göre arıtılmış, tek bir tam uzunlukta Drosophila kinesin molekülleri için çalışma-uzunlukları ölçülen dağılımını temsil eder. Exponential dağılımına uyacak tek kinesin 1.55 ortalama geçiş-uzunluklu ± 0.1 mikron ve 1.28 ± filtre ve filtre uygulanmamış örnek için 0.12 mikron sırasıyla sağlar. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 saflaştırılmış fraksiyonların gümüş lekeli jel:. Numuneler her fraksiyondan% 10 jelde yürütüldü. Protein 10 mg her kulvarın yüklenmiş. Lane 1 açıklama sonrasında yüksek hızlı supernatant (Adım 2.5) bir örnek olduğunu, şeritli 2 açıklama sonrası pelet bir örnek, şerit 3, sakaroz minder ile ilk sedimantasyon (adım 4.1) sonra 4 şeritli süpernatant bir örnek pelet bir örnek ilk sedimentasyon sonra şeritli 5 ikinci sedimantasyon (adım 4.3) sonra süpernatant bir örnek olup, 6 şeritli ikinci sedimantasyon sonrası pelet bir örnek, şerit 7 pelet bir örnek son çökeltme (adım 4.5), şerit 8 saflaştırılmış kinesin olduğunuörnek, şerit 9 100 kD kesme Amicon ultra 0.5 ml santrifüj filtre (Millipore, ABD) kullanılarak süzülür kinesin olduğunu. Mavi oklar olan miktarlar azalmış ve kırmızı ok Bu protokolde kullanılan santrifüj süzme aşaması nedeniyle kinesin konsantrasyonunu göstermektedir edildi proteinleri göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> . Şekil 2 Saflaştırılmış KHC fraksiyonu anti-kinesin antikoru karşı blotted: Saflaştırılmış kinesin Örnek AKINO1-A 1 saat için (TBST in 1:1,000), oda sıcaklığında inkübe edildi jel elektroforezi tabi tutuldu ve primer antikorun karşı (Nitroselüloz zar olarak) blotted edildi oda sıcaklığında bir saat boyunca da Donkey-anti-tavşan antikoru (TBST in 1:10,000). Bir ECL (chemiluminescent) kiti yukarıda gösterilen kinesin sinyal tespit etmek için kullanıldı. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. </strongTek Drosophila tam uzunlukta kinesin arasında&gt; geçiş-uzunluğu ve Hız: (A) ve (B) filtre kinesin örnek geçiş-uzunluğu ve Velocity. (C) ve (D) filtrelenmemiş kinesin numunenin geçiş-uzunluğu ve hızı. Şekil 4. Kinesin motilite Video. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">Videoyu izlemek için burayı tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Mürin beyin yanı 12 kullanılmıştır ama Bovine beyin, tam uzunlukta kinesin arındırmak için en yaygın olarak kullanılan başlangıç ​​materyali 11&#39;dir. Bir kinesin kaynağı olarak sığır beyin kullanılarak büyük bir dezavantajı, taze başlangıç ​​malzemesinin mevcut olmasıdır: kesimhanelerinde tipik olarak erişilemez ve beynin aktif kinesin elde edilmesi için son derece taze olmalıdır. Ayrıca, küçük inek, sadece beyinleri etkilidir. Son olarak, ineklerin ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ya da malzemenin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Agar (Granül) </td><td> Balıkçı </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dekstroz (D-Glikoz) Susuz </td><td> Balıkçı </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Yemekleri </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mm Stil (Polyester) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila Kültür Flakon </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tricorn beher </td><td> Econo Lab Inc </td><td> B700-100 </td><td> Hacim: 100ml, Boyutu: 58x72mm </td></tr><tr><td> Maya </td><td> Red Star </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Naylon Mesh </td><td> Genesse Bilimsel </td><td> 57-102 </td><td> 120 mIcron gözenek boyutu </td></tr><tr><td> Naylon Mesh </td><td> Küçük Parçalar </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Borular </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Borular </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (susuz) </td><td> Balıkçı </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Löpeptin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotonin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP analog 5&#39;-adenilat imidodiphosphate </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra Santrifüj Filtreler: .5 ml, 100kD kesti, 8 paket </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

Motor proteinleri mikrotübüllerin boyunca yükler taşımak ve belirli alt-hücresel bir yere taşırlar. Değişmiş ulaşım mikrotübül dayalı motorlu taşıtlar ve düzenlenmesi anlamak, nörodejeneratif hastalıklar çeşitli altında yatan önerilmektedir Çünkü muhtemelen sonuçta daha iyi terapötik yaklaşımlara yol açacaktır. Kinesin-1 ATP hidrolizi powered by mikrotübüllerin (MTS) boyunca bir anterograd (artı uç) yönünde, içinde hareket eden bir ökaryotik motoru proteindir. İşte biz böylece tek-molekül biyofiziksel çalışmalarla Drosophila genetiği kombinasyonu sağlayan, Drosophila embriyo aktif tam uzunlukta kinesin izole etmek için ayrıntılı bir arıtma protokolü sunduk. Fincan başına yaklaşık 1000 kadın ile birlikte, yaklaşık 50 yumurta kapları ile başlayarak, biz bir gecede koleksiyonları yürütülmektedir. Bu paketlenmiş embriyoların yaklaşık 10 ml sağladı. Embriyo (embriyonun yaklaşık 9 gram kadar) dechorionated çamaşır suyu vardı ve sonra homojenize. After bozulması, Homojenat yüksek hızlı santrifüj düşük hızlı dönüş kullanılarak açıklanabilir. Açıklık süpernatan MTs polimerize etmek GTP ve taksol ile muamele edildi. Kinesin ATP analog, oda sıcaklığında, 5&#39;-adenilat imidodiphosphate ekleyerek polimerize MTs üzerinde hareketsiz kılındı. Kinesin bağlandıktan sonra, mikrotübüllerin bir sükroz yastık aracılığıyla yüksek hızda santrifüj ile çöktürülmüştür. Mikrotübül pelet daha sonra yeniden süspansiyon haline getirildi, ve bu işlem tekrarlanmıştır. Son olarak, ATP MTS kinesin serbest bırakmak için ilave edildi. Yüksek hızlı santrifüjleme sonra üstte yüzen madde içindeki kinesin bırakarak, MTs aşağı doğru bükülmüş. Bu kinesin daha arıtılması için bir filtre 100 KD kesme kapalı bir santrifüj kullanılarak filtrasyon tabi tutuldu bölünüp, sıvı nitrojende dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de saklanır kapandığından Blotting SDS jel elektroforezi ve batı arıtılmış örnek kullanılarak gerçekleştirildi. Nihai santrifüj süzme aşaması önce ve sonra saflaştırılmış örneklerin motor aktivitein vitro tek bir molekül mikrotübül tayininde kullanılarak değerlendirilmiştir. Daha önce literatürde rapor edilen merkezkaç filtrasyon öncesi ve sonrası kinesin fraksiyonlar processivity gösterdi. Ayrıca deneyler kinesin ve diğer ulaşım ilgili proteinler arasındaki etkileşimi değerlendirmek için çalışmalar devam etmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos at JoVE.com

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir protokoldür<em&gt; Drosophila</em&gt; Tek-molekül biyofiziksel çalışmaları için embriyo. Biz, embriyolar toplamak embriyo lizat olun ve mikrotübüllerin (MTS) polimerize nasıl gösterir. Kinesin, MTs üzerinde hareketsizleştirici kinesin-MT kompleksleri aşağı doğru dönen, ve daha sonra ATP ilave yoluyla MTS kinesin salgılatıcı ile arıtılır.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

isolation-and-purification-of-kinesin-from-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir protokoldür Drosophila Tek-molekül biyofiziksel çalışmaları için embriyo. Biz, embriyolar toplamak embriyo lizat olun ve mikrotübüllerin (MTS) polimerize nasıl gösterir. Kinesin, MTs üzerinde hareketsizleştirici kinesin-MT kompleksleri aşağı doğru dönen, ve daha sonra ATP ilave yoluyla MTS kinesin salgılatıcı ile arıtılır.

Video: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biyoloji

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...