Hirschil Güven, Michael Saperstein Tıbbi Alimler Araştırma Fonu ve NYU Whitehead dostluk bu çalışmaları destekledi.

1.. Mikroplate Wells Kaplama Not: Bu adımın amacı T-hücresi LFA-1 için ligandlar olarak hizmet etmek için ICAM-1 ile kat polistiren yüzeylere etmektir. <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ol><li> Resuspending kaplama solüsyonu hazırlayın rekombinant ICAM-1, kalsiyum (1 mM zenginleştirilmiş fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) ile CaCl2) ve magnezyum (2 nM MgCl2). ICAM-1&#39;in son konsantrasyonu 0.7 mg / ml stok çözeltisi yapılmış ve -80 ° C dondurucuda tutuldu 10 ug / ml, olduğundan emin olun. </li><li> % 0.5 insan (veya bovin) serum albümini (HSA / BSA), 2 mM MgCI2 ve 1 mM CaCI2 ile PBS zenginleştirerek yapışma çözelti hazırlayın. </li><li> PBS ile 2 mM MgCl2 ve 1 mM CaCl2 eklenerek yıkama çözeltisi hazırlayın. 37 tüm çözümler ısınmakKullanmadan önce C °. </li></ol></li><li> Yıkama çözeltisinin 50 ul ile 24 kuyu yıkayın. Bu yıkanmamış kuyu, pozitif (PMA tedavi hücreleri) ve negatif (kaplanmamış kuyuları) kontrolleri içerecektir. Her koşul en az üç kuyu (üçlü) set için. </li><li> Her bir oyuğa kaplama solüsyonu 50 ul ekle. Kaplanmamış kontrol kuyulara katmayın. 37 ° C inkübatör içinde bir saat boyunca inkübe edin. </li><li> Ucu kuyuların alt dokunmasına izin vermeden, nazikçe kaplama çözüm aspire. Yıkama çözeltisi, 50 ul bir kere yıkayın. </li><li> Yapışma çözeltisi 50 ul ilave edin ve 37 ° C inkübatör içinde bir saat için mikroplak inkübe edin. </li><li> Yavaşça aspire ve 50 ul yıkama çözeltisi ile yıkayın. Ancak bu gece boyunca 4 ° C&#39;de tutmak mümkündür, aynı gün plaka kullanarak, ve ertesi gün kullanın. </li></ol> Blood 2. T Hücre İzolasyonu <ol><li> 50 ul / ml o insan T hücresi zenginleştirme kokteyl eklemef tam kan (antikoagülan, 3 ml (heparin, EDTA veya sitrat) tam kan, örneğin kokteyl 150 ul ekle). İyice karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne 3 ml işlenmiş kan ve oda sıcaklığında% 1 D-glükoz ile zenginleştirilmiş bir (kalsiyum ve magnezyum olmadan) PBS eşit hacimde. Pasteur pipeti ile yavaşça karıştırın. </li><li> Santrifüj tüpüne 15 ml Ficoll-Paque PLUS ekleyin. </li><li> Dikkatle lenfosit izolasyon ortamında kan örneği seyreltilmiş 6 ml katman. </li><li> Ara kapalı olarak 20 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Arayüzde bozulmamış lenfosit tabakası bırakarak temiz bir Pasteur pipeti kullanarak üst katman kapalı çizin. Plazmanın üst tabakası daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Temiz bir Pasteur pipeti temiz bir santrifüj tüpüne lenfosit katman transferi kullanma. </li><li> Lenfositlere karşı PBS 3 hacim (9 mi) ilave edin. Hafifçe hücreleri tarafından askıya drakanat onları ve bir Pasteur pipeti dışarı. </li><li> 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje </li><li> Süpernatant kaldırmak. Lenfositler şimdi uygulama için uygun bir ortam içinde süspansiyon gerekir. 20 ml bir T-75 kültür şişesine transfer hücreleri,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı. </li></ol> Hücreler 3. Hazırlanması Not: hücreler, bir flüoresan tepkime maddesi ile etiketlenmiş edilmesi için bir ön şarttır. Bu protokolde ifade eden hücreler kabul edilebilir bir alternatiftir karboksi floresan süksinimidil ester (CFSE), bununla birlikte, yeşil flüoresan protein (GFP) kullanın. <ol><li> Hemasitometre kullanarak 2,4 x 10 6 T hücrelerini (her bir kuyu için 1 x 10 5) saymak. </li><li> Serumu (serum açlık) eksik kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. 37 ° C bir inkübatörde 2 saat boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 5 dakika (400 xg) için hücreler santrifüj. Medya ve aspire1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 1:1000 seyreltme (5 mM yapılan stok) CFSE ekleyin. Işıktan örtün ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 37 ° C PBS ile 10 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun ve 5 dakika boyunca 400 x g &#39;de dönerler. </li><li> Önceden ısıtılmış yapışma çözeltisi (50 ul başına 1 x 10 5 hücre) 1.2 ml hücre pelletini yeniden askıya. </li></ol> Hücreler 4. Uyarılması Not: yapışma başlatmak için, hücreler teşvik edilmelidir. Aşağıdaki deneyde hücreler, anti-CD3 antikorları ile çapraz bağlama, TCR ile uyarılır, ancak çözünebilir SDF-1, alternatif olarak hizmet verebilir. Deneylerin amacına bağlı olarak, çeşitli farmakolojik reaktifler hücre yapışması üzerindeki etkilerini incelemek için stimülasyon öncesi veya sırasında ilave edilebilir. Phorbol myristate asetat (PMA), ikinci haberci diasil gliserol (DAG) ile yapısal olarak benzer olan ve bu nedenle çok sayıda kinaz aktifleştiren bir forbol ester,alt TCR (özellikle protein kinaz C) s; burada bir pozitif kontrol olarak kullanılır. <ol><li> 37 ° C&#39;ye ısıtın mikroplak </li><li> 8 1.5 ml boş boruların (her bir tüpe 150 ul), her bir durum için, bir tüp içine hücreleri bölün. </li><li> Buna göre hücreleri tedavi: <ol><li> Pozitif kontrol olarak hizmet etmek için 10 ng / ml PMA ile bir tüp teşvik. Uyarılması için kontrolü (&quot;Hiçbir uyarım&quot;), yıkanmamış yükleme kontrol (&quot;hiçbir yıkama&quot;) ve ICAM-1 kaplama için kontrol (&quot;kaplanmamış&quot;) olarak hizmet etmek, işlenmemiş üç tüpleri tutun. </li><li> Anti-CD3 antikorlarının farklı konsantrasyonda (0.1, 1, 5, ve 10 ug / ml) ile dört tüp teşvik. Gecikme olmadan sonraki adıma devam edin. </li></ol></li><li> De her boş içine uyarılmış hücre karışımı aliquot 50 ul. Göz başına hücre nihai sayısı 1 x 10 5&#39;tir. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C inkübatör mikroplak yerleştirin. Not: Bazı T hücre hatları kısa uyarıdan gerektirir<html> tion zaman. Bu süre içinde, hücreler kuyu dibine yerleşmek ve hedef ligandlara bağlı. </li></ol> 5. Yıkama takım Yapışkan olmayan hücreler Not: Bu adımın amacı ligand kaplı yüzeyler ile sıkı bir temas oluşturmak için mümkün değildi hücreleri kaldırmaktır. Aynı fiziksel kuvvetler tüm oyuklara uygulanmasını sağlamak amacıyla, bu aşama için, çok kanallı bir pipet kullanın. Bu yapışık hücre yüzdesinin hesaplanmasında yardımcı olmak için yıkanmamış belirtilen kontrol kuyuları tutmak önemlidir. <ol><li> Her kuyu için, sıcak yapışma çözeltisi 150 ul ekle. Kuyulardan orta çıkarmadan önce birkaç saniye hafifçe plakayı sallayın. Ipuçları ile kuyuların dibine dokunmayın. </li><li> Bu adımı üç kez tekrarlayın. Tamponu ve dışarı pipetlerken pipet yönünü değiştirin. </li></ol> 6.. Yapışık hücrelerin yüzdesini belirlemek _content &quot;&gt; Not: Bu adımda, bir floresan plaka okuyucu içinde her bir floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan yoğunluk yapışık hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişki içindedir.. <ol><li> Plaka okuyucusu açın. Masaüstünde kısayol simgesini tıklatarak plaka okuyucu yazılımı açın. <ol><li> &quot;Görev&quot; menüsünden yeni bir protokol kurmak için &quot;Yeni&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> &quot;Eylemler&quot; menüsünden &quot;Oku&quot; seçeneğini seçin. &quot;Floresan yoğunluğu&quot; ı tıklayın ve &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> Menüsünden açılan &quot;Uyarma dalga boyu 485&quot; ve &quot;Emisyon dalga boyu 528&quot; seçeneğini seçin. &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Optik&quot; seçeneği menüsünde &quot;Bottom&quot; seçin ve &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. Geri &quot;Eylemler&quot; menüsüne gidin ve 37 ° C sıcaklığına ayarlamak ve &quot;Tamam&quot; a tıklayın. </li><li> Plaka okuyucu içine mikroplağı yerleştirin ve&quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Sonuç excel elektronik tablo halinde ihraç edilecek. </li></ol></li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak yapışkan hücrelerin yüzdesini hesaplayın: yapışık hücre yüzdesi = (yıkandı kuyularda oku ortalama floresan yoğunluğu) / (yıkanmamış hücre oku ortalama floresan yoğunluğu) x% 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

LFA-1 aktivasyonu ve T hücre yapışmasının 12 sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır. Akış sitometrisi bükülmüş ya da LFA-1 ya da genişletilmiş seçici olarak bağlanan monoklonal antikorlar kullanılarak canlı hücreler içinde LFA-1 afinite durumlarını ölçmek için kullanılır. Bu yöntemin sınırlamaları biri dikkate İntegrinler &#39;avidite almaz olmasıdır. Göç deneyleri yararlı araçlardır ama onlar belli bir zaman noktasında cimri yapışma değil göç ölçmek, ve. T lenfosit göçünü (örn. deri aşırı duyarlılık modeli) incelemek için fare modelleri, ancak bu modellerin kullanımı çok faktörlü ve yürütmek için karmaşık, fizyolojik alakalı. Burada açıklanan yapışma deneyinin ana gücü basit bir şekilde ve avidite afinitesini ölçmek için hem de yeteneğidir. Bu yöntemin diğer bir avantajı, hızlı ve doğru küçük bir hücre sayısı tespit kabiliyetidir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu Manip çok daha kolaydırulate hücreler ve tarif edilen gibi bir fonksiyonel deneyde farklı reaktifler ile tedavi. Ayrıca, yapışan hücreler manuel sayıları ile ilgili bir plaka okuyucu, eleme önyargı ile objektif sayılır. Bu yöntem, yapışma işlemi birden fazla ilaç veya gen manipülasyonu etkisini taranması için kullanılabilir. Ancak bu teknik kısıtlamaları ücretsiz değildir. Potansiyel bir zayıf yapışık hücre yüzdesi bir deneyden diğer değişebilir göreli bir sayı, olduğu bir gerçektir. Başka bir zayıflık bu taze izole edilmelidir gibi patlama lenfositler, kullanılamaz olmasıdır. Ayrıca, dondurulmuş periferal kan tek-çekirdekli hücrelerden geri hücreleri ile yapışma çalışmalar tutarlı değildir. Bu PMA sürekli çalışması gerektiğini belirtmek önemlidir ve biz her deneyde kullanmanızı öneririz. Bir pozitif ve bir negatif kontrol başarısız deneyleri sorun giderme ilk adımlardır. Olmaması durumundauyarılmış hücrelerde yapışma artar, kuyu kapsayan hedef ligandın konsantrasyonu kontrol edilmelidir. Ek olarak, hücrelerin% 95&#39;inden fazlası uygulanabilir ve bir hücre hattı durumunda, büyüme fazı hesaplanmalıdır doğrulamak için gereklidir. Aynı durum içinde önemli değişkenlik durumunda, (üç kez daha fazla) en fazla üç aynı kuyu kullanılması önerilir. Bu testte takdir etmek amacıyla bu tür inkübasyon süresi ve tohumlu hücre sayısı olarak protokolde bazı adımlar bütün koşullar arasında muntazam olması gerektiğini anlamak için yararlıdır. Inkübasyon süresi küçük farklar hatalı ölçüleri olan neden olabilir. Tam hücre aynı sayıda her şey aynı zamanda kana önemlidir. Bu tekniğin gelecekteki uygulamalar, doğruluğunu geliştirmek hücrelerini yüklemek ve daha objektif bir şekilde yıkar gerçekleştireceklerini otomatik bir versiyonu olacaktır. Buna ek olarak, otomatik bir versiyonu sağlayacaktırbüyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için.

T lenfosit yapışma bağışıklık tepkisi 1 temel bir süreçtir. Bu tarama antijen hedef hücreler 2 ile lenf düğümleri içinde hücreler (APC) ve immünolojik sinaps oluşumu için (IS) için, endotel hücreleri, kılcal duvarlar dekorasyon ile T hücre etkileşimi için gereklidir. Bu gereksinimler, işlevsel ve kinetik farklıdır. Lenfositler ekstravazasyonunun süreci chemoattraction, haddeleme, sağlam yapışma ve göçü oluşur. Yapışmasını pekiştirmek için yuvarlanmaya geçiş hızlı bir G protein bağlı reseptör sinyaline yanıt T hücreleri gerektirir. Bu yanıt, haddeleme hücre 3 yavaşlatır ve tutuklama bir integrin ligand etkileşimini verir. Integrin aviditede ani bir değişim bu süreci aracılık eder. Göç &#39;ön uç&#39; de adezyonların oluşumu ve &#39;arka ucunda&#39; de yapışıklıklar kırılma dinamik etkileşimler betweenTcells ve endotel hücreleri gerektirirbiçimlendirilmiş ve 4 kırma arasında yaklaşık bir dakika ara ile. IS inminutes oluşturur, ama saat 6 bozulmadan kalması gerekiyor. İlginç bir şekilde, tek bir yapışma molekülü, integrin ailesi elemanıdır limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) - 1, tüm bu işlemler 5 için gereklidir. LFA-1, immünoglobulin süper familyasının çeşitli üyeleri ile etkileşim yoluyla bir yapışmaya neden olur. LFA-1, en yüksek afiniteye sahip en yaygın olarak incelenmiştir ligand arası yapışma molekülü (ICAM) -1. Non-aktive dolaşımdaki lenfositler, bu nedenle, hücre yüzeyi üzerinde LFA-1 ve ICAM-1 kaplı yüzeylerin uygun durumda olan düşük afiniteye ifade eder. LFA-1, değişken afinite ve bu tür G-protein kenetli reseptör aktivasyonu, sitokin stimülasyonu ve T hücre reseptörlerinin (TCR) kaynaklı sinyaller gibi çeşitli sinyal olayları tarafından düzenlenir. LFA-1 hücre dışı alanı, hücre içi aktivasyonu taşır Sonuçta elde edilen yüksek afiniteli bir şekilde tICAM-1 ile hrough etkileşimleri. Bu yol 7 sinyalizasyon iç-out denir. Benzer şekilde, hücre dışı alan ikinci LFA-1 ile sinyal dış-in sinyal olarak adlandırılır. Iç-dış ve sinyalizasyon dışarıdan katılan sinyal basamaklarının içi mevcut araştırmaların önemli bir odak noktası vardır. Küçük GTPaz Rap1 son zamanlarda TCR ligasyonu ve 8 sitokin sinyal için ortak olan sinyalizasyon iç-out anahtar bileşeni olarak ortaya çıkmıştır. T hücre yapışma baskın negatif Rap1 9 ekspresyonu ile bloke edilir ise integrin aktivasyonu Rap1 kritik rolü, Rap1 aşırı ifadesi T hücreleri integrin bağımlı yapışmayı teşvik keşfi ile vurgulanır. Rap1 tarafından integrin düzenleme anlayışımızda bu gelişmeler vitro araçları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bunlar arasında Burada açıklanan yapışma deneyidir. Bu yöntemin genel amacı T incelemektirICAM-1 kaplı yüzeylere hücre yapışma. Daha özel olarak ise, bu ölçmenin ve farklı koşullar altında, gerçek zamanlı canlı hücrelerde, karşı ligandları doğru LFA-1 afinite ölçmek için kullanılır. Bu teknik, T hücreleri ile etkileşime hücre yüzeyleri taklit etmek için ICAM-1 ile kaplanmış polistiren kuyu kullanır. Pek çok daha önce tarif edildiği statik T hücre yapışma deneyleri, deneysel karmaşıktı. Genellikle T hücreleri için gerekli Bu deneyler, radyoaktif etiketli T hücre yapışması için alt-tabaka olarak hücre dışı bir matris oluşturmak için kültürlenmiş sığır kornea hücreleri kullanılmaktadır, ya da T hücre yapışmasını 10 desteklemek için uzun bir süre boyunca fizyolojik olmayan, T hücresi uyarımı için çağrılacak. Diğer birçok deney sistemlerinde 11 kullanılan gibi, akış sitometrisi ve mikroskopi ile karşılaştırıldığında yapışma, inkübasyonu takiben T hücresi sayısını bulmak için florometrik ölçüm kullanılması miktarının daha hassas ve kesin bir yöntemdir. Buna ek olarak, tek bir hücre mikroskopintegrin lokalizasyon ic analizi fluorometrik ölçümü ile aynı şekilde geniş, nüfus tabanlı analiz için izin vermez. Aktivasyon durumu spesifik LFA-1 antikorlar, ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bu antikorlar, burada tarif edilen yönteme göre düşük duyarlılık sunmaktadır. Alternatif teknikler üzerinde ana avantajı sadeliği ve aynı anda birden fazla deneysel koşulları incelemek için yeteneğidir. Belirli bir uygulama için bu yöntemi göz önüne alındığında, bir T hücreleri olumsuz, seçilmiş taze izole edilmiş ve bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş gerektiğini dikkate almalıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

T lenfosit yapışması enflamasyon ve antijen sunan hücreler ile immünolojik sinaps oluşumu sitelerine göçü de dahil olmak üzere birden fazla T hücre fonksiyonları için gereklidir. T hücreleri, integrinler, ortak hücreler ya da hücre-dışı matrisi üzerinde hedef molekülü ile etkileşim transmembran proteinlerin çiftlerinden oluşan heterodimerik hücre yapışma moleküllerinin bir sınıf yapışkan özelliklerini kontrol ederek düzenlenmiş yapışmasını gerçekleştirmek. En belirgin T hücre integrin olan hedef hücre içi adezyon molekülü (ICAM) -1 alt birimi αL ve β2, oluşan, limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) -1. Yapışmayı kontrol etmek için bir T hücresinin yeteneği bireysel integrinlerin afinite durumlarını düzenleme yeteneğinden kaynaklanır. İç Çıkış sinyali, bir hücre içindeki sinyal integrinlerin dış etki aktive edilmiş bir durumunu almasına neden sayede işlemi tarif etmektedir. Bu karmaşık olayların bilgimizin çok mekanik dayanmaktadırçalışmalar, in vitro model sistemlerinde de basitleştirilmiş uygulandı. Burada anlatılan T lenfosit yapışma deneyi, T hücreleri, statik koşullar altında, molekülleri hedef alan uymak için sağlar ve daha sonra yapışkanlığını ölçmek için bir flüoresan plaka okuyucusu kullanır mükemmel bir araçtır. Bu deney, lenfositler üzerinde hareket yapışma uyarıcı ya da önleyici maddeler tanımlama, hem de söz konusu sinyal olayları için yararlı olmuştur. LFA-1, burada açıklanan halde - ICAM-1 aracılı yapışma; Bu deney hali hazırda başka bir yapışma etkileşimlerinde (- fibronektin örneğin VLA-4) çalışma sağlamak için adapte edilebilir.

Aşağıdaki, anti-CD3 antikorlarının çeşitli konsantrasyonları ile uyarılmış T-hücreleri, primer yapışma deneyinin bir örnektir. Bu yıkanmamış hücrelerin floresan (yani toplam yükleme) bilmek yararlıdır. Stimüle edilmemiş hücreler bir negatif kontrol olarak hizmet etmek ve PMA ile muamele edilmiş hücreler, anti-CD3 antikorları için pozitif kontrol edilir. Kaplanmamış kuyularda kaplı hücreler, ICAM-1 için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Uyarılmamış hücre yüzdesi% 10 ila% 5 arasında iken Tipik bir deneyde yapışık PMA ile muamele edilen hücrelerin yüzdesi 50 ila% 40 arası% &#39;dir. Hücresel yapışma ölçmek için alternatif bir yöntem, uyarılmamış hücrelerde bu üzerinde her durumda floresan yoğunluğunun hesaplanması kat bir artış gereğidir. Tablo 1 CFSE floresans yoğunluğu birincil T hücreleri çözünür anti-CD3 antikorları ile uyarılmış farklı dozlarda ve ICAM-1 kaplı oyuklara üzerine kaplanmıştır etiketli gösterir. Şekil 1, Örnek im göstermektedirbenzer bir deneyde yaşları. Hücreler, olumsuz çevresel kanından seçildi. 2 saat boyunca, serum açlığından sonra, 2,4 x 10 6 hücre çeşitli konsantrasyonlarda çözünür anti-CD3 antikorları ile uyarımı ile devam eden CFSE ile etiketlenmiştir. Uyarılmış hücreler, ICAM-1 kaplanmış oyuklarına kaplama ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edildi. İnkübasyondan sonra yapışmayan hücreler üç kez yıkanmış ve floresan yoğunluğu, 485 nm&#39;de bir plaka okuyucusu kullanılarak ölçüldü. PMA ile işlenen ve uyarılmamış hücreler kontrol olarak kullanılmıştır. İlk sütun (1A-1C) değil yıkanmış hücreleri (toplam yükleme, örneğin% 100) içerdiğini unutmayın. Şekil 2, Tablo 1 &#39;de rapor edilen floresan şiddetleri ile hesaplanmıştır gibi T hücre yapışmasının yüzdelerini gösterir. (Yüklenen toplam hücrelerin dışında her bir durum için üç kuyu (üçlü) ortalama yoğunluğu hesaplandı ve nisbi yüzde dönüştürülmüş <strong&gt; Tablo 1; Sütun 1). Ortalama standart hata, her durum için hesaplanmıştır. Şekilde görüldüğü gibi, yapışık hücre yüzdesi uyarılması için kullanılan anti-CD3 antikorlarının yüksek konsantrasyon ile daha büyüktür. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Hayır Yıkama </td><td> Kaplamasız </td><td> Uyarılmamış </td><td> PMA </td><td> Anti-CD3 0.1 ug / ml </td><td> Anti-CD3 1 ug / ml </td><td> Anti-CD3 5 ug / ml </td><td> Anti-CD3 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> A </td><td> 89652 </td><td> 611 </td><td> 5219 </td><td> 45873 </td><td> 8964 </td><td> 20157 </td><td> 37972 </td><td> 37972 </td></tr><tr><td> B </td><td> 90248 </td><td> 320 </td><td> 6049 </td><td&gt; 44698 </td><td> 7568 </td><td> 25486 </td><td> 32549 </td><td> 32549 </td></tr><tr><td> C </td><td> 88321 </td><td> 409 </td><td> 5456 </td><td> 42697 </td><td> 8542 </td><td> 24568 </td><td> 32892 </td><td> 3289 </td></tr></tbody></table> CFSE Tablo 1. Flüoresans şiddeti değerleri, çözünür anti-CD3 antikorlarının değişken konsantrasyonları ile uyarılmış primer T-hücreleri etiketli. Taze hasat edilmiş hücreler, serum iki saat süre ile aç bırakılmış ve daha sonra 5 uM konsantrasyonda CFSE ile etiketlenmiştir. Daha sonra, hücreler, bir düşük (0.1 ug / ml) ile uyarıldı, orta (1 ug / ml), yüksek (5 ug / ml) ve çok yüksek (10 ug / ml) çözünür anti-CD3 antikor konsantrasyonları ve 1 x 10 5 hücre (ICAM-1 ile önceden kaplanmış) her çukuruna ekildi. 15 dakika sonra yapışmayan hücreler üç seri yıkama yoluyla uzaklaştırılmıştır. Yapışık hücre sayısı s olarak, bir plaka okuyucu ile ölçüldüBu tabloda ya da bilgiye iniz. Wells 1A-1C: yıkanmamış hücreleri; Şekil 2A-2C: kaplanmamış wells; Şekil 3A-3C: Stimüle edilmemiş hücreleri; 4A-4C, 10 ng / ml PMA ile uyarılan hücreler; 5A-5C: düşük doz anti-CD3 antikorları ile uyarılmış hücreleri; Şekil 6A-6C: anti-CD3 antikorları, orta doz ile uyarılmış hücreleri; Şekil 7A-7C: yüksek doz anti-CD3 antikorları ile uyarılmış hücreleri; Şekil 8A-8C: Çok yüksek doz anti-CD3 antikorları ile uyarılmış hücreler. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51646/51646fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51646/51646fig1.jpg" /> Şekil 1. Çözünür anti-CD3 antikorlarının değişken konsantrasyonları ile uyarılmış T hücrelerinin primer görüntüler. Serum yeni toplanan hücreler iki saat aç ve daha sonra 5 uM konsantrasyonda CFSE ile etiketlenmiştir. Daha sonra, hücreler PMA (10 ng / ml) ya da anti-CD3 antikorlarının çeşitli konsantrasyonlarının (0.1, 1, 5, ve 10 ug / ml) ile uyarıldı ve ekildiICAM-1 yüzeyleri kaplı. Temsilcisi görüntüleri 20X büyütme kullanarak Zeiss 700 konfokal mikroskobu ile alınmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51646/51646fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51646/51646fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51646/51646fig2.jpg" /> Şekil 2,. Fazla yapışmasına yüksek doz anti-CD3 antikorları sonuçları ile T hücrelerinin uyarılması hücreleri yıkanmamış için Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Yapışık hücre ortalama yüzdesi hesaplanmıştır nisbetle hesaplanabilir gibi T hücre yapışmasının yüzde. Grafikle temsil bu % 100 temsil eder. Histogramlar, en az 3 kuyu sonuçlarını (± SEM) sunuyoruz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51646/51646fig2large.jpg" target="_blank">clic lütfen</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya k.

Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

15.9K Görüntüleme.  New York University School of Medicine.  Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir. 

Video: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...