Name: static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Hirschil Güven, Michael Saperstein Tıbbi Alimler Araştırma Fonu ve NYU Whitehead dostluk bu çalışmaları destekledi.

1.. Mikroplate Wells Kaplama Not: Bu adımın amacı T-hücresi LFA-1 için ligandlar olarak hizmet etmek için ICAM-1 ile kat polistiren yüzeylere etmektir. <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ol><li> Resuspending kaplama solüsyonu hazırlayın rekombinant ICAM-1, kalsiyum (1 mM zenginleştirilmiş fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) ile CaCl2) ve magnezyum (2 nM MgCl2). ICAM-1&#39;in son konsantrasyonu 0.7 mg / ml stok çözeltisi yapılmış ve -80 ° C dondurucuda tutuldu 10 ug / ml, olduğundan emin olun. </li><li> % 0.5 insan (veya bovin) serum albümini (HSA / BSA), 2 mM MgCI2 ve 1 mM CaCI2 ile PBS zenginleştirerek yapışma çözelti hazırlayın. </li><li> PBS ile 2 mM MgCl2 ve 1 mM CaCl2 eklenerek yıkama çözeltisi hazırlayın. 37 tüm çözümler ısınmakKullanmadan önce C °. </li></ol></li><li> Yıkama çözeltisinin 50 ul ile 24 kuyu yıkayın. Bu yıkanmamış kuyu, pozitif (PMA tedavi hücreleri) ve negatif (kaplanmamış kuyuları) kontrolleri içerecektir. Her koşul en az üç kuyu (üçlü) set için. </li><li> Her bir oyuğa kaplama solüsyonu 50 ul ekle. Kaplanmamış kontrol kuyulara katmayın. 37 ° C inkübatör içinde bir saat boyunca inkübe edin. </li><li> Ucu kuyuların alt dokunmasına izin vermeden, nazikçe kaplama çözüm aspire. Yıkama çözeltisi, 50 ul bir kere yıkayın. </li><li> Yapışma çözeltisi 50 ul ilave edin ve 37 ° C inkübatör içinde bir saat için mikroplak inkübe edin. </li><li> Yavaşça aspire ve 50 ul yıkama çözeltisi ile yıkayın. Ancak bu gece boyunca 4 ° C&#39;de tutmak mümkündür, aynı gün plaka kullanarak, ve ertesi gün kullanın. </li></ol> Blood 2. T Hücre İzolasyonu <ol><li> 50 ul / ml o insan T hücresi zenginleştirme kokteyl eklemef tam kan (antikoagülan, 3 ml (heparin, EDTA veya sitrat) tam kan, örneğin kokteyl 150 ul ekle). İyice karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne 3 ml işlenmiş kan ve oda sıcaklığında% 1 D-glükoz ile zenginleştirilmiş bir (kalsiyum ve magnezyum olmadan) PBS eşit hacimde. Pasteur pipeti ile yavaşça karıştırın. </li><li> Santrifüj tüpüne 15 ml Ficoll-Paque PLUS ekleyin. </li><li> Dikkatle lenfosit izolasyon ortamında kan örneği seyreltilmiş 6 ml katman. </li><li> Ara kapalı olarak 20 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Arayüzde bozulmamış lenfosit tabakası bırakarak temiz bir Pasteur pipeti kullanarak üst katman kapalı çizin. Plazmanın üst tabakası daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Temiz bir Pasteur pipeti temiz bir santrifüj tüpüne lenfosit katman transferi kullanma. </li><li> Lenfositlere karşı PBS 3 hacim (9 mi) ilave edin. Hafifçe hücreleri tarafından askıya drakanat onları ve bir Pasteur pipeti dışarı. </li><li> 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje </li><li> Süpernatant kaldırmak. Lenfositler şimdi uygulama için uygun bir ortam içinde süspansiyon gerekir. 20 ml bir T-75 kültür şişesine transfer hücreleri,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı. </li></ol> Hücreler 3. Hazırlanması Not: hücreler, bir flüoresan tepkime maddesi ile etiketlenmiş edilmesi için bir ön şarttır. Bu protokolde ifade eden hücreler kabul edilebilir bir alternatiftir karboksi floresan süksinimidil ester (CFSE), bununla birlikte, yeşil flüoresan protein (GFP) kullanın. <ol><li> Hemasitometre kullanarak 2,4 x 10 6 T hücrelerini (her bir kuyu için 1 x 10 5) saymak. </li><li> Serumu (serum açlık) eksik kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. 37 ° C bir inkübatörde 2 saat boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 5 dakika (400 xg) için hücreler santrifüj. Medya ve aspire1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 1:1000 seyreltme (5 mM yapılan stok) CFSE ekleyin. Işıktan örtün ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 37 ° C PBS ile 10 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun ve 5 dakika boyunca 400 x g &#39;de dönerler. </li><li> Önceden ısıtılmış yapışma çözeltisi (50 ul başına 1 x 10 5 hücre) 1.2 ml hücre pelletini yeniden askıya. </li></ol> Hücreler 4. Uyarılması Not: yapışma başlatmak için, hücreler teşvik edilmelidir. Aşağıdaki deneyde hücreler, anti-CD3 antikorları ile çapraz bağlama, TCR ile uyarılır, ancak çözünebilir SDF-1, alternatif olarak hizmet verebilir. Deneylerin amacına bağlı olarak, çeşitli farmakolojik reaktifler hücre yapışması üzerindeki etkilerini incelemek için stimülasyon öncesi veya sırasında ilave edilebilir. Phorbol myristate asetat (PMA), ikinci haberci diasil gliserol (DAG) ile yapısal olarak benzer olan ve bu nedenle çok sayıda kinaz aktifleştiren bir forbol ester,alt TCR (özellikle protein kinaz C) s; burada bir pozitif kontrol olarak kullanılır. <ol><li> 37 ° C&#39;ye ısıtın mikroplak </li><li> 8 1.5 ml boş boruların (her bir tüpe 150 ul), her bir durum için, bir tüp içine hücreleri bölün. </li><li> Buna göre hücreleri tedavi: <ol><li> Pozitif kontrol olarak hizmet etmek için 10 ng / ml PMA ile bir tüp teşvik. Uyarılması için kontrolü (&quot;Hiçbir uyarım&quot;), yıkanmamış yükleme kontrol (&quot;hiçbir yıkama&quot;) ve ICAM-1 kaplama için kontrol (&quot;kaplanmamış&quot;) olarak hizmet etmek, işlenmemiş üç tüpleri tutun. </li><li> Anti-CD3 antikorlarının farklı konsantrasyonda (0.1, 1, 5, ve 10 ug / ml) ile dört tüp teşvik. Gecikme olmadan sonraki adıma devam edin. </li></ol></li><li> De her boş içine uyarılmış hücre karışımı aliquot 50 ul. Göz başına hücre nihai sayısı 1 x 10 5&#39;tir. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C inkübatör mikroplak yerleştirin. Not: Bazı T hücre hatları kısa uyarıdan gerektirir<html> tion zaman. Bu süre içinde, hücreler kuyu dibine yerleşmek ve hedef ligandlara bağlı. </li></ol> 5. Yıkama takım Yapışkan olmayan hücreler Not: Bu adımın amacı ligand kaplı yüzeyler ile sıkı bir temas oluşturmak için mümkün değildi hücreleri kaldırmaktır. Aynı fiziksel kuvvetler tüm oyuklara uygulanmasını sağlamak amacıyla, bu aşama için, çok kanallı bir pipet kullanın. Bu yapışık hücre yüzdesinin hesaplanmasında yardımcı olmak için yıkanmamış belirtilen kontrol kuyuları tutmak önemlidir. <ol><li> Her kuyu için, sıcak yapışma çözeltisi 150 ul ekle. Kuyulardan orta çıkarmadan önce birkaç saniye hafifçe plakayı sallayın. Ipuçları ile kuyuların dibine dokunmayın. </li><li> Bu adımı üç kez tekrarlayın. Tamponu ve dışarı pipetlerken pipet yönünü değiştirin. </li></ol> 6.. Yapışık hücrelerin yüzdesini belirlemek _content &quot;&gt; Not: Bu adımda, bir floresan plaka okuyucu içinde her bir floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan yoğunluk yapışık hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişki içindedir.. <ol><li> Plaka okuyucusu açın. Masaüstünde kısayol simgesini tıklatarak plaka okuyucu yazılımı açın. <ol><li> &quot;Görev&quot; menüsünden yeni bir protokol kurmak için &quot;Yeni&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> &quot;Eylemler&quot; menüsünden &quot;Oku&quot; seçeneğini seçin. &quot;Floresan yoğunluğu&quot; ı tıklayın ve &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> Menüsünden açılan &quot;Uyarma dalga boyu 485&quot; ve &quot;Emisyon dalga boyu 528&quot; seçeneğini seçin. &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Optik&quot; seçeneği menüsünde &quot;Bottom&quot; seçin ve &quot;Tamam&quot; sekmesine tıklayın. Geri &quot;Eylemler&quot; menüsüne gidin ve 37 ° C sıcaklığına ayarlamak ve &quot;Tamam&quot; a tıklayın. </li><li> Plaka okuyucu içine mikroplağı yerleştirin ve&quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Sonuç excel elektronik tablo halinde ihraç edilecek. </li></ol></li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak yapışkan hücrelerin yüzdesini hesaplayın: yapışık hücre yüzdesi = (yıkandı kuyularda oku ortalama floresan yoğunluğu) / (yıkanmamış hücre oku ortalama floresan yoğunluğu) x% 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

LFA-1 aktivasyonu ve T hücre yapışmasının 12 sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır. Akış sitometrisi bükülmüş ya da LFA-1 ya da genişletilmiş seçici olarak bağlanan monoklonal antikorlar kullanılarak canlı hücreler içinde LFA-1 afinite durumlarını ölçmek için kullanılır. Bu yöntemin sınırlamaları biri dikkate İntegrinler &#39;avidite almaz olmasıdır. Göç deneyleri yararlı araçlardır ama onlar belli bir zaman noktasında cimri yapışma değil göç ölç...

T lenfosit yapışma bağışıklık tepkisi 1 temel bir süreçtir. Bu tarama antijen hedef hücreler 2 ile lenf düğümleri içinde hücreler (APC) ve immünolojik sinaps oluşumu için (IS) için, endotel hücreleri, kılcal duvarlar dekorasyon ile T hücre etkileşimi için gereklidir. Bu gereksinimler, işlevsel ve kinetik farklıdır. Lenfositler ekstravazasyonunun süreci chemoattraction, haddeleme, sağlam yapışma ve göçü oluşur. Yapışmasını pekiştirmek için yuvarlanmaya geçiş hızlı bir G protein bağlı reseptör sinyaline yanıt T hücreleri gerektirir. Bu yanıt, haddeleme hücre 3 yavaşlatır ve tutuklama bir integrin ligand etkileşimini verir. Integrin aviditede ani bir değişim bu süreci aracılık eder. Göç &#39;ön uç&#39; de adezyonların oluşumu ve &#39;arka ucunda&#39; de yapışıklıklar kırılma dinamik etkileşimler betweenTcells ve endotel hücreleri gerektirirbiçimlendirilmiş ve 4 kırma arasında yaklaşık bir dakika ara ile. IS inminutes oluşturur, ama saat 6 bozulmadan kalması gerekiyor. İlginç bir şekilde, tek bir yapışma molekülü, integrin ailesi elemanıdır limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) - 1, tüm bu işlemler 5 için gereklidir. LFA-1, immünoglobulin süper familyasının çeşitli üyeleri ile etkileşim yoluyla bir yapışmaya neden olur. LFA-1, en yüksek afiniteye sahip en yaygın olarak incelenmiştir ligand arası yapışma molekülü (ICAM) -1. Non-aktive dolaşımdaki lenfositler, bu nedenle, hücre yüzeyi üzerinde LFA-1 ve ICAM-1 kaplı yüzeylerin uygun durumda olan düşük afiniteye ifade eder. LFA-1, değişken afinite ve bu tür G-protein kenetli reseptör aktivasyonu, sitokin stimülasyonu ve T hücre reseptörlerinin (TCR) kaynaklı sinyaller gibi çeşitli sinyal olayları tarafından düzenlenir. LFA-1 hücre dışı alanı, hücre içi aktivasyonu taşır Sonuçta elde edilen yüksek afiniteli bir şekilde tICAM-1 ile hrough etkileşimleri. Bu yol 7 sinyalizasyon iç-out denir. Benzer şekilde, hücre dışı alan ikinci LFA-1 ile sinyal dış-in sinyal olarak adlandırılır. Iç-dış ve sinyalizasyon dışarıdan katılan sinyal basamaklarının içi mevcut araştırmaların önemli bir odak noktası vardır. Küçük GTPaz Rap1 son zamanlarda TCR ligasyonu ve 8 sitokin sinyal için ortak olan sinyalizasyon iç-out anahtar bileşeni olarak ortaya çıkmıştır. T hücre yapışma baskın negatif Rap1 9 ekspresyonu ile bloke edilir ise integrin aktivasyonu Rap1 kritik rolü, Rap1 aşırı ifadesi T hücreleri integrin bağımlı yapışmayı teşvik keşfi ile vurgulanır. Rap1 tarafından integrin düzenleme anlayışımızda bu gelişmeler vitro araçları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bunlar arasında Burada açıklanan yapışma deneyidir. Bu yöntemin genel amacı T incelemektirICAM-1 kaplı yüzeylere hücre yapışma. Daha özel olarak ise, bu ölçmenin ve farklı koşullar altında, gerçek zamanlı canlı hücrelerde, karşı ligandları doğru LFA-1 afinite ölçmek için kullanılır. Bu teknik, T hücreleri ile etkileşime hücre yüzeyleri taklit etmek için ICAM-1 ile kaplanmış polistiren kuyu kullanır. Pek çok daha önce tarif edildiği statik T hücre yapışma deneyleri, deneysel karmaşıktı. Genellikle T hücreleri için gerekli Bu deneyler, radyoaktif etiketli T hücre yapışması için alt-tabaka olarak hücre dışı bir matris oluşturmak için kültürlenmiş sığır kornea hücreleri kullanılmaktadır, ya da T hücre yapışmasını 10 desteklemek için uzun bir süre boyunca fizyolojik olmayan, T hücresi uyarımı için çağrılacak. Diğer birçok deney sistemlerinde 11 kullanılan gibi, akış sitometrisi ve mikroskopi ile karşılaştırıldığında yapışma, inkübasyonu takiben T hücresi sayısını bulmak için florometrik ölçüm kullanılması miktarının daha hassas ve kesin bir yöntemdir. Buna ek olarak, tek bir hücre mikroskopintegrin lokalizasyon ic analizi fluorometrik ölçümü ile aynı şekilde geniş, nüfus tabanlı analiz için izin vermez. Aktivasyon durumu spesifik LFA-1 antikorlar, ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bu antikorlar, burada tarif edilen yönteme göre düşük duyarlılık sunmaktadır. Alternatif teknikler üzerinde ana avantajı sadeliği ve aynı anda birden fazla deneysel koşulları incelemek için yeteneğidir. Belirli bir uygulama için bu yöntemi göz önüne alındığında, bir T hücreleri olumsuz, seçilmiş taze izole edilmiş ve bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş gerektiğini dikkate almalıdır.

<table><tbody><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Hybrid</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate with optical bottom</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant ICAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibodies</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS containing calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Peripheral lymphocytes</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; mouse or human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 software</td><td>BioTek</td><td>Version 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>15 and 50 ml centrifuge tubes</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Disposable plastic Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75 culture flasks</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep T cell enricment kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

T lenfosit yapışması enflamasyon ve antijen sunan hücreler ile immünolojik sinaps oluşumu sitelerine göçü de dahil olmak üzere birden fazla T hücre fonksiyonları için gereklidir. T hücreleri, integrinler, ortak hücreler ya da hücre-dışı matrisi üzerinde hedef molekülü ile etkileşim transmembran proteinlerin çiftlerinden oluşan heterodimerik hücre yapışma moleküllerinin bir sınıf yapışkan özelliklerini kontrol ederek düzenlenmiş yapışmasını gerçekleştirmek. En belirgin T hücre integrin olan hedef hücre içi adezyon molekülü (ICAM) -1 alt birimi αL ve β2, oluşan, limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) -1. Yapışmayı kontrol etmek için bir T hücresinin yeteneği bireysel integrinlerin afinite durumlarını düzenleme yeteneğinden kaynaklanır. İç Çıkış sinyali, bir hücre içindeki sinyal integrinlerin dış etki aktive edilmiş bir durumunu almasına neden sayede işlemi tarif etmektedir. Bu karmaşık olayların bilgimizin çok mekanik dayanmaktadırçalışmalar, in vitro model sistemlerinde de basitleştirilmiş uygulandı. Burada anlatılan T lenfosit yapışma deneyi, T hücreleri, statik koşullar altında, molekülleri hedef alan uymak için sağlar ve daha sonra yapışkanlığını ölçmek için bir flüoresan plaka okuyucusu kullanır mükemmel bir araçtır. Bu deney, lenfositler üzerinde hareket yapışma uyarıcı ya da önleyici maddeler tanımlama, hem de söz konusu sinyal olayları için yararlı olmuştur. LFA-1, burada açıklanan halde - ICAM-1 aracılı yapışma; Bu deney hali hazırda başka bir yapışma etkileşimlerinde (- fibronektin örneğin VLA-4) çalışma sağlamak için adapte edilebilir.

Aşağıdaki, anti-CD3 antikorlarının çeşitli konsantrasyonları ile uyarılmış T-hücreleri, primer yapışma deneyinin bir örnektir. Bu yıkanmamış hücrelerin floresan (yani toplam yükleme) bilmek yararlıdır. Stimüle edilmemiş hücreler bir negatif kontrol olarak hizmet etmek ve PMA ile muamele edilmiş hücreler, anti-CD3 antikorları için pozitif kontrol edilir. Kaplanmamış kuyularda kaplı hücreler, ICAM-1 için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Uyarılmamış hücre yüzdesi% 10 il...

Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

15.9K Görüntüleme.  New York University School of Medicine.  Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir. 

Video: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Biyomühendislik

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Cell Migration and Cell Adhesion Assays to Investigate Leishmania-Host Cell Interaction

Leishmania is an intracellular protozoan parasite that causes a broad spectrum of clinical manifestations, ranging from self-resolving localized cutaneous lesions to a highly fatal visceral form of the disease. An estimated 12 million people worldwide are currently infected, and another 350 million face risk of infection. It is known that host cells infected by Leishmania parasites, such as macrophages or dendritic cells, can migrate to different host tissues, yet how migration contributes to parasite dissemination and homing remains poorly understood. Therefore, assessing these parasites' ability to modulate host cell response, adhesion, and migration will shed light on mechanisms involved in disease dissemination and visceralization. Cellular migration is a complex process in which cells undergo polarization and protrusion, allowing them to migrate. This process, regulated by actin and tubulin-based microtubule dynamics, involves different factors, including the modulation of cellular adhesion to the substrate. Cellular adhesion and migration processes have been investigated using several models. Here, we describe a method to characterize the migratory aspects of host cells during Leishmania infection. This detailed protocol presents the differentiation and infection of dendritic cells, the analysis of host cell motility and migration, and the formation of adhesion complexes and actin dynamics. This in vitro protocol aims to further elucidate mechanisms involved in Leishmania dissemination within vertebrate host tissues and can also be modified and applied to other cell migration studies.

Cell Migration and Cell Adhesion Assays to Investigate Leishmania-Host Cell Interaction

Here we study implications of Leishmania-host interaction by exploring Leishmania-infected dendritic cells migration. The differentiation and infection of dendritic cells, migration analysis, and the evaluation of adhesion complexes and actin dynamics are described. This method can be applied to other host cell migration studies when infected with Leishmania or other intracellular parasite species.

Leishmania is an intracellular protozoan parasite that causes a broad spectrum of clinical manifestations, ranging from self-resolving localized cutaneous ...

İnsan Nötrofillerinde β2 İntegrin Aktivasyon İnhibitörlerinin Taranması

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

Yazar Spotlight: β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntemin geliştirilmesi 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

Büyüme Faktörü Aracılı İntegrin Mekaniği ve Yapışmasını Ölçmek için Gerilim Ölçer Tether Probları

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro

Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Cell Migration and Cell Adhesion Assays to Investigate Leishmania-Host Cell Interaction

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Büyüme Faktörü Aracılı İntegrin Mekaniği ve Yapışmasını Ölçmek için Gerilim Ölçer Tether Probları