Spinning disk TIRF mikroskopisi sitoskelet alkanlığı sırasında proteinin rolünü incelemek için yararlı bir araç olabilir. Bu teknik, hücrede meydana gelen hızlı hücresel yaklaşımların üç boyutlu görüntülenmesi ve aynı zamanda plazma zarına yerleştirilen floresan molekülünün kesin lokalizasyonuna olanak sağlamıştır. Bu yöntem mikrobiyoloji, hücre biyolojisi ve plazma zarı ile hücresel çevre arasındaki etkileşimi incelemenin önemli olduğu tüm bu dallar gibi araştırma alanlarına içgörü sağlayabilir.
Bu yöntem, plazma zarındaki yapıların lokalize edilmesinin önemli olduğu ve aynı zamanda kalan hücresel hacmin yüksek çözünürlüğünü korumak istediğiniz canlı görüntüleme deneylerine genişletilebilir. Göz önünde bulundurulması gereken önemli şeyler TIRF aydınlatma ve diğer görüntüleme parametreleri kurmak ve transfected hücrelerin odak bulmak için uygun hücre hattı seçimi dir. Bu protokolün görsel gösteri kesinlikle görüntü edinimi sırasında hücrelerin işleme ile ilgili sorunları önlemek için yardımcı olacaktır.
Deneyden iki gün önce, tohum 3, 000 HELA veya NIH 3T3 hücreleri altı kuyulu bir hücre kültür plakasının her kuyunun içine iki mililitre tam büyüme ortamı içinde. Ertesi gün, transfeksiyon reaktiflerini hazırlayın. İlk olarak, azaltılmış serum orta 200 mikrolitre toplam RFP Livact ve YFP Vinculin bir mikrogram seyreltin.
Transfeksiyon reaktifini kısa bir süre girdap. Daha sonra 200 mikrolitre DNA'ya dört mikrolitre karışım ekleyin. Girdap reaktifler tekrar ve sonra oda sıcaklığında 15-20 dakika transfection karışımı kuluçka.
Kuluçkadan sonra, tüm transfection karışımı damla-doğrudan hücrelere ekleyin. Tabağı sallayarak kuyuları karıştırın ve sonra kuvöze geri yerleştirin. Deney günü, pbs Fibronectin mililitre çözeltisi başına 10 mikrogram ile ilk kaplama 35 milimetrecam alt çanak canlı görüntüleme için örnek hazırlayın.
Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca cam yüzeyde çözelti bırakın sonra çıkarın ve çanak hava kuru izin. Daha sonra, 0,1 mikron çapında çok floresan boncuk çözeltisini damıtılmış suda mililitre başına 1,8 milyar partikül yoğunluğuna seyreltin. 30 ila 60 saniye boyunca Fibronectin kaplı cam yüzeye çözelti ekleyin.
Sonra çözeltiyi çıkarın ve çanak hava kuru olsun. Floresan boncukile yemeklerin önceden boyanması sadece iki nedenden dolayı gereklidir, öncelikle hücreleri tohumlamadan önce TIRF düzlemini bulmak veya görüntü kaydı için iki renkli boncuk görüntüsü elde etmek istiyorsanız. Şimdi büyüme orta 0.1 milimolar nihai konsantrasyonda 0.1 molar askorbik asit çözeltisi ekleyerek bir anti-okside büyüme ortamı hazırlamak.
37 derece santigrat su banyosu yerleştirerek medya önceden ısıtın. Daha sonra hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın ve plakanın her kuyuya 250 mikrolitre Trypsin EDTA ekleyin. Hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın ve hücreler tamamen ayrılana kadar 2-3 dakika bekleyin.
Önceden ısıtılmış anti-oksitleyici büyüme ortamı bir mililitre hücreleri dikkatle resuspend ve 15 mililitrelik hücre kültürü tüpü nde orta ek dört mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna hafifçe açık bir kapakla % 5 karbondioksit ile tamponlanmış 37 santigrat derece lik bir kuvöz seti yerleştirin. Başlamak için, istikrarlı hücre kültürü koşulları elde etmek için mikroskobun çevresel kontrolü ne başlar.
Daha sonra önceden ısıtılmış anti-oksitleyici büyüme ortamı nın bir mililitresini içeren cam alt kabı önceden ısıtılmış mikroskobun numune tutucuya yerleştirin. Ardından, görüntüleme yazılımında, satın alma ayarlarını mikroskopta ayarlayın. Edinme süresini 30 saniyeye, süreyi 60 ile 90 dakika arasında ayarlayın.
Ayrıca, değeri bir noktaya ayarlayarak her zaman noktası için donanım tabanlı otofokus otomatik netleme işlevini etkinleştirin. Şimdi kamera pozlamasını 200 milisaniyeye, kazanç seviyesini 500'e ve lazer gücünü her kanal için %20'ye ayarlayın. Fototoksisiteyi azaltmak için yüksek kazanç seviyeleri, düşük maruz kalma süresi ve düşük lazer gücü önerilir.
Ardından, dönen disk kanalları için Z destesini 0,4 mikron aralıklı 10 mikrona ayarlayın, ardından en düşük düzlemdonanım otofokusu odak noktası olacak şekilde alt ofset'i sıfıra ayarlayın ve TIRF kanalları için Z-yığınlarını devre dışı bırakın. Son olarak, çok noktalı fonksiyon sahne pozisyonlarını etkinleştirin. Bu, 30 saniyelik bir aralıkta en fazla üç pozisyonun kaydedilmesine olanak sağlar.
Şimdi epifloresan aydınlatma ile floresan boncuk bulmak, bir TIRF kanal etkinleştirmek ve TIRF aydınlatma gösteren bir değer aydınlatma açısı ayarlayın. Ardından, mikroskop panelindeki düğmeye basarak otofokus'u etkinleştirin ve odağı ofset tekerleği ile ayarlayın. Odaklandıktan sonra, sonraki boncuk tabanlı görüntü kaydı için TIRF 488 ve TIRF 561 kullanarak iki renkli bir veri seti edinin.
Hücreleri kuvözden çıkarın ve kapalı tüpü 2-3 kez ters çevirerek hücre süspansiyonuna karıştırın. Sonra görüntüleme çanak hücrelerin bir mililitre uygulayın. Hızlı bir şekilde düşük düzeyde epifloresan aydınlatma ile çift transfected hücreleri bulmak.
Bulunduğunda, canlı kamera önizlemesindeki hücreleri parlak alan aydınlatmasını kullanarak ortaleyin ve konumu işaretleyin. Ardından, ilgi çekici bir ila ve iki nokta daha bulun, bunları pozisyonlar listesine kaydedin ve sıra düğmesine tıklayarak veri edinmeye başlayın. Başlangıçta, hücreler sahne hareketi nedeniyle kolayca kopabilir, böylece dört ila beş pozisyon ayarlamak ve daha sonra bir veya iki tane atmak daha iyidir.
Fiji'de kayıt gerektirmeyen bir hyperstack oluşturmak için, ilk olarak sağlanan dosyayı sd-TIRF_helper_jove indirin ve kaydedin. Fiji alt klasör makrolarında ijm. Eklentileri sonra makrolar ile başlayan menü komutunu tıklayarak makro çalıştırın ve nihayet çalıştırın.
Renk kanallarının kayıt düzeltmesi gerekiyorsa, seçeneği seçin ve simge sel dosyası olarak bilinen yeni bir boncuk tabanlı kayıt başvurusu oluşturun. Ardından, verileri biyoformat lar içe aktarıcıile aktarın ve görüntüleme seçeneği olarak hyperstack'i seçin. Görüntü veri kümesini yükleyin, ilk adımda dönen disk serisini ve ikinci adımda TIRF serisini seçin.
Bu noktada, Fiji kanal ve sahne konumuna göre sıralanmış verileri görüntüler. Önceden belirlenmiş yer işareti dosyasını yükleyerek kayıt düzeltmesini ilgili kanallara uygulayın. Sonra her dönen disk ve TIRF kanalı için istenilen renk arama tablosuseçin ve tek bir çok boyutlu hyperstack onları birleştirin.
TIRF görüntülerinin işlenmesi sırasında, alt düzleme bir dizi zed düzlem eklenir ve bu sayı dönen disk veri kümelerinde bulunan düzlem sayısıyla eşleşir. Bu son hiperyığının görsel temsili için çok önemlidir. Bu videoda açıklanan kurulum kullanılarak, YFP ve RFP ifade eden hücreler seçilmiş ve yapışma süreci 60 dakikalık bir zaman atlaması sırasında gözlenmiştir.
Beklendiği gibi, hücreler yuvarlak şekilli ve sadece zayıf membran çıkıntıları çevreyi algılama ve substrat ile temas ile başında yapışık edildi. Hücre matris teması, yeni doğan yapışıklıkların oluşması üzerine hızla güçlendi. Zamanla, yapışma kompleksleri genişlemiş ve odak yapışıklıklar olgunlaşmış.
Bu uzatılmış yapılar ağırlıklı olarak hücrenin çevresinde belirgindi. Bu, hücre matris yapışıklıklarının güçlenmesine ve aktin liflerinin donmasını tetikleyen actomiyozin lifleri tarafından uygulanan kuvvetlerden kaynaklandı. Hücre de aktin ağ oluşumu sonucu dümdüz.
Edinme hızı aşağıdaki parametrelere, zaman aralığına, pozlama süresine, zed düzlemlerinin sayısına ve pozisyon sayısına bağlıdır. Bu nedenle yüksek satın alma oranları için bu parametreleri optimize etmek çok önemlidir. En yeni dönen disk teknolojisinin uygulanması, dönen disk TIRF mikroskobunu yüksek zamansal hızlarda görüntülemeye olanak sağlayacak yeni süper çözünürlüklü mikroskopi tekniğine dönüştürecektir.
İplik disk mikroskobu hücre iç ve hücre zarı arasında meydana gelen süreçleri incelemek için çok güçlü bir tekniktir. Biz birkaç saniye içinde çok büyük görüntü yığınları elde ederek vezikül dinamiği takip edebilirsiniz gösterilmiştir. Kolimatlı lazer ışığı gözler için tehlikelidir.
Doğrudan ışına bakmayın ve doğrudan ışığa maruz kalmamak için cihazın güvenlik önlemlerini kullanın.
