Hirschil אמון, מייקל חוקרי קרנות מחקר רפואי ספירשטיין, והמלגה באוניברסיטת ניו יורק וייטהד תמכו עבודה זו.

1. ציפוי ולס Microplate הערה: המטרה של שלב זה היא למשטחי קלקר מעיל עם ICAM-1 לשמש ligands לתא T LFA-1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הציפוי על ידי resuspending רקומביננטי ICAM-1 עם פוספט שנאגרו מלוח פתרון (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 2 מ&quot;מ KH 2 PO 4, pH 7.4) מועשר בסידן (1 מ&quot;מ CaCl 2) ומגנזיום (2 ננומטר MgCl 2). ודא שהריכוז הסופי של ICAM-1 הוא 10 מיקרוגרם / מיליליטר, עשוי מפתרון מניות 0.7 מ&quot;ג / מיליליטר ושמר במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ההידבקות על ידי העשרת PBS עם אדם 0.5% (או שור) אלבומין בסרום (HSA / BSA), 2 מ&quot;מ MgCl 2, ו 1 מ&quot;מ CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לשטוף על ידי הוספת 2 מ&quot;מ MgCl 2 ו 1 מ&quot;מ CaCl 2 לPBS. לחמם את כל הפתרונות ל37° C לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 24 בארות עם 50 μl של פתרון לשטוף. זה יכלול בארות רחוצות, (תאים שטופל PMA) חיוביים, ו( בארות ללא ציפוי) שליליות שולטת. עבור כל תנאי שנקבע לפחות שלוש בארות (בשלושה עותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון ציפוי היטב כל אחד. אל תוסיף לבארות שליטה ללא ציפוי. דגירה במשך שעה אחת בתוך 37 חממת מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הציפוי בעדינות, מבלי לאפשר את הקצה לגעת בחלקו התחתון של הבארות. שטפי פעם עם 50 μl של פתרון לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון הידבקות ודגירת microplate במשך שעה אחת בתוך 37 חממת מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות ולשטוף פעם עם 50 פתרון לשטוף μl. השתמש בצלחת באותו היום, אך ניתן לשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה, ולהשתמש בו ביום שלמחרת. </li></ol> 2. בידוד תא T מהדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קוקטייל העשרת תא אנושי T ב50 μl / מיליליטר of כל דם (למשל עבור 3 מיליליטר של תרופה נוגדת קרישה (הפרין, EDTA, או ציטראט) כל דם, להוסיף 150 μl של קוקטייל). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להוסיף 3 מיליליטר של דם שטופל ונפח שווה של PBS (ללא סידן ומגנזיום) מועשר ב1% D-גלוקוז בטמפרטורת חדר. מערבבים בעדינות עם פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מיליליטר PLUS Ficoll-Paque לצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת זהירות מיליליטר 6 בדילול דגימת דם על מדיום הבידוד לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 עבור 20 דקות ב20 ° C עם הפסקה משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר את השכבה העליונה בעזרת פיפטה פסטר נקייה, ומשאיר את שכבת הלימפוציטים באין מפריע בממשק. השכבה העליונה של פלזמה ניתן לשמור לשימוש מאוחר יותר. בעזרת פיפטה פסטר נקייה להעביר את שכבת הלימפוציטים לצינור צנטריפוגות נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 כרכים (9 מיליליטר) של PBS לימפוציטים. להשעות את התאים בעדינות על ידי DRAכנפם פנימה וחוצה של פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 5 דקות ב20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. לימפוציטים עכשיו צריכים להיות מושעים במדיום המתאים לבקשה. להעביר את תאי בקבוק תרבות T-75 ב20 מיליליטר RPMI 1640 מדיה מכילה 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין. </li></ol> 3. הכנת התאים הערה: תנאי הכרחי הוא לתאים להיות מתויגים עם מגיב ניאון. בפרוטוקול זה משתמש באסתר carboxy העמסת succinimidyl (CFSE), חלבון ירוק לעומת זאת ניאון (GFP) תאי מבטאים הם חלופה מקובלת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן 2.4 x 10 6 תאי T (1 x 10 5 לכל גם) באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בתקשורת התרבות חסר סרום (נסיוב רעב). דגירה התאים עבור שעה 2 בחממת 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות (400 XG). לשאוב את התקשורת וresuspend ב 1 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף CFSE ב1:1,000 דילול (מניות שנעשו עד 5 מ&quot;מ). כסה מאור ודגירה במשך 8 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס PBS ולסובב ב XG 400 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תא גלולה עם 1.2 מיליליטר של תמיסה מחוממת מראש הידבקות (1 x 10 5 תאים לכל 50 μl). </li></ol> 4. גירוי של התאים הערה: על מנת ליזום הידבקות, יש לגרות את התאים. בניסוי הבא תאי מגורה דרך TCR באמצעות נוגדנים אנטי CD3 crosslinking, לעומת זאת מסיס SDF-1 יכול לשמש כחלופה. בהתאם למטרת הניסויים, ניתן להוסיף חומרים כימיים תרופתיים שונים לפני או במהלך הגירוי ללמוד את ההשפעה על הידבקות הסלולר. אצטט Myristate phorbol (PMA) היא אסתר phorbol כי הוא דומה מבחינה מבנית לגליצרול השני diacyl השליח (DAG) ולכן מפעיל קינאז מרובהזה במורד הזרם TCR (בעיקר חלבון קינאז C); כאן הוא משמש כביקורת חיובית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את microplate 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את התאים לתוך 8 1.5 מיליליטר צינורות ריקים (150 μl בצינור אחד), צינור אחד לכל מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את התאים בהתאם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר צינור אחד עם PMA ב10 ng / ml כדי לשרת את השליטה חיובית. שמור על שלושה צינורות שלא טופל, כדי שישמש כבקרה לגירוי (&quot;אין גירוי&quot;), בקרת טעינה רחוצה (&quot;לא לשטוף&quot;), ובקרה לציפוי ICAM-1 (&quot;ללא ציפוי&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר ארבעה צינורות עם ריכוזים שונים של נוגדנים אנטי CD3 (0.1, 1, 5, ו 10 מיקרוגרם / מיליליטר). המשך לשלב הבא ללא עיכובים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 50 μl תמהיל תא מגורה לכל ריק היטב. המספר הסופי של תאים לכל גם הוא 1 x 10 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את microplate ב37 ° C החממה במשך 15 דקות. הערה: שורות תאי T מסוימות דורשות Stimula קצר יותר<html> זמן tion. במהלך תקופה זו, התאים יירגעו לתחתית הבארות ולדבוק ligands היעד. </li></ol> 5. שטיפת תאים שאינם חסיד הערה: המטרה של שלב זה היא להסיר תאים שלא היו מסוגל ליצור קשר הדוק עם המשטחים מצופים ליגנד. השתמש פיפטה רבה לצעד זה על מנת להבטיח כי אותם הכוחות פיזיים חלים על כל הבארות. זה חשוב כדי לשמור על בארות שליטה המצוינות המלוכלכות כדי לסייע בחישוב של אחוז מתאים חסיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של פתרון הידבקות חם לכל בארות. לנער את הצלחת בעדינות במשך כמה שניות לפני הסרת המדיום מהבארות. אל תיגע בחלק התחתון של הבארות עם הטיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו שלוש פעמים. שינוי הכיוון של פיפטה כאשר pipetting החיץ פנימה והחוצה. </li></ol> 6. קביעת אחוז התאים חסידים _content &quot;&gt; הערה: בשלב זה קורא צלחת ניאון משמש למדידת עוצמת הניאון בתוך כל גם בעוצמה היא בקורלציה ישירה עם מספר התאים חסיד.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את קורא הצלחת. פתח את תוכנת צלחת קורא על ידי לחיצה על סמל קיצור דרך על שולחן העבודה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפריט &quot;המשימות&quot; לחץ על &quot;חדש&quot; כדי להגדיר את פרוטוקול חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפריט &quot;פעולות&quot; בחר באפשרות &quot;קרא&quot;. לחץ על &quot;עוצמת פלורסנט&quot; ופגעתי בכרטיסייה &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפריט הנפתח בחר &quot;גל עירור 485&quot; ו &quot;פליטת גל 528&quot;. הכה את הכרטיסייה &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט האפשרות &quot;אופטיק&quot; בחר &quot;תחתון&quot; ופגע &quot;אישור&quot; הכרטיסייה. חזור לתפריט &quot;פעולות&quot; ולהגדיר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את microplate לקורא הצלחת ולחץ על &quot;הפעלה&quot;. התוצאה ניתן לייצא לגיליון אלקטרוני Excel. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז התאים חסיד באמצעות הנוסחה הבאה: אחוז התאים חסיד = (עוצמת ניאון ממוצעת לקרוא בבארות שטפו) / (עוצמת ניאון ממוצעת קוראת בתאים רחוצים) x 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ישנם מספר מבחני כדי ללמוד אותות להפעלת LFA-1 והידבקות תא T 12. Cytometry זרימה משמשת למדידת מדינות זיקה LFA-1 בתאים חיים באמצעות נוגדנים חד שבטיים אשר נקלטות באופן סלקטיבי לאו bended או מורחב LFA-1. אחת המגבלות של שיטה זו היא שהיא אינה לוקחת בחשבון הלהיטות &#39;integrins. מבחני הגירה ה...

הידבקות הלימפוציטים T היא תהליך יסודי בתגובה החיסונית 1. היא נדרשת לאינטראקציה תא T עם תאי אנדותל לקשט את קירות נימים, לאנטיגן סריקת הצגת תאים (APC) בבלוטות הלימפה, ולהיווצרות של סינפסות החיסונית (IS) עם תאי המטרה 2. דרישות אלה הן מבחינה פונקציונלית וkinetically מובחן. התהליך של extravasation ימפוציטים מורכב מchemoattraction, הדבקה מתגלגלת, מוצקה, וגלגול. המעבר מהגלגול למיצוק הידבקות דורש תאי T להגיב לאות קולטן מצמידים חלבון G במהירות. תגובה זו מניבה אינטראקציה יגנד integrin שמאטה ומעצרי התא מתגלגל 3. שינוי מיידי בלהיטות integrin מתווך את התהליך הזה. הגירה דורשת betweenTcells אינטראקציות דינמית ותאי האנדותל עם היווצרות של הידבקויות ב&#39;הקדמי &#39;ושבירה של הידבקויות ב&#39;האחורי&#39;עם מרווח של כדקה בין יוצרים ושבירת 4. הוא צורות inminutes, אבל צריך להישאר ללא פגע במשך שעות 6. מעניין לציין, כי מולקולת הידבקות אחד, פונקצית משפחת integrin הלימפוציטים חבר אנטיגן קשור (LFA) - 1, היא חיונית לכל התהליכים הללו 5. LFA-1 מתווך הידבקות דרך אינטראקציות עם כמה מחברי superfamily אימונוגלובולינים. ליגנד למד נרחב ביותר בזיקה הגבוהה ביותר לLFA-1 הוא מולקולת ההידבקות אינטר (ICAM) -1. ללא הפעילו לימפוציטים במחזור להביע את הזיקה נמוכה LFA-1 על פני התא, ולכן אינם מסוגל לדבוק מצופה ICAM-1-משטחים. זיקת LFA-1 היא משתנה ומוסדר על ידי מספר אירועי איתות כגון הפעלת חלבון G בשילוב קולטן, גירוי ציטוקינים, ואותות מתווכים על ידי קולטנים תא T (TCR). צורת זיקה גבוהה וכתוצאה מכך של LFA-1 מעביר הפעלה תאית למרחב תאי לאאינטראקציות hrough עם ICAM-1. מסלול זה נקרא מבפנים החוצה איתות 7. כמו כן, איתות דרך LFA-1 מהמרחב תאי נקראת מחוץ-באיתות. איתות תאית מפלים מעורבים במבפנים החוצה ומחוץ-איתות הוא מוקד עיקרי של מחקר הנוכחי. GTPase Rap1 הקטן התפתחה לאחרונה כמרכיב המרכזי של מבפנים החוצה מאותת כי משותף לשתי קשירת TCR וציטוקינים איתות 8. התפקיד הקריטי של Rap1 בהפעלת integrin מודגש על ידי הגילוי כי ביטוי יתר של Rap1 מגרה הידבקות integrin תלויה בתאי T, ואילו הדבקת תא T חסומה על ידי ביטוי של Rap1 השלילי הדומיננטי 9. מקדמות אלה בהבנה של הרגולציה integrin ידי Rap1 שלנו היו להשיג באמצעות כלים במבחנה. אחד מהם הוא assay ההידבקות סטטית שתואר כאן. המטרה הכללית של שיטה זו היא ללמוד Tדביקות תא לICAM-1 משטחים מצופים. באופן ספציפי יותר, הוא משמש כדי למדוד באופן אובייקטיבי ולכמת זיקת LFA-1 לכיוון ligands הנגד שלה בתאים חיים בזמן אמת, בתנאים שונים. טכניקה זו משתמשת בארות קלקר מצופים ICAM-1 כדי לחקות את המשטחים התאיים שתאי T אינטראקציה עם. מבחני הידבקות תא T סטטי שתוארו קודם לכן רבים מהם היו בניסוי מורכבים. מבחני אלה לעתים קרובות נדרשים לתאי T שכותרתו רדיואקטיבית, מנוצלים תאים קרני שור בתרבית כדי ליצור מטריצה ​​תאית כמצע להידבקות תא T, או שנקראים לגירוי תאים לא פיסיולוגי T על הארכת משך לקדם הידבקות תא T 10. השימוש במדידת fluorometric לכמת תאי T הבאים הדגירה ההידבקות היא שיטה רגישה יותר ומדויקת של כימות בהשוואה לזרימת cytometry ומיקרוסקופיה, כמנוצלים במערכות רבות assay אחרים 11. בנוסף, microscop תא בודדניתוח ic של לוקליזציה integrin אינו מאפשר ניתוח באותו אופן כמו מדידת fluorometric הרחב, האוכלוסייה מבוססת. בעוד נוגדני מדינה ספציפית הפעלת LFA-1 זמינים באופן מסחרי, נוגדנים אלה מציעים רגישות נמוכה יחסית לשיטה שתוארה כאן. היתרון העיקרי על פני שיטות חלופיות הוא בפשטותו והיכולת לבחון תנאי ניסוי מרובים בו זמנית. כאשר שוקלים בשיטה זו עבור יישום מסוים, יש לקחת בחשבון שתאי T צריכים להיות נבחרו באופן שלילי, מבודדים טרי, ושסומנו בסמן פלואורסצנטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

הידבקות הלימפוציטים T נדרש עבור פונקציות מרובות תא T, כולל הגירה לאתרים של דלקת והיווצרות של סינפסות החיסונית עם תאי המציגים אנטיגנים. תאי T להשיג הידבקות מוסדרת על ידי שליטה על מאפייני ההדבקה של integrins, ברמה של מולקולות הידבקות תא מורכבות מזוגות heterodimeric של חלבונים הטרנסממברני כי אינטראקציה עם מולקולות מטרה בתאי שותף או מטריקס. Integrin תא T הבולט ביותר היא פונקצית הלימפוציטים אנטיגן קשור (LFA) -1, שהורכב מיחידות המשנה αL וβ2, היעד שלו היא המולקולה תאית ההידבקות (ICAM) -1. יכולתו של תא T כדי לשלוט בהדבקה נובעת מהיכולת לווסת מצבי הזיקה של integrins בודדת. איתות מבפנים החוצה מתארת ​​את התהליך שבו אותות בתוך תא יגרמו לתחומים החיצוניים של integrins להניח מצב מופעל. הרבה מהידע של תופעות מורכבות אלה שלנו מבוסס על מכניסטיתמחקרים שבוצעו בפשוט במערכות מודל חוץ גופית. Assay הידבקות הלימפוציטים T שתואר כאן הוא כלי מצוין שמאפשר לתאי T לדבוק ביעד מולקולות, בתנאים סטטיים, ולאחר מכן משתמש בקורא צלחת ניאון לכמת דביקות. assay זה כבר שימושי בהגדרת חומרי הדבקת גירוי או מעכבת הפועלים על לימפוציטים, כמו גם המאפיינים את אירועי האיתות מעורבים. למרות שתואר כאן לLFA-1 - ICAM-1 הידבקות בתיווך; assay זה ניתן להתאים בקלות כדי לאפשר לחקר אינטראקציות אחרות דבק (למשל VLA-4 - פיברונקטין).

להלן דוגמא של assay הידבקות תוך שימוש בתאי T עיקריים מגורה עם ריכוזים שונים של נוגדנים אנטי CD3. זה שימושי לדעת את הקרינה של תאים רחוצים (כלומר טעינת סך הכל). תאי unstimulated לשמש כביקורת שלילית ותאים שטופלו PMA הם הבקרה החיובית לנוגדנים אנטי CD3. תאים מצופים בבארות ללא ציפוי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

assay הידבקות סטטית הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש מודל האינטראקציות בין לימפוציטים מסוג T וסוגי תאים אחרים. אינטראקציות מופקות על ידי הזרקת תאי T שכותרתו לתוך הבארות מצופים במולקולות הדבקות, ואילו קורא צלחת משמש לכמת את מספר התאים חסיד הבאים שוטף סדרתי.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

15.9K Views.  New York University School of Medicine.  assay הידבקות סטטית הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש מודל האינטראקציות בין לימפוציטים מסוג T וסוגי תאים אחרים. אינטראקציות מופקות על ידי הזרקת תאי T שכותרתו לתוך הבארות מצופים במולקולות הדבקות, ואילו קורא צלחת משמש לכמת את מספר התאים חסיד הבאים שו?...

Video: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...