Name: a protocol to infect caenorhabditis elegans with salmonella typhimurium
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium at JoVE.com

Biz yazının eleştirel okuma Dr Diane Baronas-Lowell teşekkür ederim. Bu çalışma, Fen Tohum Grant bir FAU Charles E. Schmidt Koleji ve KJ için Ellison Tıp Vakfı bir Yaşlanma Bursu tarafından desteklenen

1.. XLD (ksiloz Lizin desoksikolat) Agar Tabaklar XLD agar XLD agar plakaları üzerinde siyah koloniler görünür Salmonella, bir seçimli büyüme ortamı kullanılarak bir. Kontaminasyon endişeler vardır, ancak normal bir LB plakası ikame edilebilir. <ol><li> 5 ml iyonu giderilmiş su içinde 5.5 g XLD agar ve tekrar süspansiyon tartıldı. </li><li> Tüm ağar ıslak kadar iyice karıştırın. Topaklar gitti ve ortam tamamen yeniden süspansiyon haline gelinceye kadar deiyonize su 95 ml ilave edilir. </li><li> Tamamen (otoklavlamayın yok) eritmek için orta kaynatın. </li><li> 50 ° C oda sıcaklığında, ortam soğutun </li><li> Her biri 95 x 15 mm (çap x yükseklik) plaka (Parafilm ile sızdırmaz plakalar, 1 ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir) 25 ml agar dökün. </li></ol> 2.. Nematodu Büyüme Orta (NGM) RNAi Tabaklar Besleme C. hazırlanması elegans NGM plakalar, daha önce tarif edilmiştir 19. Burada bir prosedür kısaca RNAi besleme plakaları yapmak için NGM ortamı içine antibiyotik ampisilin ve RNAi kimyasal indüktör izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin tarif edilir. <ol><li> 3 g NaCl ve 1 L iyonu giderilmiş su içinde 2.5 g Bacto pepton çözülür. </li><li> Ortam içine 17 gr Bacto ağar ekleyin. </li><li> 45 dakika boyunca ortam otoklav ve bir su banyosu içerisinde 50 ° C&#39;ye kadar ortam soğutun. </li><li> 1 ml kolesterol (% 95 etanol içinde 5 mg / ml), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4 ve 25 ml 1 M potasyum fosfat tamponu (pH 6.0): aşağıdaki çözümleri ekleyin. İyice karıştırın. </li><li> 1 ml 1 M IPTG ve 500 ul ampisilin (steril su içinde 100 mg / ml) eklenir. </li><li> Iyi çözüm karıştırın ve Pipet yardımcısı kullanarak ve steril prosedürleri takip 25 mi serolojik pipet 60 x 15 mm (çap x yükseklik) petri tabak içine dökün. 12 ml agar ile her bir plak doldurun. Plakalar kadar 1 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Temel autophagy geni bec-1 Salmonella enfeksiyonuna karşı savunma bir konak genin işlevini incelemek için bir örnek olarak kullanılmıştır. Deney prosedürleri, Şekil 1 ve Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Bulaşmasına RNAi ile muamele edilmiş hayvanların hazırlanması için protokol, parantez içinde verilmektedir, her deney aşamasının gün izler. <ol><li> Bec-1 RNAi besleme inoküle ve 100 mg / ml ampisilin (Gün 1) ile desteklenmiş 2 ml LB ortam içine -80 ° C donmuş bakteri pul yerleştirilerek boş vektör L4440 RNAi bakteri besleme kontrolü. Taze RNAi bakteri olması tüm deney boyunca haftada bir kez bu adımı tekrarlayın. Kullanılmadığı zaman, 4 ° C buzdolabı içinde kültür saklayın. </li><li> RNAi tabakalarına RNAi bakteri kültürü gece boyunca 100 ml tohum. Üç bec-1 RNAi ve üç kontrol boş v hazırlayınRNAi plakaları ector. 37 ° C gece boyunca (Gün 2) de inkübe edin. </li><li> 37 ° C inkübatör RNAi plakaları kaldırmak ve onları bankta oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Besili L4 vahşi tip N2 Hermafroditler Pick up ve onları RNAi-1 bec ve boş vektör RNAi plakaları kontrol transfer. , Üçlü plakalar üzerinde, plaka başına üç solucanlar yerleştirin. Aşama 3.2 (Gün 3) &#39;de anlatılan ile aynı günde, RNAi plakaları hazırlar. </li><li> Adım 3.3 &#39;de hazırlanan taze gelen RNAi plakaları 36-40 saat ve transfer solucanlar için 20 ° C inkübatör solucanlar ile RNAi inkübe edin. Solucanlar aktarılır sonra 64 saat (Gün 4) için 20 ° C inkübatör içinde inkübe edin. </li></ol> 4. Enfeksiyon için Salmonella hazırlayın <ol><li> Streak Salmonella -80 ° C dondurulmuş 1 XLD agar plaka üzerinde stok ve gece (5 Gün 37 ° C plaka inkübe </stRong&gt;). </li><li> Bir iyi izole edilmiş siyah Salmonella koloni almak ve (Gün 6) bir karışımı çalkalanarak 37 ° C&#39;de 2 ml LB ortamı içinde inoküle. </li><li> 1 C. Tohum 80 ml ​​Salmonella gecede kültür elegans 60 x 15 mm (çap x yükseklik) NGM agar plaka ve toplam 6 plakaları hazırlamak. 6 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bakteri kültürü plakasının (Gün 7) üzerine, bir çim kuru ve oluşturmalıdır. </li></ol> Salmonella, 5. Infect RNAi ile muamele Worms <ol><li> Transferi bec-1 RNAi tedavi ve Salmonella plakalarına boş vektör RNAi tedavi L4 N2 çift cinsiyetli (Adım 3 kurmak solucanlar döl) kontrol eder. Her bir grup için 3 levhaları üzerinde plaka başına 40 solucanlar yerleştirin. 48 saat (Gün 7) 20 ° C&#39;de sonsuz inkübe edin. </li><li> Adım 3.1 ve 3.2 (Gün 7&#39;de tarif edildiği gibi, taze RNAi plakaları bir takım hazırlanması ve <strong&gt; Gün 8). </li><li> 48 saatlik enfeksiyondan sonra, aşama 5.2 &#39;de hazırlanan karşılık gelen RNAi plakalara Salmonella ile enfekte olmuş solucan aktarın ve 20 ° C (gün 9) de inkübe edilir. </li></ol> 6.. Kurtuluş Testi <ol><li> Günlük solucanlar hayatta Puan ve yumurtlama zamanında taze gelen RNAi plakaları solucanlar transfer. Adım 3.1 ve 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi önceki her sarmal transfer taze RNAi plakaları bir dizi hazırlayın. Yavaşça bir uçtan basık platin tel ile solucan vücudu (baş, orta kısım ve kuyruk) dokunun. Solucan gövdesinin hiçbir hareket görülmediği takdirde bir solucan ölü olarak puanlanır. </li><li> Günlük solucan veya her gün hayatta kalma Puan ve solucanlar yumurta döşeme durdurmak sonra iki kez bir hafta taze gelen RNAi plakaları solucanlar transfer. </li><li> Tüm solucanlar Öldükten sonra, bir veri kümesi olarak üçlü plakaları sağkalım verileri havuzu. GraphPad P olarak uygun istatistiksel yazılım içine her grubun girdi sağkalım verilerisağkalım eğrileri oluşturmak ve Kaplan-Meier sağkalım analizi yapmak Rism. Tüm deney sonucu teyit etmek için en az bir kez tekrarlanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , (1997).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+host+for+the+study+of+host-pathogen+interactions.">Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+genetic+model+for+the+study+of+innate+immunity.">Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity.</a> Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).</li><li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions.">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).</li><li>Ford, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+descriptive+study+of+human+Salmonella+serotype+typhimurium+infections+reported+in+Ontario+from+1990+to+1997.">A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997.</a> Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).</li><li>Voetsch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoodNet+estimate+of+the+burden+of+illness+caused+by+nontyphoidal+Salmonella+infections+in+the+United+States.">FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States.</a> Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).</li><li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans.">Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li><li>Alegado, R. A., Tan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antimicrobial+peptides+contributes+to+persistence+of+Salmonella+typhimurium+in+the+C.+elegans+intestine.">Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine.</a> Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).</li><li>Jia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+protect+against+Salmonella+typhimurium+infection+and+mediate+insulin+signaling-regulated+pathogen+resistance.">Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).</li><li>Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans-based+screen+identifies+Salmonella+virulence+factors+required+for+conserved+host-pathogen+interactions.">Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions.</a> Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole.">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li><li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans.">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li><li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing.">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li><li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans.">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

C. elegans onun besin kaynağı olarak bakteri yiyor basit bir genetik model organizmadır. Böylece, C arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir bağırsak patojen ile normal bakteriyel gıda yerine kolaydır elegans ve seçilen patojen. Burada bir protokol Salmonella enfeksiyonu ve C birleştirmek için açıklanan elegans RNAi Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için tedavi besleme. Önceki enfeksiyon protokol...

Serbest yaşayan toprak nematod Caenorhabditis elegans birçok biyolojik soruları incelemek için kullanılan basit ve genetik uysal bir model organizmadır. C. elegans egemen kendini gübreleme çift cinsiyetli olarak var. Erkekler kendiliğinden gametogenezi 1,2 sırasında X kromozomu olmayan disjunction tarafından oluşturulur. Bol yiyecek, C varlığında elegans sürekli yetişkin Dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Sıcaklık da C etkilemektedir elegans gelişimi; Daha hızlı gelişimi, daha yüksek sıcaklıklarda görülmektedir. Laboratuvarda, C. elegans gıda 1,2 olarak tohumlanmış bakteri Escherichia coli (suş OP50) ile agar plakaları üzerinde 20 ° C&#39;lik bir sabit bir sıcaklıkta kültürlenir. Son on yıl içinde, C. elegans konak-patojen 3-5 incelemek için bir omurgasız organizma olarak ortaya çıkmıştır. Doğada, C. elegans onun nutrien olarak bakteri yiyort kaynak 1,2. Bu normal bakteri laboratuar gıda, OP50, kolayca C arasındaki etkileşimi incelemek için diğer patojenler ile ikame edilebilir elegans ve seçilen herhangi bir patojen. Bu koşullar altında, bağırsak enfeksiyonun birincil sitesidir. Gerçekten de, bakteriyel patojenlerin geniş bir yelpazede ölümcül C enfekte ettiği gösterilmiştir elegans 3-5. Gram-negatif bakteri Salmonella çapında 6,7 insan gıda kaynaklı hastalığa neden olan bir gastrointestinal patojendir. C. Bu bakteri çoğaltır ve kalıcı bağırsak enfeksiyonları 8-10 sergiler gibi elegans Salmonella typhimurium için iyi bir model ev sahipliği yapmaktadır. C. elegans roman hem tanımlamak için kullanılmıştır, ve daha önceden bilinen Salmonella hastalık oluşturma faktörleri 11. İlginç bir şekilde, C. elegans bağışıklık sistemi başarıyla Salmonella çoğaltma sınırlar. O Inhib önce rapor edilmiştirautophagy genlerin enfraruj C&#39;de artan Salmonella çoğaltma işler elegans, enfekte solucan 10 erken ölüm ile sonuçlanır. (Burada Otofaji olarak anılacaktır) Macroautophagy bozulması için 12 lizozom teslimat için sitoplazma ve ayırmak için hücre içi organellere zarlarının yeniden düzenlenmesini içeren bir dinamik bir süreçtir. Autophagy C. Salmonella çoğaltma sınırlamak için bildirilmiştir elegans ve memeliler de 10,13. C. elegans genomu ilk çok hücreli ökaryot genom olduğu; Bu RNAi tedavi 14-16 yanıt verici olmaktadır. Ayrıca, RNAi RNAi 16,17 besleme olarak bilinen hedef genin, bir iki-şeritli RNA içeren bakteri yemek için solucan tabi tutulması ile etkili bir şekilde idare edilebilir. Tüm genom RNAi besleme kütüphaneler genom RNAi 16,18 taranması için oluşturulan edilmiştir. Burada, bir Salmonella enfeksiyonu protocol RNAi test C&#39;ye izin beslenme ile birleştiğinde Salmonella enfeksiyona karşı koruma kabiliyetleri için ilgi çekici elegans genler.

<table><tbody><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD agar</td><td>EMD Chemicals</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella typhimurium&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 x 15 mm&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serological pipet</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet-Aid</td><td>Fisher</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 shaking incubator&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol to infect caenorhabditis elegans with salmonella typhimurium

Son on yıl içinde, C. elegans gram-negatif bakteri Salmonella typhimurium karşı ev sahibi savunma da dahil olmak üzere, ana ve patojen arasındaki etkileşimleri incelemek için bir omurgasız organizma olarak ortaya çıkmıştır. Salmonella C bağırsakta inatçı enfeksiyon oluşturur elegans ve enfekte olmuş hayvanlar arasında erken ölüm ile sonuçlanır. Bağışıklık bir takım mekanizmalar C de tespit edilmiştir Salmonella enfeksiyonlarına karşı savunmak için elegans. Autophagy, evrimsel olarak muhafaza edilmiş lizozomal bozunma yolağı, C. Salmonella çoğaltma sınırlamak için gösterilmiştir elegans ve memelilerde. Burada, protokol C bulaştırmak için açıklanan Solucanlar Salmonella, insanlarda enfeksiyona benzer bir süre için, Salmonella maruz edildiği Salmonella typhimurium ile elegans. Salmonella enfeksiyonu önemli C ömrü kısaltır elegans &lt;/ Em&gt;. Bir örnek olarak temel autophagy geni bec-1 kullanarak, C ile bu enfeksiyon yöntemi Birleştirilen elegans RNAi yaklaşım besleme ve bu protokol C işlevini incelemek için kullanılabilir gösterdi Salmonella enfeksiyonu karşı savunmada elegans konak genler. Yana C. elegans tüm genom RNAi kütüphaneler kullanılabilir, bu protokol kapsamlı C taranması için mümkün kılan genom RNAi kütüphaneleri kullanılarak Salmonella ve diğer bağırsak patojenlere karşı korumak elegans genler.

20 ° C&#39;de, vahşi tip N2 solucanlar medyan ömrü. Salmonella enfeksiyonu belirgin 10.5 gün N2 solucanlar medyan ömrünü azaltır 17 gün (Şekil 2A ve Tablo 2) (p = 0.0002, log-rank testi) (Şekil 2A .) Bir C. elegans geninin Salmonella hastalıklara karşı önemli bir rol oynar, kendi inhibisyon Salmonella enfeksiyona karşı yatkınlığın vermek olacağı tahmin edilmektedir. Aslında, Sa...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium at JoVE.com

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans konak-patojen etkileşimleri çalışmak için yeni bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada C bulaştırmak için bir protokol açıklar Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için çift iplikli RNAi girişim tekniği ile birleştiğinde Salmonella typhimurium ile elegans.

Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

11.5K Görüntüleme.  Florida Atlantic University.  C. elegans konak-patojen etkileşimleri çalışmak için yeni bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada C bulaştırmak için bir protokol açıklar Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için çift iplikli RNAi girişim tekniği ile birleştiğinde Salmonella typhimurium ile elegans. 

Video: A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetik

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Caenorhabditis elegans gıda alımını ve ömrünü ölçmek için yüksek verimli test

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Yazar Spotlight: Lipotoksisite ve HFpEF Arasındaki İlişkiyi Keşfetmek 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Davranış

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Bulaştırmak için bir protokol

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Otomatik Ayırma

Fenotipinin yüksek verim Deneyi

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu