Bu proje (AJB ve LGA, R01 AI076246 için) Sağlık NIAID National Institutes için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir. Salmonella mutant koleksiyonu kısmen Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (MM için, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 ve R01 AI039557-11 AI075093-01) HKP, R21 kısmen Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, (tarafından desteklenen AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Biz kopya kaplama ve koleksiyonunda mutantlar teyit için Steffen Prowollik teşekkür ederim.

1. Sıçangil Makrofaj Hücre Kültür RAW264.7 <ol><li> Düşük geçiş sayısı sıçangil makrofaj hücreleri büyütmek,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde, T-75 hücre kültür şişesi havalandırılmış kap içinde filtre RAW264.7 (ATCC ® sayısı TIB-71) (FBS) ,% 0.5 NaHCO3 ve% 1,% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 100 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),. </li><li> Hücreler şişe içinde bir% 60-80 izdiham ulaştığınızda, hücreler hasat için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bir hemasitometrede hücrelerin sayısı ve hücre konsantrasyonunu hesaplamak. </li><li> Hücrelerin tekrar taze DMEM hücre kültür ortamı içinde 2.5 x 10 5 ug / ml içine hücre seyreltilmesi. 96-iyi hücre kültür plakalarının her çukuruna 5 x 10 4 hücrelerini ihtiva eden DMEM hücre kültür aracı maddesi 200 ul plaka için çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Her bir Salmonella soyu dört kuyu Plate. Bir dizi için üç ayrı tabak kurmakfagositik hücreler işgali testinin, sırasıyla, &quot;dernek&quot;, &quot;istila&quot; ve &quot;çoğaltma&quot; ile işaretleyin. </li><li> Makrofaj hücreleri kuyu altına bağlamak için izin vermek için 37 ° C de% 5 CO2 inkübatöründe tabak yerleştirin. </li></ol> Salmonella Yabani-tip ve Mutantlarının 2. Hazırlık <ol><li> RAW264.7 makrofaj hücrelerinin hazırlanması için aynı günde (vahşi tip tek koloniler (WT), Salmonella enterica serotip Typhimurium 14028s, Luria-Bertani içinde DinvA mutantı DphoP bir mutantı olduğu ve arzu edilen test mutant soyunun kültür bunları almak LB) et uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. 10 mutant suşlar (DinvA mutant ve DphoP mutant sırasıyla, işgali ve hücre içi çoğaltma kusurlu olan) kadar test etmek fagositik hücreler işgali tahlillerin her kümesi kullanın. </li><li> S, 37 ° C&#39;de 14 saat boyunca bakteri büyütünTabanı yuvarlak bir tüp içinde gevşek bir şekilde kapatılmış, 14 ml polipropilen, 5 ml LB sıvısı içinde her 220 rpm&#39;de Haking. LB suyu bizim durumumuzda, mutant suş en Kanamisin dirençli olan uygun antibiyotikleri içeren, 50 ug / ml </li><li> Ertesi gün, 220 rpm&#39;de sallama ile ilave 4 saat boyunca 1:50 oranında LB sıvılarına düz 5 ml Salmonella türlerinin kültürleri üzerinde her bir alt-kültürü. </li><li> Bir spektrofotometre ile OD her bakteri kültürü 600 değerlerini okuyun ve her okuma Salmonella patojenite ada-1 Tip III sekresyon sistemi işgali için (SPI-1 TTSS) gen ifadesini optimize 0,6-1,2 aralığında olmalıdır. </li><li> 1 OD formülünü kullanarak 600 = 7.5 x 10 8 CFU sonra, bakteri konsantrasyonu tahmin eden taze DMEM hücre kültür aracı maddesi içinde 5 x 10 6 CFU / ml &#39;lik bir konsantrasyona seyreltilmesi bakteri / ml olmuştur. </li></ol> 96 oyuklu bir kültür plakasına 3. Yayılması Deneyi <ol><li> Üç 96-çukurlu cel kaldırL kültür CO2 inkübatör plaka ve her bir kuyu yıkama 1x PBS tamponu içinde 200 ul bir kez. </li><li> PBS yıkama ve tamamen çıkarılmasından sonra her bir oyuğa 200 ul bakteri DMEM ortamında (yukarıya bakınız) ekleyin. Bu enfeksiyon çokluğu ve her bir oyuğa, 20 (MOI) olarak 1 x 10 6 Salmonella hucrelerinin ile sonuçlanır: 1 arasındadır. </li><li> Daha sonra 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe plakaları (zaman sıfır) yerine, 10 dakika boyunca mühürlü bir taşıyıcı içinde 1000 x g&#39;de santrifüjleyin plakaları. Her suşu için, en az dört çift kuyu kurmak. </li><li> 30 dakika sonra inkübatörden plakaları kaldırmak ve ilişkilendirilmemiş bakterileri çıkartmak için 1x 200 ul PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Yıkamadan sonra, ileri tedavi için &quot;dernek&quot; ile etiketlenmiş plakasını kaydedin. Sipariş t &quot;işgal&quot; ve &quot;çoğaltma&quot; işaretli plakalarının her bir oyuğuna 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM ortamı içinde 200 ulo. dışı Salmonella öldürmek ek bir saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka plakaları dönün. </li><li> , Makrofaj hücre sayısını kaydetmek için, her enfekte türünden de sakla, 10 dakika boyunca% 1 Triton X-100 içeren PBS 1x 200 ul &quot;ilişki&quot; levha üzerindeki kuyu kalan tedavi. Triton çözüm makrofaj hücreleri lize ve ilişkili Salmonella yayınlayacak. </li><li> Her bir çukurdaki Hasat Salmonella ve 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine yerleştirin. Her kuyudan hasat numuneler üzerinde 900μl PBS ile üç 1 x 10 kat seri seyreltmeleri yapın, girdap her seyreltme ile gerçekleştirilir. </li><li> Ya LB (WT) ya da LB Kan (mutantlar) plakalar üzerinde üçüncü seyreltme, 10 -3, Plate. Uygun Salmonella cinsi adı, seyreltme numarası, zaman noktasında ve tarih ile plakaları etiketleyin. </li><li> Üçüncü sulandırma tüp vorteks sonra, agar ve tekrar f yüzeyine 10 ul örnek dağıtım5 damla toplam için kez. Beş 10 ul Petri plakalar 7 üzerine eşit düşer alana emin olun. </li><li> Damla sonra agar plakaları üzerinde emmek edecek ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübatör bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ihtiva eden 150 ul 1xPBS ile makrofaj sayımı için kayıtlı kuyu tedavi edin. </li><li> Tripsinizasyondan sonra, 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine yer makrofajlar ve tripsin / EDTA çözeltisi nötralize etmek için FBS 50 ul ile tedavi% 0.4 tripan mavisi ile hücrelerin leke ve hemasitometre aracılığıyla puan. </li><li> Bir saat inkübasyon geçtiğinde, CO 2 inkübatör &quot;işgali&quot; ve &quot;çoğaltma&quot; plakaları kaldırmak ve &quot;Adım 3.4&quot; de her yıkayın. </li><li> &quot;Adım 3,6-3,12&quot; gibi başka tedavi için &quot;işgal&quot; plakasını kaydedin. </li><li> 10 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM ortamı içinde 200 ul&quot;çoğaltma&quot; plaka ortamda dışı Salmonella boşluğu korumak için. Ilave 22.5 saat daha% 5 CO2 kuluçka 37 ° C, plaka dönün. </li><li> Ertesi gün, 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör &quot;çoğaltma&quot; plaka kaldırmak ve her yıkama sıra &quot;Adım 3.4&quot; ve &quot;Adım 3,6-3,12&quot; olarak davranın. </li><li> Son olarak, 37 ° C inkübatör içinde bir gece boyunca inkübasyondan sonra agar plakaları kaldırmak ve bakteri kolonilerinin sayısı tam. </li><li> İyi bir koloni dağıtım koloniler, 10 ile 100, her spot yaklaşık 2 koloni 20, belli bir yerde fazla 20 koloni olsaydı skor zor olurdu içerir olmalıdır. Gerektiğinde sayısı çok düşük veya çok yüksek ise, ile örnek Replate yüksek veya daha düşük seyreltileri 10 kat. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Kaplama dayalı her plakanın CFU (bir ml için koloni oluşturma birimleri) hesaplanırhacmi ve seyreltme faktörü. </li><li> Her cinsten gelen kaydedilmiş makrofaj hücre sayımı yoluyla, her makrofaga Salmonella sayısını teyit edin. </li><li> Sırasıyla hücre dernek, istila veya replikasyonu için, en az üç bağımsız deneyden makrofaj başına CFU, geometrik ortalamaları hesaplanır, ve göreli değer için WT daha normalleştirmek. </li><li> WT her zorlanma karşılaştırarak, sırasıyla Student t-testi ile dernek, işgali ve çoğaltma için verileri analiz ve p-değeri ile istatistiksel anlamlılık belirler. </li></ol>

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li><li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Gentamisin koruma deneyi yaygın konakçı hücre içinde hücre içi bakteriyel patojenler işgali ve çoğaltma incelemek için kullanılır ve özellikle kimin işgali enfeksiyonu 1 kurulması için önkoşul adımdır Salmonella gibi patojenlerin eğitim için önemli bir biyolojik aracıdır. Salmonella araştırma camiasında standart Gentamisin koruma deneyi 24-kuyu kültür çanak 5 uygulanmaktadır. 48 ya da 96 oyuklu plakaların kullanımı, yüksek verimlilik kapasitesi...

Tifoya yol açmayan Salmonella tüm omurgalıların enterik hastalıkların önemli nedenleri vardır. İnsanlarda Salmonella üst bakteriyel gıda kaynaklı hastalıklar 1 arasındadır. Onların hayvan ana Salmonella etkileşimleri destekleyen moleküler mekanizmaların Karakterizasyonu başta enfeksiyon, doku kültürü ve hayvan modellerinde Salmonella enterica serotip Typhimurium (STM) arasında çalışma ile elde edilir. STM-konak etkileşimleri anlayışlar kazanıyor bize Salmonella hayatta ve ev sahibi hücre içindeki büyümeye nasıl anlamanıza yardımcı olacaktır. Bu etkileşimlerin incelenmesinde ilk sorun host ve hem de patojen mümkün olduğunca çok sayıda katılımcı faktörleri belirlemek için, ama bu çabalar büyük ölçüde, aynı anda iki bağımsız karmaşık biyolojik sistemlerle, yani host ve Salmonella uğraşan önemli zorluklar tarafından engellenirse, fizyolojik koşullar altında. Buna ek olarak, büyük repertSalmonella oire ve potansiyel konak etkileşimleri rol faktörleri kodlayan genler konakçı bu meydan mücadele yüksek verim biyolojik platformu gerektirir. Modifiye, standardize edilmiş test olasılıkla Salmonella -host etkileşimleri çekici genlerin büyük bir set incelemek için geliştirilmiştir yüksek verimlilik kapasitesi ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Gentamisin koruma deneyi 1973 2 yılında geliştirilen, ama önce iyice 1994 yılında 3,4 Elsinghorst tarafından tarif edilmiştir. Şimdi Salmonella 5,6 olmak üzere, ex vivo birçok hücre içi bakteriyel patojenler, eğitim için standart bir araç haline gelmiştir. Içselleştirilmiş bakteriler ökaryot hücrelerin 3 nüfuz edemez Gentamisın gibi bazı antibiyotikler, tarafından öldürülüyor kaçınırım. Bu fenomenin avantajlarından yararlanarak, Gentamisin koruma deneyi hücre içi ba hayatta kalma ve büyüme ölçercterial bir patojen görülmüyordu. Enfeksiyon sırasında üç olay, yani ökaryotik hücreler, invazyon ve çoğaltma ile işbirliği içinde, enfeksiyon, Gentamisin tedavisi ve tekrar enkübe edildikten (Şekil 1) arasındaki zaman aralığına bağlı olarak hücre içi bakteriyel patojenler için değerlendirilebilir. Ökaryotik hücre hatları konak-patojen etkileşimi çalışmaları için ilgili hayvan modellerinde daha az karmaşık bir fizyolojik ortam sağlar. Gentamisin koruma deneyi STM konakçı etkileşimleri incelemek için uygun bir platform, ama 24-yuvalı kültür kaplarına bir şekilde standart analiz düşük verimlilik kapasitesine sahiptir. In vivo veri setleri Hesaplamalı analiz yaklaşık 300 konak gen ürünlerinin (yayınlanmamış veri) ile etkileşim tahmin edilmektedir 149 Salmonella gen ürünlerini belirledi. Standart Gentamisin koruma deneyi verimli mutantlar bu sayı fenotipik kapasiteye sahip değildir. Additiyon, Gentamisin koruma deneyi teorik hatta tek bir bakterinin işgali algılayabilir. Farklı zamanlarda tekrar geldiğinde çünkü bu doğal duyarlılık için ham veriler, teknik varyansları duyarlıdırlar. Iç kontrol ve normalleştirme sonrası göreli veri sunumu sonuçlarının anlamlı yorumlanması için gereklidir. Bu hususlar dikkate alındığında, modifiye, standardize Gentamisin koruma deneyi test kapasitesini geliştirmek ve hassasiyetini artırmak için geliştirilmiştir. Aşağıdaki protokol, detaylı ve 96 bölümlü kültür tabaklarına ve sıçangil makrofaj hücre çizgisi RAW264.7 kullanarak değiştirilmiş Gentamisin koruma deneyi gerçekleştirmek için resimli. 24-Kaynak kültür tabağı içindeki standart bir protokole göre, değiştirilmiş bir protokol, aşağıdaki avantajlara sahiptir: 1) 96-yuvalı kültür kaplarına kullanılması yeterli istatistiksel güç dahili pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere fenotiplenebilmektedir 10 farklı mutant suşları kadar izin verir;Mutant soylar olarak aynı kültür çanağı ve aynı zamanda test edilmiştir, çünkü 2) sonuç varyans önemli ölçüde azalır; Operatör yorgunluğunu azaltırken 3) çok kanallı pipetler kullanılması verimini arttırır. Son olarak, 24-çukurlu kültür tabaklarında karşılaştırarak, 96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına daha az konak hücre kabul protokol optimizasyonu ve standardizasyonu ile ele alınmıştır. Özetle, fagositik hücrelerde in vitro fenotip Salmonella ve diğer bakteriyel dernek, işgali ve çoğaltma değiştirilmiş, standardize edilmiş test hassasiyeti artar ve operatörün yorgunluğunu azaltırken yüksek verim kapasitesine ulaşır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Salmonella türleri zoonotik patojenler ve insanlarda ve hayvancılık 1 gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen nedenidir. Salmonella host etkileşimleri altında yatan mekanizmaların anlaşılması, Salmonella enfeksiyonunun moleküler patogenezi aydınlatmak için önemlidir. Gentamisin koruma deneyi yüksek verimli tarama RAW 264.7 kemirgen makrofajlar kullanılarak konak etkileşimleri Salmonella enterica serotip Typhimurium silinmesi mutantların rolleri tanımlamak için izin uyarlanan fagositik hücrelerde Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Bu protokol uyarınca, varyansı vahşi tip ve birden çok mutant suş hem aynı kültürü çanağı içinde ve aynı anda kontrol edilebilir, çünkü ölçümler önemli ölçüde, standart bir protokole göre azalır. Çok kanallı pipetler kullanılması verimi arttırır ve hassasiyet geliştirir. Ayrıca, endişeler daha az ho kullanılmasıyla ilgili96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına ST hücreleri, ele alınmıştır. Burada, fagositik hücreler kullanılarak in vitro olarak modifiye edilmiş Salmonella yayılması deneyinin protokol başarılı bir şekilde ilişkili, invazyon ve hücre içi çoğaltma için 38 birey, Salmonella silme mutantları fenotipik için kullanılmıştır. In vitro fenotipleri bazıları, daha sonra bir hayvan modelinde in vivo fenotiplerini sahip olduğu teyit edilmiştir sunulmuştur. Böylece, modifiye, standardize edilmiş test yüksek verimli kapasiteli bakteriyel-konak etkileşimleri çalışmak için daha geniş yararlanılabilir ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik.

Veriler, değiştirilmiş fagositik hücre yayılması deneyinin göre çizilir sonra temsili sonuçlar (Şekil 2) bakınız. Veri çoğaltma 8 kusurlu olduğu bilinen beş farklı suşları, WT ΔinvA, ΔphoP mutant A ve yayılma açısından kusurlu olduğu bilinen mutant B Δ INVA, ve ΔphoP arasında, deney geçerliliğini değerlendirmek için pozitif kontrol olarak kullanılır . Gerçekten de, değiştirilmiş istila deneyinde, bir mutan ΔinvA RAW26...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.6K Görüntüleme.  Texas A&M University.  In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır. 

Video: High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...