Doku fibrozisi, kronik inflamasyon veya yaşlanmaya yanıt olarak, organların zaman içinde başarısız birincil yoludur. Ve aslında, eğer bulaşıcı bir ajan dan ya da kanserden ölmezseniz, yaşlandıkça organ fibrozisinden öleceğinizi iddia ediyorum. Ne yazık ki, insan doku fibrozistaklit etmek için büyük fare modelleri çok fazla değil.
Geliştirdiğimiz şey Crohn hastalığının fare modeli. Aslında, bunu tedavi edebilirsiniz tek yolu fibrotik doku cerrahi kaldırılması ve bağırsak yeniden ligasyon yoluyla. Modelimizin avantajı, tüm fare suşlarında tamamen penetrant olması ve insan Crohn hastalığını çok yakından taklit ediyor olması ve fibrozisin bir aydan uzun bir süre devam ediyor olması, ki bu gerçekten sağlam bir model.
Bu prosedürün en zorlu kısmı farelerin kullanımı ve özellikle oral gavage bu uygulama özel sertifikasyon bir sürü gerektirir beri. Bu işlemi ilk kez gerçekleştirirken Salmonella ile çalışmanın uygun güvenlik önlemleri ve steril teknik gerektirdiğinin farkında olmak gerekir. Atık ve bakterilerin bertarafı deneyden önce planlanmalıdır.
Bu prosedürün görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü salmonella'nın özel güvenlik önlemlerinin yanı sıra uygun steril tekniği gerektiren bir şekilde işlenmesini içerir. Bu prosedürü başlatmak için, mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda Streptomisin içeren LB agar ile bir plaka yola. Steril bir aşılama döngü kullanarak, S typhimurium delta ok dondurulmuş gliserol stok ile plaka çizgi a.
Bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Çizgi plakalar bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Enfeksiyondan bir gün önce, antibiyotiği hazırlamak için 0,5 gram Streptomisini 2,5 mililitre suda çözün.
Filtre Streptomisin çözeltisi sterilize. Sonra, bir mililitre şırınga ile bir ampul uçlu 22 gauge gavage iğne kullanın sözlü streptomisin çözeltisi 100 mikrolitre ile fareler gavage. Sonra, bir kültür tüpü mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonda Streptomisin içeren LB suyu üç mililitre ekleyin.
Bir aşılama döngüsü kullanarak, LB et suyuna tek bir koloni ile aşıla. 200 rpm de sallayarak 37 santigrat derece aerobically gecede kültür kuluçka. Enfeksiyon gününde, son enfeksiyon dozu hazırlamak için steril PBS ile gecelik Salmonella kültürlerin iki ardışık bir ila 10 seyreltme gerçekleştirin.
Bu da yaklaşık üç milyon koloni oluşturan üniteiçeren 100 mikrolitrelik bir inokülle sonuçlanır. Bundan sonra, hazırlanan Salmonella 100 mikrolitre ile gavage her fare için bir mililitre şırınga ile bir ampul uçlu 22 gauge gavage iğne kullanın. İlk olarak, iki mililitre güvenli kilit yuvarlak alt mikrotüpler yola, steril PBS bir mililitre ve her tüp için bir otoklavpaslanmaz çelik boncuk ekleyin.
Doku toplamadan önce tüpleri önceden tartın. Fareler ötenazi sonra, ayrı tüpler halinde bireysel hayvanlardan doku toplamak için emin olun, onların cekal ve dalak dokuları rezeksiyon. Doku ağırlıklarını belirlemek için her tüpü tartın.
15 dakika boyunca 30 hertz dokuları homojenize etmek için bir karıştırıcı değirmen aparatı kullanın. Daha sonra, 96-iyi iki mililitrelik mega blok her kuyuiçine PBS 900 mikrolitre aktarın. Pipet 100 mikrolitre doku ilk kuyuya homojen olarak girer ve iyice karıştırılır.
Sonraki kuyulara 100 mikrolitre ekleyerek seri seyreltmeler yapın, negatif altıncı seyreltme elde edilene kadar 10. Plaka 10 streptomisin içeren LB agar üzerine triplicates her seyreltme mikrolitre. Daha sonra, ortalama koloni oluşturan birimleri sayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi doku gram başına koloni oluşturan birimleri belirlemek.
Açık Fiji, bir açık kaynaklı görüntüleme yazılımı ve sürükleyin ve araç çubuğuna tif görüntü dosyası bırakın. Menü çubuğunda, görüntüyü kırmızı, yeşil ve mavi kanallara bölmek için Resim, Tür, RGB yığınını seçin. Kanalı yeşile ayarlamak için panelin altındaki yatay çubuğu kaydırın.
Açık Görüntü, Ayarla, Eşik aracı. Arka plan sinyallerini ortadan kaldırmak için minimum ve maksimum sınırları ayarlayın. İstenilen eşik ayarlandıktan sonra, eşik aracını kapatın ve Analiz, Ölçümleri Ayarla, Alan, Alan fraksiyonu, eşiğe sınır ve görüntüleme etiketine gidin.
Serbest seçim veya çokgen seçimleri aracı ile doku seçimi alın ve Analiz, Ölçü'ye tıklayarak kollajen için pozitif yüzde alanını ölçün. Daha sonra doku bölgesine kollajen boyama için pozitif mutlak alanı normalleştirin. Streptomisin tedavisi S typhimurium delta ok ile oral enfeksiyon takip sağlam bağırsak iltihabı ve fibrozis yol açar, özellikle çekum.
100 milyon ila bir milyar koloni oluşturan birimlerin tipik patojen yükleri enfekte hayvanlardan çekum gram başına kurtarılabilir, 10 bin koloni oluşturan birimleri ise genellikle dalak gram başına kurtarılabilir. Pikrosirius kırmızı lekeli çekal kesitlerinde fibrozisin değerlendirilmesi enfeksiyondan 21 gün sonra pik fibrozisi gösterirken, patolojinin büyük bir kısmı 42 gün sonrası enfeksiyonla çözülür. Bu deneyin ayarlanması için birden fazla gün gerektirdiğinden, malzemelerin kapsamlı hazırlanması esastır.
LB plakaları ve Salmonella ve Streptomisin hazırlanması tüm aseptik yapılmalıdır. Deneyden önce, deneycinin hayvan protokolünün yanı sıra güvenlik tehlikelerine aşina olduğundan emin olun. Kollajen yükünü değerlendirdikten sonra, deneyci gen ekspresyonu profillerini değerlendirmek için RNA sıralaması veya bağışıklık hücresi alt kümelerini değerlendirmek için akış sitometrisi veya sitokin profillerini değerlendirmek için elisa doku gibi diğer biyolojik tahlilleri yapmayı seçebilir.
Yani modelimiz özellikle Crohn hastalığı denen bir insan hastalığını taklit etmede çok iyi. Modelimiz çok sağlam ve biz zaten doğuştan gelen lenfoid hücreleri hedefleyen tip üç, ham alfa denilen bir transkripsiyon faktörü, ya da interlökin 17 hastalığı iyileştirir ve fibrozis önler göstermiştir. Modelimiz özellikle Crohn hastalığı ve bağırsak fibrozisinin patogenezinde rol oynayan faktörleri belirlemede iyidir ve inflamatuar barsak hastalığını hafifletmek için terapötik olarak tedavi edilebilen bir dizi hedefi belirleme yolundayız.
Bizim model zaten aynı ILC3 veya alfa NIL17 erişim diğer fibrotik hastalık oyun olabilir girdi ve bu sedef hastalığı gibi şeyler dahil, multipl skleroz, idiyopatik pulmoner fibrozis. Yani bu aynı faktörleri hedeflemek bu hastalıklarda da fibrozisi hafifletebilir. Mutant Salmonella akımı öldürücü olmasa da, tesis tarafından verilen standart biyolojik tehlike güvenlik protokollerine uymak önemlidir.
Ayrıca, formaldehit buharları kanserojen olduğu bilinmektedir beri, fiksasyon adım sırasında bir duman başlık arkasında çalışmak önemlidir.
