We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen&#8217;s University.

1. Elektroporasyon Chambers Hücreleri Kaplama <ol><li> Laminer akış kaputu, her zamanki gibi steril tekniği kullanarak hücreleri trypsinize. Not: Bu, camın üzerine hücrelerin yayılmasını engelleyebilir, çünkü santrifüjle adherens ve boşluk bağlantıları bu nedenle oluşumunu tripsin tüm izlerini ortadan kaldırmak için çok önemlidir. </li><li> Pipet 1, 37 o C&#39;de in situ elektroporatörü içine (Şekil 1) ve yerine, CO2 inkübatör ile donatılmış steril elektroporasyon odalarında ml hücre süspansiyonu. Not: Hücre yapışması, fibronektin, kolajen, poli-lisin ya da hücre ve doku yapıştırıcı (Malzemeler Tabloya bakınız) üzerine kaplanarak artırılabilir. </li><li> Hücreler konfluent tabakası oluşturdular onlar GJIC inceleme için hazırdır. </li></ol> 2. Elektroporasyon Prosedürü GJIC muayene için elektroporasyon, bir laminer akış kaputu dışında yapılabiliralır bu yana sadece bir kaç dakika. Daha uzun inkubasyon süreleri belirli bir deney için gerekli olduğu durumda, o zaman bir laminer akış başlığı içinde tamamen yapılabilir. Tüm durumlarda, hücrelerin büyüdüğü odacıklar steril olması gerekmektedir. <ol><li> 5 mg / ml, Lucifer sarı bir çözelti hazırlayın: 2 mi Kalsiyum içermeyen büyüme ortamında (elektroporatörü ile birlikte verilme), 10 mg LY eritin. 4 o C&#39;deki solüsyonu ve mağaza filtre-sterilize, uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç duyar deneyler için </li><li> Büyüme ortamı aspire ve tek tabaka ya da sıfırdan hücreleri kurutmak için dikkatli olmak, kalsiyum-barındırmayan ortam maddesi ile hücreleri yıkayın. Hücreler kurutulur varsa genellikle koyu çekirdekleri ve elektroporasyon olmadan LY al. Etkisi daha hava akımı (Şekil 4F) maruz slayt ortasında daha belirgindir. </li><li> Bir Eppendorf pipet ile, bölme, B kenarında, hücreler (bütün odası için 400 ul), boya çözeltisinin pipetleDikkatli eing hücre tabakasını dokunmamaya. </li><li> Elektroporatörü ile birlikte tutucu odasına yerleştirin ve uygun kuvvette (Tartışma) bir darbe uygulamak. </li><li> Dikkatle LY çözümün bazı aspire. Bu deneyler için daha az önemli bir ikinci kez tekrar edilebilir. </li><li> ,% 10 serum ihtiva eden diyaliz kalsiyum içermeyen DMEM ekleyin. </li><li> Boşluk bağlantıları ile boya transferini sağlamak için inkübatör 3-5 dakika için kuluçkalayın. Not: Bu noktada, diyaliz serum dahil açıklıklarının kapanmasına yardımcı olur. </li><li> Canlı hücre gözlem için Kalsiyum içermeyen DMEM ile tüzel kişiliği olmayan boya yıkayın. Seçenek olarak ise, hücreler çukuruna% 4 formaldehit ilave edilmek suretiyle bu aşamada tespit edilebilir, daha sonra PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) ile yıkanmıştır. Tüm durumlarda yıkama tüm arka planı kaldırmak gerekir. NOT: Ön deneyler gerilimi çok düşükse, uygun koşulları belirlemek amacıyla, o hücrelerin incubato kurtarmak izin mümkündürBir kaç dakika boyunca r ve slaytlar maliyeti kurtarmak için, aynı Sürgü ikinci kez electroporate. </li></ol> 3. Mikroskobik İnceleme <ol><li> Kullanılan boya için uygun bir filtre ile donatılmış bir ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, floresan aydınlatma altında hücreleri dikkate alınmalıdır. Sarı Lucifer, uyarma 423nm, emisyon 555nm, Nikon IX70 mikroskop için WBV filtre. </li><li> Faz kontrast altında hücre morfolojisini incelemek için, sıvı ile üst doldurduktan sonra, iyi plastik üstüne bir cam kapak-slip koyarak menisküs etkilerini ortadan kaldırmak. Daha iyi fotoğraflar için, iyi slayt ayrılabilir, ve lamel çerçeveye yerleştirilir. Canlı hücreler için bu büyüme ortamı ile doldurulması gerekir ise sabit hücreler için de, mikroskopik gözlem için gliserol ile doldurulabilir. NOT: Hücreler bir boya (yukarıdaki aşama 2.7) transferi aşağıdaki formaldehitle sabitlendi, eğer yıkama ve görüntüleme daha kolaydır. Hücreler ise hiçbirT floresan sabit hücrelerin floresans birkaç saat boyunca muhafaza edilir getirirken LY hücre tipi, gerilim ve miktarına bağlı olarak, yaklaşık 60 dakika içinde hücrelerden elimine edilir, sabit. Bununla birlikte, floresan kaybolur ya da sabit hücrelerde, O / N inkübasyondan sonra dağılır. Bu nedenle, fotoğraf elektroporasyon (Şekil 2) kısa bir süre sonra alınmalıdır. </li></ol> Hücreler arası İletişimin 4. Kantifikasyonu <ol><li> Floresans ve faz kontrast (Şekil 3) altında, bir 20x objektif ile hücrelerin fotoğraf. </li><li> Olmayan elektroporasyona alanı (Şekil 2, ok, elektroporasyon kenar) ile sınırında elektropore hücreleri belirlemek ve bir yıldız ile işaretleyin. </li><li> Boya boşluk bağlantıları aracılığıyla transfer olan-olmayan elektroporasyona tarafında, floresanlama hücreleri belirlemek ve bir işaret ile (Şekil 3A ve 3B). </li><li> Toplam sayısına bölünkenar (Şekil 3A ve 3B) boyunca elektroporate edilmiş hücrelerde sayısına göre olmayan elektroporasyona alanda hücreleri fluoresan. NOT: en az 200 bitişik Elektroporasyona çevresindeki hücrelerden Transfer, her bir deney için hesaplanır. Elde edilen sayı GJIC değerdir. </li></ol>

<ol>
	<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Adherent+Cells+in+Situ+for+the+Study+of+Signal+Transduction+and+Gap+Junctional+Communication.">Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication.</a> Electroporation protocols. , 167-183 (2008).</li><li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking.">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li><li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway.">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li><li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth.">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li><li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ets+up-regulates+met+transcription.">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li><li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels.">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li><li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+human+T+cell+anergy:+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1.">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li><li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation;+electroporation+of+[alpha-32]GTP.">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li><li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells.">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li><li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides:+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins.">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li><li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis.">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li><li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+adherent+cells+in+situ.">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li><li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy.">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li><li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap;+regulation+of+gap+junctional,+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors.">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li><li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death.">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li><li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-loading+and+dye+transfer:+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication.">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li><li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular,+junctional+communication;+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide.">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA &amp; Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li><li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+gap+junctional,+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes.">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li><li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+assay+for+intercellular,+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells.">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li><li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells.">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li><li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li><li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured,+human+lung+carcinoma+cells.">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605 (2012).</li><li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes.">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA &amp; Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li><li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities.">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li><li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA.">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li><li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li><li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide.">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li><li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1/2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide.">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li><li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels.">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li><li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis.">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li><li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts.">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li><li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells.">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li><li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen.">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li></ol>

The corresponding author is the inventor in a patent held by Queen&#8217;s University, which has been licensed to Cell Projects Inc. The company or the University had no influence upon the contents of the paper.

Protokolünde kritik adımlar Elektroporasyona malzeme Elektropore edilecekse Malzemenin saflığı çok önemlidir. Hücreler, çok düz ise, izleme boyanın daha yüksek konsantrasyonlarda (20 mg LY / ml kadar) ve bu gibi durumlarda kullanılmalıdır, saflık: daha da önemlisi, daha küresel bir şekle sahip 1 hücrelerinde daha uzundur. LY Bunun yanı sıra, diğer boyalar ya da nonpermeant moleküllerin büyük bir çeşitlilik, örneğin başka bir con...

Bir hücre için elektrik akımının uygulanması işlemi olarak adlandırılan bir elektroporasyon ile, hücre zarı üzerindeki gözeneklerin oluşmasına neden olur. Gözenekler zardan nonpermeant çeşitli moleküllerin geçişine izin verir. Elektrik alanı meydana getirilen gözenekler, çok küçük ve hücre fizyolojisinin çok az rahatsızlık ile, hızlı bir şekilde yeniden kapatmak böylece, hassas bir şekilde kontrol edilebilir. İlginç bir şekilde, yapışkan hücreler, süspansiyon içinde elektropore edilecekse koparılmadan, büyümek yüzeyi üzerinde iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit (İTO) ile kaplanmış ve in situ elektroporasyona bir cam slayt üzerinde büyütülebilir. Hücreler, bu yüzeyde çok iyi büyüyebilir, ve bağlı ve uzatıldıkça detaylı mikroskobik gözlem mümkündür. Bu tekniği kullanarak, küçük moleküller nonpermeant anında sunulan ve comp aktivasyonu üzerinde çalışmalar için özellikle uygun hale getirir, bu teknik, hücrelerin esas olarak% 100, içine edilebilir(1 gözden) bir reseptörünün ligand stimülasyon sonra yolun onents. Elektroporasyon DNA&#39;nın katılımı (buna electrotransfection) çoğunlukla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, in situ elektroporasyon transkripsiyon faktörü bağlanma, veya siRNA 3,5 inhibe etmek için örneğin antisens RNA gibi çift iplikli DNA Decoy-Oligonükleotidleri gibi peptidler 2-4, oligonükleotidler gibi moleküller, büyük bir çeşitlilik sokulması için değerli olabilir, 6, radyoaktif nükleotidleri, 7-10, proteinler 11 12 ya da ön-ilaçları 13. Elektroporasyondan sonra hücreler, biyokimyasal analizler için lize veya sabit ve antikorlar ile boyanmış olabilir. Hücreler, iletken kaplamanın kenarı boyunca büyüdükçe hücre büyümesi, iki yüzeyin yükseklik farkından rahatsız etmeyecek şekilde iletken İTO kaplama, 800-1,000Å çok incedir. Bu durum şu avantaja sahiptir olmayan electropbu metne dahil edilmiştir hücreler kontrol olarak hizmet etmek üzere, elektroporasyona olanlar ile yan yana yetiştirilebilir. Video tarif edildiği gibi aynı yaklaşım, boşluk junctional, hücreler arası iletişim (GJIC) &#39;nin incelenmesi için de kullanılabilir. Gap kavşaklar komşu hücrelerin 14 iç bağlayan kanallardır. Src gibi onkogenler GJIC 15,16 bastırırken boşluk birleşim, hücreler arası iletişim, tümör oluşumu ve metastaz bakımından önemli bir rol oynar. Lucifer sarının (LY) çoğu zaman mikro-enjeksiyon ile kültürlenmiş hücreler içine dahil edilebilmekte ya da kazıma-yükleme 17 ve komşu hücrelere boyanın difüzyonu mikroskopik floresan aydınlatma altında görülmektedir olduğu gibi GJIC bir floresan boya incelemek. Bu teknikler ancak kaçınılmaz hücre hasarına neden olur. Şimdi hücreleri kısmen İTO 18 ile kaplanmış bir cam slayt üzerinde yetiştirilen bir tekniği açıklar. Bir elektrik atma LY (ya da diğer boyalar) varlığında ca uygulanmıştırbitişik olmayan elektroporate edilmiş hücrelerde, boyanın göçü, mikroskopik floresan aydınlatma ile gözlenirken, sürgünün iletken kısmına üzerinde büyüyen hücrelerin içine nüfuziyetini kullanılmıştır. Tek tabaka ayırmak için temayül rahatsız duyarlı hücreler önlemek için, bir elektrot gerektirmeyen tasarlanmış bir montaj elektrik akımı 19 uygulamak için hücrelerin üzerine yerleştirilmesini mümkün kılar. Serum uygulandıktan 12 uygulanarak G1 fazında uzunluğuna bir etkisinin olmaması ile gösterildiği gibi bu yaklaşım fos düzeylerindeki artış, hücre metabolizması için, belirgin bir bozulma olmadan hücrelerin çok sayıda GJIC ölçmek için olanağı sunar protoonkojenden protein (Raptis, yayınlanmamış) veya hücresel stres, p38 domuz veya JNK / SAPK&#39;ın kinaz 1 ile ilişkili iki kinazlardır. Onkojen ifadesi, transformasyon ve GJ düzeyleri arasındaki bağlantının incelenmesi mümkün hale Bu yaklaşımIC 18, hem de akciğer tümör örneklerinde 20-23 taze kültürlenmiş hücreler de dahil olmak üzere hücre tiplerinin, çeşitli içinde GJIC üzerine Src ve STAT3 etkisi. Buna ek olarak, alt-tabakaya bağlanma hücresel bu aşamada 19,24 azaltılır, ancak başarılı adipositik farklılaşması üzerine boşluk bağlantı kapağın gösterilmesi için kullanılan edilmiş bir üst elektrot yoksun tarif etmiş olup in situ elektroporasyon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:428px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">DMEM</td>
			<td style="width:428px;">Cellgro http://www.cellgro.com/</td>
			<td style="width:119px;">50-013-PB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">DMEM without Calcium</td>
			<td style="width:428px;">Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td>
			<td style="width:119px;">SH30319-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Donor Calf Serum&#160;</td>
			<td style="width:428px;">PAA: http://www.paa.com/</td>
			<td style="width:119px;">Cat.# B15-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:428px;">PAA: http://www.paa.com/</td>
			<td style="width:119px;">Cat.# A15-751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Electroporation apparatus</td>
			<td style="width:428px;">Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/</td>
			<td style="width:119px;">ACE-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Chambers</td>
			<td style="width:428px;">Cell Projects Ltd UK</td>
			<td style="width:119px;">ACE-04-CC</td>
			<td>4-wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Chambers</td>
			<td style="width:428px;">Cell Projects Ltd UK</td>
			<td style="width:119px;">ACE-08-CC</td>
			<td>8-wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Lucifer Yellow</td>
			<td style="width:428px;">Cell Projects Ltd UK</td>
			<td style="width:119px;">ACE-25-LY</td>
			<td>High purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">CelTak</td>
			<td style="width:428px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354240</td>
			<td>Cell and tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:428px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Collagen</td>
			<td style="width:428px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Poly-Lysine</td>
			<td style="width:428px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a functional assay for gap junctional examination; electroporation of adherent cells on indium-tin oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

Şekil 2, tespit ve yıkama sonrası floresan (Panel A ve B) kapsamında LY ile elektropore edildi ve fotoğraflandı sıçan karaciğer epitel hücreleri T51B 22, ya da faz-kontrast (C) aydınlatma göstermektedir. Panel A, electroporated alanın kenar kırmızı olarak işaretlenmiştir. Kırmızı çizginin sağında flüoresans gradyanı boşluk bağlantıları yoluyla transferini ifade eder. Boya transfer olan hücreler, bir nokta ile işaretlenmiş ise, elektroporasyona alanının kenar...

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide at JoVE.com

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

a-functional-assay-for-gap-junctional-examination-electroporation

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Görüntüleme.  Queen's University. This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.