The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerilerine sıkı göre gerçekleştirilmiştir. Bütün hayvanlar onaylanmış kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi Johns Hopkins Tıp Kurumları (IACUC) protokolü MO11M29 göre ele alınmıştır. Ötenazi onaylı yöntemleri için yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına danışın. Aldehit fiksatif veya organik çözücüler tutarken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın. Malzemeler 1. Hazırlanması <ol><li> Sylgard Plates Dökme <ol><li> , Üreticinin talimatlarına uyun tabanı ile sertleştirme ajanı karıştırın ve bir plastik çubuk ile karıştırın. </li><li> Pipet ~ 35 ml sıvı Slygard 10 cm çaplı doku kültürü çanak başına. Doku kültürü yemekleri standart bakteriyel yemekleri daha derin; Bu böcek iğneleri için dikey açıklık sağlar. </li><li> Di yerleştiringece boyunca oda sıcaklığında yatay bir yüzey üzerine o kız. Karıştırma sırasında oluşan kabarcıklar kaybolacaktır. </li><li> Polimerizasyon sonra, oda sıcaklığında Sylgard plakaları saklayın. Not: Sylgard plakadan ayrılana kadar Sylgard plakalar çok kez yıl boyunca oda sıcaklığında depolanır ve yeniden kullanılabilir. </li></ol></li><li> Çözümler <ol><li> Benzil benzoat ve benzil alkol (BBBA). 2 hacim benzil benzoat ve 1 hacim benzil alkol karıştırın. , Bir cam stoper veya Teflon üst bir cam şişe karanlıkta saklayın. DİKKAT: BBBA Kullanılmış uygun organik çözücü atık olarak ele alınmalıdır. BBBA plastik temas etmesine izin vermeyin. </li><li> Fosfat tuzlu su (PBS). 80 ml su ile 4 g PFA ekleyin, 70 ° C ~ 5 dakika boyunca PFA tamamen eriyene kadar ~ sıcak bir plaka üzerinde karıştırılmıştır, 0.1 ml 1 N NaOH ekleyin ve daha sonra 10 ml 10x PBS ekleyin ve 100 için ses getirmek ml su ile. DİKKAT: formaldehit / PFA ve BBBA buharlarının solunması olmalıdırkapalı kaplarda bu çözümleri tutarak minimize. Formaldehit / PFA bir kanserojendir. </li><li> Oil Red O. izopropanol içinde% 0.5 &#39;lik stok hazırlayın. Kullanımdan hemen önce% 0.3, Yağlı Kırmızı O nihai bir konsantrasyona kadar su ile seyreltilir, ve daha sonra bir 0.2 mikron filtre içinden geçirilerek filtre edilmektedir. </li></ol></li></ol> 2.. Cilt Diseksiyon, Fiksasyon ve Takas <ol><li> Immünolekeleme Melanin Görüntüleme için Cilt Dorsal <ol><li> Çok genç farelerde (örn., fetus ve doğum günü (P) 0-P3 yavrular) için, izofluran inhalasyon yoluyla fareler euthanize. Izofluran inhalasyonu veya servikal dislokasyon ketamin / ksilizin enjeksiyonu ile yaşlı fareler Euthanize. </li><li> Elektrikli tıraş ve epilasyon jel ile saç kaldırmak. P8 daha genç fareler için, bu adım atlanabilir. </li><li> Kulak ve sonuna kadar yanal olarak devam edilmesi, her bir kol tabanının geçen sırt tarafında, her bir kanat boyunca kuyruk tabanından yatay kesim yapmak için bir tıraş bıçağı kullanmaburunda ing. </li><li> Hafifçe forseps takılmamasına böylece eldivenli parmakları arasındaki deri tutarak anterior posterior altta yatan doku ilerlemesini cilt soyma. Kulak seviyesinde cilt soyulması, önce bir makas ile kulakları kesilir ve deri bu konumda yırtılabilir özellikle yavaş yavaş devam edin. </li><li> Bu noktadan itibaren, yukarı bakacak içiyle cildi yönlendirin. ~ 20 böcek pimleri eşit çevresi etrafında çevresel olarak aralıklı olan Sylgard için cildi Pin; cilt (Şekil 2B) üzerinden streç yoktur. PBS 10-20 ml ile cildinizi örtün. </li><li> Forseps cilde nüfuz edecek riskini en aza indirmek için yatay şekilde forseps sivri ucu açılı veya kavisli bir forseps kullanarak cilt ilişkili yağ ve bağ dokusu uzak teşrih. Nazikçe cilt yüzey üzerinde bir pamuk uçlu bir aplikatör haddeleme ile cilt altında sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıklarını a&#39;ya. NOT: Cilt gidiyorsaDüz montaj Immün veya histokimyası için kullanılmak üzere, mümkün olduğunca bağ dokusu kadar kaldırın; ciltteki melanin pigmentasyonu göre saç folikülleri görselleştirmek için kullanılan olacak eğer, bağ dokusu daha az tam olarak çıkarılması tatmin edicidir. Prenatal cilt yapışık bağ dokusu minimal &quot;temizlik&quot; gerektirir. </li><li> Sylgard 10 cm plaka başına 20 taze hazırlanmış% 4 PFA / PBS ml veya% 10 tamponlu formalin ekleyerek tutturulmuş deri saptamak veya taze hazırlanmış 20 ml (deri melanin görüntüleme veya alkalin fosfataz (AP) histokimya için kullanılacak ise) % 2 PFA / PBS (cilt immünoboyamayla veya görselleştirme transgenik Keratin (Krt) 17-GFP 11 için kullanılacak ise), ve yavaşça bir gece soğuk bir odada döndürmek. Ertesi gün,&gt; 10 dakika boyunca PBS içinde yıkayın. NOT: Standart formalin% 37 formaldehit olup; bu nedenle, &quot;% 10 formalin&quot;% 3.7 formaldehit olduğu. </li><li> AP boyama ve immün için, Bölüm 3&#39;te devam ediyor. Melanin imag içining, oda sıcaklığında nazik bir yatay rotasyon ile sınıflandırılmış etanol serileri ile cilt (% 70,% 95,% 100), her bir aşama için bir gün, kurutmak. Kalan bağ dokuları çıkarın. </li><li> % 100 etanol içinde deri ile, böcek iğneleri kaldırmak ve, arzu edildiği takdirde, pim delikli cildin en çevresel 1-2 mm kaldırmak için bir makas ile cilt kesin. </li><li> , 10 cm çapında bir cam tabak içine deri transfer kıvrılmasını engellemek için cilt üzerinde iki cam mikroskop slayt yerleştirin ve BBBA 20 ml ekleyin. Cilt BBBA eklemeden önce cam slaytların ağırlığı altında basık olması için önemlidir bu yüzden BBBA hızla doku sertleşir. </li><li> Bir sonraki birkaç saat içinde, BBBA cilt üzerinde yıkama sağlamak için bir kaç saniye için kaplama kapalı slaytlar kaldırın. NOT: BBBA ile çalışırken eldiven giyin. Cilt yaşı ve bulunduğu yere bağlı olarak BBBA olarak yaklaşık 30% büzülme olabilir. </li></ol></li><li> Saç Folikül Patte ve Analiz için ayak Ciltrning NOT: Genellikle incelenen yaş aralığı P1-P8. <ol><li> Ötenazi sonra, ayak bileği eklemi üzerinde kesti ve ayak tabanları ile ventral yüzeyi boyunca bir tek düz kesim yapmak. </li><li> Yavaşça distal yöne bir proksimal işlem, temel dokudan deri soyma. </li><li> Cildi serbest ve iç yüzey (Şekil 2C) yukarı bakacak şekilde sylgard iğnelemekle basamak kesin. Ayak deride minimal bağ dokusu vardır. </li><li> Transgenik Krt17-GFP cilt şimdi görüntüleme için hazırdır. Bölüm 2.1 &#39;de açıklandığı gibi melanin görüntüleme için fiksasyon, dehidratasyon ve BBBA temizleme ile devam edin. </li></ol></li><li> Görselleştirme Yağ bezleri için ayak Cilt <ol><li> Ötenazi sonra, eldivenli parmak ve başparmak ile cilt yüzeyi üzerinde saç çıkarıcı jel sürtünme tarafından saç kaldırmak; 10 dakika boyunca bekleyin. NOT: narin ayak cilde zarar edecek, bir elektrikli tıraş makinesi kullanmayın. </li><li> W, musluk suyu ile cilt yüzeyini kül incelemek ve bölüm 2.2 &#39;de açıklandığı gibi Sylgard cildi pin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca,% 1 PFA / PBS ile düzeltmek ve daha sonra PBS içinde yıkayın. NOT: Bu ilk saç döngüsü 12 sırasında saç pigmentasyon dip noktası ve bu nedenle yağ bezleri, çünkü doğum sonrası ilk hafta sonra gelişir ayakları üzerinde yağ bezleri görüntülenmesi için, Oil Red O ile analiz için uygun yaş, P21 olduğunu daha kolay görülebilir. Albino fareler ile bu analiz her yaşta yapılabilir. Bu tür c-2J C57BL/6J-Tyr olarak tirozinaz mutant hattına albino döl çapraz pigmentli mutant fareler elde etmek. </li></ol></li><li> Melanin Dağıtım Analizi, Saç Folikül Oryantasyon ve Yağ Bezi Görselleştirme için kuyruk Cilt Hazırlığı <ol><li> Ötenaziden sonra, kuyruk tabanından etrafında dairesel bir kesme ve sonra da ventral yüzü boyunca kuyruk uzunluğu boyunca uzanan, uzunlamasına bir yarık olun. </li> &lt;li&gt; sıkıca kuyruk-, kemik ve / veya bir forseps çift ve forseps bir ikinci çift ile deri ile bağ dokusu ucu kavrayarak ucundaki başlayarak kuyruk deri soyun. Sylgard kuyruk cildi pin. </li><li> Melanin dağılımı ve saç folikülü yönelim analizi için, düzeltmek ve bölüm 2.1 &#39;de açıklandığı gibi cildi işlemek. Yağ bezlerinin analizi için, segment bir dizi içine kuyruk deri kesme ~ 0,5-1 önce tespit için cm uzunluğunda ve dermis-epidermis yapışma 13 zayıflatma 37 ° C&#39;de gece boyunca PBS / 5 mM EDTA içinde deri parçaları inkübe edin. </li><li> Yavaşça, dermis epidermis soyma Sylgard (iç yüzü yukarı) epidermis pin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 4 PFA / PBS bunu düzeltmek. PBS ile yıkayın ve aşağıda tarif edildiği gibi, Oil Red O ile leke. NOT: Bir elektrikli tıraş makinesi ve / veya saç temizleme jel önce büyük kuyruk deri (örn., P21) kesme için kullanılabilir, ancak kuyruk saç olmadığı için bu işlem isteğe bağlıdırvücudun başka bir yerde gibi yoğun. </li></ol></li></ol> 3.. Boyama Tepkiler <ol><li> İnsan Plasental Alkalen Fosfataz (AP) Histokimyas Visualize&#39;a Akson milleri 10,14,15 Genetiği-etiketli (Şekil 3A, B) <ol><li> Sylgard üzerinde PFA tespit sonra, 10 cm cam tabak içinde sabit derileri koyun ve PBS / 1 mM MgCl2 altında daldırın. Yavaşça endojen fosfataz etkinliğini yok etmek için 90 dakika boyunca 70 ° C &#39;de bir su banyosunda çanağı. </li><li> Tipik olarak 10-15 kullanılarak 0.1 M Tris, pH 9.5, 0.1 M NaCI, 50 mM MgCI2, 0.34 ug / ml NBT ve 0.175 ug / ml BCIP içinde oda sıcaklığında 4-48 saat bir kuluçkalama ile histokimyasal AP raportör etkinliği görselleştirme P21 dorsal deri başına boyama çözeltisi ilave edildi. Nonspesifik NBT birikimi akson boyama bağıl yoğunluk görsel inceleme ile karar gibi, en uygun zamanın ötesine devam bırakmamaya özen, mikroskop altında reaksiyonu izleyin. </li&gt; <li> Üç 1 saat boyunca PBS/0.1% Tween-20 arasında değişiklik, Sylgard yeniden pin derileri, bir etanol dizi derileri kurutmak ve daha sonra bir 10 cm tabak için derileri transferi ile yıkanarak reaksiyonu durdurun BBBA. Not: BBBA yavaşça NBT çökelti çözülür. BBBA yılında ilk birkaç saat boyunca, çöktürülmüş nbt ince bir arka plan eriyecektir; Sonuç olarak, BBBA çözüm karartmak ve cilt hafifletmek olacaktır. Bir kaç saat sonra taze BBBA değiştirin. </li><li> AP-lekeli cilt görüntüleme sonra, oda sıcaklığında&gt; 1 saat boyunca etanol transfer etme ve daha sonra -20 ° C de taze etanol saklayın AP-lekeli derileri sinyal kaybı ile aylarca bu şekilde saklanabilir. </li></ol></li><li> Oil Red O boyama Sebasöz Bezler 4 (Şekil 3C-F) Visualize&#39;a <ol><li> Böcek pimlerini ile, bir 6-yuvalı doku kültürü plakasının oyuklarına Sylgard plakadan hafifçe sabit ayak ya da kuyruk derileri aktarmakKuyunun başına iki cilt örneklerinde kadar. 60:40, izopropanol ile yıkanır: su içinde, oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı. </li><li> Su (bkz. Bölüm 1.2) 2 saat boyunca oda sıcaklığında: 60:40 izopropanol içinde 2 ml% 0.3, Yağlı Kırmızı O Leke. </li><li> 60:40, izopropanol ile yıkanır: su bir su yıkaması ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca. Cilt yüzeyi mümkün olduğu kadar düz yapılabilir, böylece dikkatle ince makas ile iğne delikleri gibi cilt kenarları, kırpılmış. </li><li> , Bir su birkaç damla veya sulu montaj orta eklediğiniz bir lamel ile cilt kapağı, ve sonra yavaşça ileri cildi düzleştirmek için slayt lamel bant, dış yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir slayt üzerinde cilt yerleştirin. </li></ol></li><li> Düz Dağı İmmünoboyama 4,16,17 (Şekil 3G, H) <ol><li> Asimetrik bir kesim (örneğin, ön sağ köşesine klip) ile yönlendirme işareti, PFA sabit deri (ör. 1 cm x 0.5 cm) boyutlarında bir dikdörtgen kesin. Inkübasyon ve gerçekleştirBir dönen yatay bir platform üzerine nazik rotasyonlu adımları yıkayın. Bir 6 kuyu olarak - ya da 12 oyuklu doku kültürü plakası, kalıntı PFA çıkarmak için PBS ile birkaç kez yıkayın, önceki 5-8 saat boyunca% 0.3 Triton X-100 (% 0.3 PBST) ile PBS ~ 10 değişiklik ile yıkayın cilt permeabilize oda sıcaklığı. </li><li> Oda sıcaklığında beş gün süre ile% 5 keçi serumu ve% 20 DMSO ile% 0.3 PBST içinde primer antikor ile inkübe edin. Açık bir bant ya da buharlaşma yoluyla kaybını ortadan kaldırmak için yapışkan plastik plakanın kuyularının örtün. </li><li> 5-8 saat boyunca% 0.3 PBST 10-15 değişiklikler ile yıkanır ve oda sıcaklığında 3 gün boyunca% 5 keçi serumu ve% 20 DMSO ile% 0.3 PBST içinde sekonder antikor ile inkübe edin. </li><li> 5-8 saat boyunca% 0.3 PBST 10-15 değişiklikler ile yıkayın. </li><li> 5 dakika, 20 dakika her biri için her bir ve daha sonra 3x 100% metanol% 25,% 50 ve% 75 metanol içinde kurutmak. </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında BBBA Temizle. NOT: Düz daha genç bir cilt bağışıklık boyamasım montaj~ P1 yukarıda tarif edildiği gibi, ancak daha kısa bir inkübasyon ile gerçekleştirildi ve kez yıkayın edilebilir. Örneğin, P1 deri birincil antikor olarak bir gece boyunca inkübasyon ve ikincil antikor olarak bir kaç saatlik bir kuluçka ile boyanmış ve% 0.3 PBST içinde sadece 2-3 saat arasında ara yıkamalar ile yapılan edilebilir. Yukarıda da belirtildiği gibi, küçük deri aynı zamanda BBBA temizleme olmadan görüntülenebilir yeterince incedir. </li></ol></li><li> Floresan Sinir Terminal Boya Alımı ile Merkel Hücresi Kümeleri görselleştirme (3H-L Rakamlar) AMI-43 (yeşil) ve AM4-65 (kırmızı), seçici olmayan bir katyon kanalı 18 üzerinden hücrelere girmek tamir edilebilir floresan boyalardır. Canlı deride bu boyalar, seçici bir şekilde alınır ve Merkel hücreleri içinde konsantre edildi. <ol><li> -80 ° C &#39;de parçalar halinde 1 mg AM1-43 ya da AM4-65 2 ml PBS içinde çözülür ve mağaza </li><li> Bir 29 G iğne kullanılarak gram vücut ağırlığı için 2-10 ug boya ile deri altından doğan yavrular enjekte edilir. </li><li> Bir gün sonra, fareler ve Disse euthanizedorsal derileri ct. </li><li> , Bir gece boyunca 4 ° C &#39;de% 4 PFA / PBS içinde derileri saptamak PBS ile yıkayın ve Bölüm 3.2&#39; de tarif edildiği gibi deri monte edin. </li></ol></li></ol> 4.. Görüntüleme ve Görüntü Analizi <ol><li> Görüntüleme Saç Folikül Oryantasyon (Şekil 4) <ol><li> , BBBA batık bir cam slayt altında basık, ve hala cam tabak içinde olan resim sırt, ayak, kuyruk veya derileri için bir diseksiyon mikroskobu kullanın - bu yaklaşım mikroskop BBBA kirlenmesini en aza indirir. </li><li> Aşağıdan çanak aydınlatın. , Görüş alanında genelinde ışık yoğunluğunun uzaysal değişimini en aza indirmek 10 cm mikroskobun standart çalışma yüzeyinin üzerinde ~ yüksekliğe cam tabak yükseltmek ve ışık kaynağı üzerinde bir difüzyon plastik veya cam plaka yerleştirin. </li><li> -20 ° C&#39;de uzun süreli depolama için% 100 etanol cildi dön NOT: daha bir gün için BBBA de cildi bırakmak melanin granülleri kırmak için neden birbölüm. Cilt BBBA tedavi edildikten sonra sertleşmesine ve ileriye o noktadan itibaren düz kalacak. Onlar dondurucu yer kazanmak için, birlikte saklayabilirsiniz böylece farklı derileri, onların ön ve / veya arka ucunda çentikler bir dizi ile kodlanmış olabilir. </li></ol></li><li> Görüntüleme ve Takip Akson milleri (Şekil 3A, B) <ol><li> Küçük protein jeller için kullanılan tipte iki cam levha arasında AP boyanmış deri (bölüm 3.1.3) yerleştirin. Plakalar ve deri arasındaki hava baloncuklarının oluşumunu önlemek ve daha sonra dikkatli bir şekilde bir kağıt havlu ile herhangi bir aşırı BBBA fitil. Bir mikroskop aşamasında (Şekil 2B) üzerindeki plaka cilt plakanın sandviç yerleştirin. </li><li> 10X objektif ve 2 mikron veya 5 mikron Z-adımlarla aydınlık-alan ya da DIC aydınlatma kullanın. Tek bir üç boyutlu gri ölçekli veri kümesi oluşturmak için birleştirilir XY görüntüleri montaj yakalamak için bir mekanize XY sahne kullanın. NOT: Tek bir büyük akson çardak için, bu veri seti olabilir5 Gb gibi büyük s. </li><li> Manuel, otomatik, veya Yazılım paket çeşitli herhangi biri ile akson milleri yarı otomatik izleme yapın. NOT: Bu tür Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) olarak Yazılım PC ortamında çalışan ve 10 ana nispeten kolay ücretsiz bir nöronal yeniden bir araçtır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).</li><li>Lee, J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+tale+of+signaling+in+hair+follicle+development+and+cycling.">Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+organization+of+the+retina.">The neuronal organization of the retina.</a> Neuron. 76, 266-280 (2012).</li><li>Chang, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+hair+follicle-associated+structures+to+loss+of+planar+cell+polarity+signaling.">Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+and+the+developmental+control+of+cell+behavior+in+vertebrate+embryos.">Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).</li><li>Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled6+controls+hair+patterning+in+mice.">Frizzled6 controls hair patterning in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).</li><li>Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+from+disorder:+Self-organization+in+mammalian+hair+patterning.">Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).</li><li>Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+whorls+collide:+the+development+of+hair+patterns+in+frizzled+6+mutant+mice.">When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice.</a> Development. 137, 4091-4099 (2010).</li><li>Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sensory+transduction+in+the+skin.">Mechanisms of sensory transduction in the skin.</a> Nature. 445, 858-865 (2007).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, (2012).</li><li>Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+keratin+17+gene+promoter+to+visualize+live+cells+in+epithelial+appendages+of+mice.">Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice.</a> Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hair+cycle.">The hair cycle.</a> J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 30, 5241-5255 (2003).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed,+cell+type-specific+sparse+labeling+for+the+analysis+of+neuronal+morphology.">Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Devenport, D., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarization+in+embryonic+epidermis+orchestrates+global+asymmetric+morphogenesis+of+hair+follicles.">Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147, 1615-1627 (2011).</li><li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+senses:+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels.">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144, 577-589 (2011).</li><li>Orsini, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+preparation,+study+and+photography+of+benzyl-benzoate+cleared+material+for+embryological+studies.">Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies.</a> J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yukarıda açıklanan diseksiyon yöntemlerinin ustalık sadece sabır, sürekli bir el, ve birkaç iyi diseksiyon araçlar gerektirir. Sırt derisi diseksiyon nispeten kolaydır, ama kuyruk ve ayak cilt diseksiyonlar - Özellikle doğum sonrası erken yaşta - daha zor. (E15 önce örneğin) erken prenatal yaşlarda, cilt yırtmadan kaldırmak zordur. Uygun bir şekilde, büyüme ve farelerde deri yapıları modelleme birçok çalışmalar için, ilgi konusu olaylar arrector pili kas 19 büyümesini...

Cilt somato-duyu, izolasyon / termoregülasyonu ve bağışıklık savunma 1. önemli fonksiyonları ile vücudun en büyük organ biridir. Cilt gelişimi ve işlevi moleküler ve hücresel temelini anlama nedeniyle biyolojik sistem ve dermatoloji alaka olarak derinin temel öneme uzun süredir devam eden bir ilgi olmuştur. Memeli Cilt keratinositleri tabakalı katmanları, deri, bağ dokusu, saç köklerinin çeşitli, yağ bezleri, arrector pili kaslar, kan damarları ve afferent en azından bir düzine farklı sınıflarına (duyusal) sinir ve efferent de dahil olmak üzere çok-yapılar, çeşitli içerir elyaf (Şekil 1). Vücudun farklı bölgelerinde cilt karakteristik farklı tipleri ile ilişkilidir. En Memelilerde, neredeyse tüm vücut yüzeyi yoğun saç köklerinin ile doludur deri ile kaplıdır. [İnsanlar ve çıplak körfareler inci istisnalarıkalıptır.] Saç da özel epidermal desenleri (dermatoglyphs), ekzokrin bezleri ve duyu sinir uçları ile ilişkili ellerde ve ayaklarda, palmar yüzeylerinin eksik. Büyümesi, farklılaşması ve saç folikülü içindeki hücrelerin uzaysal düzenleme kontrolü hücresel ve moleküler olaylar organogenez 2&#39;nin merkezi özelliklerinin çoğu, minyatür, her bir folikül sergiler gibi özel ilgi çekmektedir. Bu özellikler, kök hücrelerin varlığını ve bir kök hücre niş, tam hücre koreografisini geçişler ve embriyolojik ayrı bileşenlerden çok hücreli yapıların montaj dahil. Bu makalede, kesme için yöntemleri açıklar, sabitleme, etiketleme, ve sağlam bir iki boyutlu levha gibi görüntüleme fare deri, bir &quot;bütün montaj&quot; ya da &quot;düzlem monte&quot; hazırlık olarak anılacaktır. Fare derisi nispeten ince olduğu için, düzleştirilmiş kayak tam kalınlığı boyunca görüntü mümkündürn geleneksel konfokal mikroskopi kullanılarak. Bu yapılar bu şekilde optik olarak kısımlara ayırma suretiyle tamamen yeniden inşa edilmesi için izin fiziksel kesit için ihtiyaç atlar için, memeli bir cilt görüntüleme için düz montaj yaklaşım teknik avantajlıdır. Neredeyse tüm cilt tek bir nesne olarak işlendiği için, yassı gövde eksene konumu ve oryantasyonu ile ilgili bilgileri korurken yaklaşım aynı zamanda vücut yüzeyinin birden çok bölgelerin görüntüleme kolaylaştırır monte edin. Son olarak, deri içinde yapılar tipik haliyle, böylece, belirli bir yapıda birden fazla temsilcileri görüntülerin toplanmasını kolaylaştıran, düzenli aralıklarla tekrar edilir desen bulunmaktadır. Bu özellikler, retina, nöronal morfoloji 3 çalışmaları için benzer avantajlara sahiptir, merkezi sinir sistemi, iki boyutlu bir parçası üzerinde çalışmak neurobiologists aşinadır. Burada anlatılan düz monte yaklaşım özel utilit olduğunucilt iki boyutlu bir düzlem içinde nispeten büyük ölçekli mekansal organizasyon sergileyen yapıları incelemek için y. Merkel hücresi kümeleri, arrector pili kaslarının, yağ bezleri ve sinir uçları 4 - Büyük ölçekli mekansal organizasyon bir örnek saç köklerinin ve saç folikülü ilişkili yapıların koordineli kutupluluktur. Saç foliküllerinin cilt düzlemi ile ilgili olarak, ve cilt 2 boyutlu bir düzlem içinde yer folikül vektörünün bileşeni ile bir açı ile yönlendirilir, genel olarak her biri için tam olarak belirlenmiş olan vücut eksene göre bir oryantasyon sergilemektedir vücut üzerindeki konumu. Örneğin, rostral gelen geri noktasında saç folikülleri kaudal ve ayak dorsal yüzeyi saç distal proksimal gelen işaret. Saç folikülü yönlendirme düzlemsel hücre kutup sinyallemesi tarafından kontrol edilir (PCP, ayrıca adı doku polarite 5). Bu sinyalizasyon sistemi Drosophila keşfedilmiştir burada küçük birÇekirdek PCP gen grubu cuticular saç ve kılların yönünü kontrol etmek için bulunmuştur. EGF yedi-pass G-reseptörü tip 1 (Celsr1) ve vang benzeri 2 (Vangl2) LAG cadherin frizzled homolog 6 (ayrıca FZ6 olarak anılacaktır Fzd6,) -, - PCP çekirdek genlerinin üç memeli orthologues memeli de benzer bir rol oynar cilt, vücut eksenleri ile saç köklerinin yönelimleri koordine. PCP sinyal yokluğunda birincil kusur köklerinin iç yapısı üzerinde herhangi bir etki ile, saç folikülü yönelimin bir başlangıç ​​rasgele ya da düzensizlik olduğunu göstermektedir FZ6 knockout farelerde (- / - bundan sonra FZ6 olarak adlandırılan Fzd6 tm1Nat) Çalışmaları 6-8. Ikinci bir non-PCP sistemi, kıvrımları ve püskül gibi büyük ölçekli saç kalıplarının üretimine yol açan at köklerinin, yerel hizalama temin etmek için, daha sonra hareket eder. Büyük ölçekli bir ikinci örneğicilt içinde mekansal organizasyon duyusal akson milleri morfolojilerinde görülür. Cildi canlandıran duyusal nöronlar dorsal kök ve trigeminal ganglionlarda hücre organları var. Bu nöronlar, sıcaklık, ağrı, kaşıntı ve deri ve saç üzerine çarpan 9 mekanik deformasyonlar çeşitli algılar. Bunlar, akson çap ve iletim hızı, sinir ucu uç yapısı ve reseptörleri, kanalları ve diğer moleküllerin ifade duruma göre, alt tiplere ayrılabilir. Çünkü cilt içinde innervasyon yüksek yoğunluklu, yani (tek hücre tipi bir flüoresan raportör ekspresyonu ile işaretlenir zaman olduğu gibi) her aksonlar (örneğin, anti-sinir lifi immün) ya da bir tek sınıfın hatta tüm aksonlar görselleştirme içeren analiz genellikle imkansız bir bireyin çardak morfolojisini tanımlamak için yapar akson yoğun bir süperpozisyon ortaya koymaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz son derece seyrek genetik-yönettiği l kullanmışabeling tek tek iyi izole edilmiş akson milleri bir histokimyasal muhabir, insan plasental alkali fosfataz 10 ekspresyonu ile görüntülenmiştir edildiği dorsal deri örneklerini üretmek için. Bu yaklaşım, bireysel akson çardak morfolojilerin kesin görselleştirme ve morfolojik kriterlere dayalı somatosensori nöron türlerinin bir tanımını verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

Cilt son derece heterojen bir dokudur. Intra-dermal yapılar saç folikülleri, arrector pili kasları, (örneğin Merkel hücre kümeleri gibi) epidermal uzmanlık, yağ bezleri, sinirler ve sinir uçları ve kılcal damarları içerir. Bu yapıların mekansal düzenlemesi sıkı bir mikroskopik ölçekte kontrol edilir - görüldüğü gibi, örneğin, tek bir saç folikülü içinde hücre türlerine düzenli düzenlemede - ve bir makroskopik ölçekte - saç binlerce hemen hemen aynı yönelimleri tarafından görülen cildin yerel bir bölge içinde folikül. Fiziksel olarak cilt kesit olmadan bu yapıların görselleştirme için bu organın 2 boyutlu geometri mümkündür. Bu protokol, biz fare deri, disseke sabit, geçirgenleştirildi, lekeli ve bozulmamış bir iki boyutlu nesnenin, düz bir montaj olarak açıklığa kavuşturulması olduğunu göstermektedir. Protokol opt derinin geniş alanlarda tam kalınlığı boyunca kendi bütünlüğü içinde cilt yapıların kolay görselleştirme sağlarnik bölümleme ve yeniden yapılanma. Bu yapıların görüntüler de vücut eksene konumu ve oryantasyonu ile ilgili bilgi ile entegre edilebilir.

Cilt flatmounts ve aydınlık görüntüleme melanin pigmentasyonu (Şekil 4) dayalı görüntü deri duyu aferentlerine (Şekil 3A 10) ve saç folikülü desenleri kullanılabilir. Cilt flatmounts Konfokal görüntüleme anti-sitokeratin-6 ile ya da anti-görüntülenmiştir AM boya alımı (3H-L Şekil), (2) arrector pili, kas, ile görselleştirilmiştir (1) Merkel hücre kümeleri, geometrisini tanımlamak için kullanılabilir düz kas aktini (Ş...

Watch this Scientific Journal Video about Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology at JoVE.com

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

flat-mount-imaging-mouse-skin-its-application-to-analysis-hair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.2K Görüntüleme.  Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine.  Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır. 

Video: Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz Görüntüleme Dağı