Ona sürekli yardım ve bu işe yapıcı eleştiri ve Dr. Donna L. Hammond; konfokal mikroskopi / fare plantar punch biyopsi immün görüntüleme ilk standardizasyon yardımlarından dolayı Dr. Yuriy M. Usachev teşekkür ederiz. Bu çalışma NINDS / NIH (NS069898) hibe ve DPM, Savunma Prostat Kanseri Araştırma Programı Bakanlığı (DoD-PCRP-101.096) Fikir Kalkınma Hibe Ödülü tarafından finanse edildi

1. Hayvan Perfüzyon Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve araştırma hayvanların kullanımı için NIH yönergeleri izleyin. <ol><li> Perfüzyon bir gün önce, 4 ° C&#39;de 1 L fosfat tamponu (0.2 M PB çift distile H 2 O, pH 7.4), ve mağaza hazırlamak Bu perfüzyon ve fiksasyonu sonrası süreçler için kullanılır. </li><li> : 30 saniye için 200 ml cam beher GKD 2 O mikrodalga perfüzyon gününde, (PFA, pH 7.4)% 4.0 paraformaldehid 0.1M PB fiksatif çözüm 2 farelerin perfüzyon için yeterli bir hacmi 500 ml hazırlamak veya kaynar yaklaşımlar kadar. Davlumbaz altında sürekli karıştırılarak beher 20 g granül paraformaldehid (PFA) ekleyin. 5 N NaOH 5 ml damla bilge ve çözüm netleşene kadar karıştırın. PFA tamamen çözülür, oda sıcaklığında (RT) soğutulur. Slowly 0.2 M PB 250 ml sürekli karıştırarak ekleyin. Giderek zayıflar HCl çözümleri (6 N 1 K 0.1 N) kullanarak, pH 7.4 &#39;e ayarlayın. Son hacim 500 ml ve buz üzerinde soğuk ayarlayın. Ayrıca buz üzerinde chill 2 O ve GKD 1:1 seyreltilmesi ile 0,1 M PB 400 ml 0.2 M stok hazırlamak. </li><li> Intraperitonial aşırı dozda anestezi (27G bir iğne ile uygulanan pentobarbital sodyum, 80 mg / kg) enjeksiyonu fare anestezisi. </li><li> Perfüzyon sırasında, 0.1 M PB (GKD 2 O ile seyreltilmiş 0.2 M PB stok 1:1) ve PFA 150 ml, 50 ml fare dolaşıma sırayla geçmiş olacak. PB ile tüp dolum ve bir ucunda 23 1 / 2 G kelebek iğne sabitleme peristaltik pompa ayarlayın. 0,1 M PB içeren behere Hortumun diğer ucunu bırakın. Ile 10 ml / dak peristaltik pompa ve pompa hızı, çözümün bir tüpün içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olmak için yeterli miktarda ayarlayın. </li><li> A kadar bekleyin.nesthetized fare artık ayak / kuyruk tutam ve göz kırpma refleksi olarak herhangi bir refleks aktivite gösterir. Bir davlumbaz içinde bir diseksiyon tepsi ventral tarafta hayvan Lay ve bant ile pençeleri güvenli. % 70 etanol ile kürk Sprey. Göğüs kafesi ve karın duvarı açığa çıkarmak için üst çeyrek, orta hat boyunca deri yoluyla bir kesi olun. Daha sonra, göğüs kafesi tabanı karın duvarı kesti. Bu kesi yaptıktan sonra, diyafram ve sternum alt ucunda görünür olmalıdır. Dikkatli bir şekilde akciğerlere zarar vermemeye özen diyafram marjı ile soldan sağa doğru ve sternumun tüm uzunluğu boyunca kesilmiş. Bu aşamada sternum Bazı küçük kanama normaldir ve perfüzyon taviz olmaz. Bir kez sternum boyunca kesi yapılmış ve diyafram kesilmiş, kalp maruz kaldığı gibi göğüs kafesi yukarı ve dışa doğru, her bir yarısı kaldırmak mümkün olmalıdır. Gerekirse akciğerlerde bir kenara taşıyın. Göğüs kafesinin her iki yarısıhemostatik kelepçeler kullanımı ile bu pozisyonda yapılacaktır. Hayvan uzun eksenine paralel, sol ventrikül içine peristaltik pompa 3-4 mm bağlı kelebek iğne (23 1 / 2 G), takın . Bu yerleşim iğne yerinden olma riskini en aza indirir. Dönüş dolaşımı, kalp dışarı akmasına izin sağ atriyuma küçük bir kesi olun. </li><li> 0.1 M PB ile 4-5 dk 10 ml / dak perfüzyon başlayın. Eğer hala bu noktada sağ atrium kaynaklanan önemli miktarda kan akışını temizlenene kadar devam etmektedir. </li><li> PB akışını durdurun ve% 4 PFA çözüm için peristaltik pompa giriş anahtarı. 5 ml / dak akış hızı düşürün ve 20-25 dakika süreyle PFA çözüm pompalama devam. PFA dolaşıma girerken, birkaç dakika sonra kasların spazmı içine gidin ve hayvan anlamıyla konumunda &quot;sabit&quot; olmalıdır. Bu katılık, hayvan taşımak için özen hindpaws karşı hafifçe iterek test edilebilirnd kanül yerinden. İyi perfüzyon yanıt olarak esneme ekstremite önleyecektir. PFA perfüzyon tamamlandıktan sonra, kanül ve hemostatik kelepçeler kesilir ve kadavra doku diseksiyonu için hazırlanmış olabilir. Diseksiyonu yaklaşım kullanılan özel doku bağlıdır. </li><li> % 4 /% 5 (v / v) PFA pikrik asit (PA) sadece plantar yumruk toplama ve post fiksasyon için% 4 PFA için doymuş pikrik asit çözeltisi ekleyerek hazırlayın. PA Eklenmesi nöronal periferik dokularda 1 antijen seçilebilirliği önemli ölçüde artırır </li><li> % 0.07 gliserol ve% 15 sakaroz ile 0.1 M PB% 10 EDTA - kemik / kıkırdak doku kireç önleyici / dölveriminin çözüm hazırlayın. EDTA-tabanlı çözümler epitoplar 2 muhafaza ederken doku kirecini. </li><li> 0.1 M PB% 30 sakaroz - dölveriminin çözüm hazırlayın. </li></ol> 2. Doku Diseksiyon / Kaldırma, Post-fiksasyon ve Kesit <ol><li> Plantar Punch Perfu yerleştirin.aşağı bir kesim mat veya diğer sağlam bir yüzey sed hayvan ventral tarafta. Ortasına ayak, ayak plantar yüzey-up, punch biyopsi aleti (Harris mikro-yumruk, Ted Pella A.Ş. 3 mm çapında) sıkıca bastırın Holding. Biyopsi aracı arka pençe tamamını kesti onaylamak için biyopsi aracı 180 derece ileri ve geri çevirin. Ayak yavaşça biyopsi aracı kaldırmak ve doku çıkarma kapaklı steril 2 ml tüpe 1 ml% 4 PFA /% 5 PA çözüm içeren. </li><li> Ekstremite Kemik (örneğin, femur) , Hem de arka bacaklarda boyunca devam pelvis düzeyinde hayvanın arka boyunca yatay bir kesi yapmak. Pelvis ve femur proksimal femur başkanı zedelemeden iken pelvis ayrı çevreleyen kas içine Kes. Tibia / fibula distal kafa dokunmadığınızdan oyulmuş, kemik mil çevresindeki kas / periost kaldırılıyor. Femur% 4 PFA / 1 ml 2 ml içeren bir tüp içine yerleştirin% 5 PA çözüm. </li><li> 16-18 saat süreyle bir rocker nazik karıştırma ile 4,% 4 PFA /% 5 PA çözüm doku örnekleri Post-fix ° C </li><li> Aşağıdaki gibi doku kirecini: plantar yumruk (küçük ayak kemikleri kirecini) için 2 ml tüp içinde steril bir kap ile doku yumruk,% 0.07 gliserol ve 15 ile% 10 EDTA çözeltisi 0,1 M PB 1,5 ml içeren % sakaroz. 16-18 saat süren hafif karıştırma ile 4 ° C bacak kemikleri% 0.07 gliserol,% 10 EDTA çözeltisi 0,1 M PB 1,5 ml içeren 2 ml tüp içinde steril bir kap ile doku yerde bir rocker tüp yerleştirin. ve% 15 sakaroz. 6-7 gün, 4 ° C için hafif karıştırma ile bir rocker tüp yerleştirin. 24 saat ve bir çift forseps katılık kaybı için izlenen doku her decalcification çözümü değiştirilmesi gerekir. </li><li> 2 ml steril bir tüpe 1,5 ml (0,1 M PB% 30 sakaroz) dölveriminin çözüm kap doku transferi ve bir rocker w tüp yerii. hafif karıştırma 16-18 saat 4 ° C </li><li> Kesit için doku hazırlayın: bir yatak optimal kesim sıcaklığının hacmi (OCT) bileşik bir Kriyostat doku montaj bloğu (Sakura Finetek USA Inc) ve (tipik olarak -20 ° C&#39;de muhafaza) Kriyostat odasında dondurmak için izin. Kriyojenik aerosol (Sito-freeze, Kontrol Co ABD) dondurma işlemi hızlandırmak için OCT püskürtülür. Place doku OCT bu yatak örnek ve OCT ek bir ince tabaka ile kaplayın. Sertleşti ve doku içinde donmuş kadar yavaşça bu Ekim kriyojenik aerosol sprey. Place Kriyostat odasında kesme kafası üzerine numune ve doku örneği blok kesme sıcaklığına gelmesini sağlayınız - en az 1 saat. Gömme bileşik hala kırılgan bölümleri ve doku hasarı çok soğuk sonuçlar bölümüne çalışıyorum. </li><li> Doku kez optimum kesim sıcaklığına ulaştığında, numune kesme başlayacak ve 40 mikron bölümleri oluşturmak. </li><li&gt; plantar yumruk içeren 10 mM sodyum azid ile 0,1 M PB 12 iyi doku kültürü plakaları cryosections toplamak. 4 ° C&#39;de bu çözüm bölümleri sular altında kalmasını emin olun. Bölüm immün amaçlar için 4-6 ay bu şekilde saklanabilir. Alternatif olarak, serbest bölümler -20 ° C (500 ml 0.1 M PBS, pH 7.2, 30 g sukroz, 10 g PVP40, 300 ml etilen glikol) dölveriminin çözüm süresiz olarak saklanabilir. 3.) saf su ile son ses seviyesini ayarlama 1L bacak kemikleri, jelatin kaplı öncesi slaytlar (veya SuperFrost üzerine cryosections doğrudan toplamak için Plus slaytlar, Fisher Scientific) ve -20 ° C&#39;de saklamadan önce, 1 saat süreyle kurumaya izin Kemik bölümlerinde bu şekilde saklanan slaytlar üzerinde 2-3 ay içinde amaçlar immün için kullanılabilir. </li></ol> 3. Duyusal sinir lifleri Doku Bölümler immün 3.1. Plantar yumrukbölümleri yüzer bölüm boyama <ol><li> Bir tıraş bıçağı kullanarak, 1 ml mikropipet ucunun sonunda 6-7 mm kesti. Ön koşul (uç duvarlara doku bölümleri yapışmasını engeller) 0,1 M PB birkaç kez% 1 fetal sığır serumu (FBS) aspire ucu içinde. 24 iyi doku kültürü plakası lekeli olması plantar yumruk bölümleri aktarın. Normalde 8-10 bölümlerde çeşitli yüksek kaliteli bölümleri immün başına oluşturulur sağlamak için de her boyanmış olmalıdır. </li><li> 500 ul başına dinç RT bir rocker karıştırma ile 5 dakika, 0.1 M PB plantar yumruk bölümleri ile yıkayın. 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> Yıkama solüsyonu atın ve 1 saat süre ile bir rocker nazik karıştırma ile,% 10 keçi serum ve 0.3% 0.1 Triton X-100 M PB (ortalama iyi bir çözüm engelleme 500 ul) oluşan, çözüm engelleme plantar yumruk bölümleri inkübasyon 4 ° C </li><li> Engelleme çözümü birincil antibo atın ve doku kesitlerinde inkübe4 nazik bir rocker karıştırma ile 18-24 saat için 250 ul engelleme çözümü seyreltilmiş dy / antikorlar ° C Araştırmacı deneysel gereksinimleri, tek immunolabeling (belirli bir protein ya da sinir lifi işaretleyici karşı bir birincil antikor ile) veya çift immunolabeling (iki protein veya sinir lifi işaretleri karşı iki primer antikorları ile) dayanarak, aynı bölümde yapılabilir. Çift immunolabeling yerine getirirken farklı immünoglobulin G (IgG) isotypes (örneğin monoklonal antikorlar saflaştırılmış, alternatif olarak kullanılan iki birincil antikorlar farklı konak türleri (örneğin bir fare ve tavşanlarda gündeme yükseltilmiş) yükseltilmiş olduğunu doğrulamak için önemli olan, ya da bir IgG1 ve bir IgG2a) kullanılabilir. Aşırı buharlaşma önlemek için bir gecede inkubasyon Parafilm plaka sızdırmazlık için tavsiye edilir. Periferik duyusal sinir lifleri leke için, birkaç spesifik antikorların kullanılabilir. 200 protein nörofilaman karşı antikorlar (NF200, Sigma) etiket large-çapı elyaf, kalsitonin gen-ilişkili peptid (CGRP Sigma) ise ve geçici reseptör potansiyeli vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) etiket peptiderjik, küçük çaplı periferik duyusal lifler. Tüm periferik sinir lifleri de β3-tubulin karşı antikor ile boyandı. Ciltte kollajen IV (Abcam) epidermis, dermis ayıran bazal membran tanımlamak için kullanılır. Genel bir kural olarak, antikorlar genellikle 5-10 mg / ml konsantrasyonda hücre tabanlı kültürlü immünofloresan deneyleri için daha konsantre 5-10 kat olması gerekir. </li><li> Doku kesitlerinde engelleme çözümünün 500 ul başına (Triton X-100) ve RT bir rocker üzerinde güçlü karıştırma ile 5 dakika yıkayınız. 3 kez daha tekrarlayın. </li><li> 4 bir rocker nazik karıştırma uygun fluorofor-konjuge sekonder antikorlar (genellikle çözüm, 500 ul engelleme 1:1000 sulandırılmış) çamaşır çözüm ve inkübe doku kesitlerinde ° C atın Plaka must fluorophores, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile sarılmış. </li><li> 500 ul engelleme çözümü için iyi RT bir rocker üzerinde güçlü karıştırma ile 10 dakika ile doku bölümleri yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuvvetli karıştırma ile 0,1 M PB 500 ul ile yıkayın. Son olarak, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuvvetli karıştırma ile 0.05 M PB 500 ul ile yıkayın. </li><li> FBS-tedavi ucu (sonundan itibaren 6-7 mm kesim) ile 1 ml mikropipet kullanarak, doku kültürü ve plakası, transfer SuperFrost üzerine bölümleri aspirat Plus mikroskop slaytlar. Bölümleri düzenlemek ve ince bir fırça ile aşırı yıkama tamponu emer. Uzun süre ışığa maruz kalmaktan kaçınınız. Bölümler slayt (5-30 dk) bölümleri kurutmak için izin vermek amacıyla, RT slaytlar inkübe edin. </li><li> Montaj orta (ProLongGold, Vectashield veya benzeri) birkaç damla uygulayın, yavaş yavaş bölümleri üzerine bir cam lamel yerleştirin. Slaytlar, 5 dakika süreyle karanlıkta oturup, ve daha sonra şeffaf tırnak lamel kenarları mühür izin verparlatın. 15-20 dakika süreyle hava kurutma izin verin. Slaytlar şimdi floresan herhangi önemli bir kayıp olmadan birkaç yıldır görüntülenir ya da -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 3.2. Ekstremite kemik bölümleri - slayt boyama <ol><li> Slaytları -20 ° C depolama RT dönmek için izin verin. Hidrofobik bir bariyer kalem (Süper Pap Sıvı Engelleme Kalem, Ted Pella Inc.) Kullanarak çözüm cömert bir tabaka ile boyanmış kemik bölümleri içeren slayt bölge çemberle. 10-15 dakika kurumaya bırakın. </li><li> 5 dakika boyunca slayt başına 0,1 M PB 250 ul kemik bölümleri yıkayın ve 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> Yıkama solüsyonu atın ve çözümü engelleme,% 10 keçi serum ve 4 1 saat süreyle% 0.3 Triton 0.1 X-100 M PB (slayt başına çözüm engelleme 250 ul) ° C oluşan kemik bölümleri inkübe </li><li> Durumunda, engelleme çözümü atın ve primer antikor (ya da birincil antikor birlikte kemik bölümleri inkübe3.1.4 altında belirtildiği gibi çift immunolabeling), 4 saat süreyle 18-24 250 ul engelleme çözümü ° C seyreltilir Bu, slaytları primer antikor çözüm kurumasını önlemek için, kapalı bir kapak ile nemlendirilmiş bir odasında yerleştirilir gerektiğini not etmek çok önemlidir. Periferik duyusal sinir lifleri leke için, antikor (bkz. bölüm 3.1.4) yukarıda belirtilen benzer çalışma konsantrasyonları ile kullanılabilir. </li><li> 250 slayt başına RT az 15 dakika süreyle bloke çözüm ul (Triton X-100) ile doku bölümleri yıkayın ve 3 kez daha tekrarlamak. </li><li> Yıkama solüsyonu atın ve uygun fluorofor-konjuge sekonder antikorlar (genellikle engelleme çözümü, 250 ul 1:1000 sulandırılmış) kemik bölümleri inkübe 4 ° C Boyama odası fluorophores, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile sarılmış olmalıdır. Kolaylık sağlamak için, koyu renkli boyama odaları (örneğin Slayt kuluçka tepsi / kutu, RPI Corp) kullanılması tavsiye edilir. </li><li> WRT 15 dakika boyunca slayt başına çözüm engelleme 250 ul kül kemik bölümleri. Daha sonra RT az 15 dakika süreyle 0,1 M PB 500 ul ile yıkayın. Son olarak, oda sıcaklığında 15 dakika için 0,05 M PB 500 ul ile yıkayın. GKD 2 O Dip kısaca slaytlar çalkalayın ve kuru hava (5-30 dk) kemik bölümleri izin vermek için RT inkübe. Uzun süre ışığa maruz kalmaktan kaçınınız. </li><li> Montaj orta (ProLongGold veya benzeri) birkaç damla uygulayın ve yavaş bölümleri üzerine bir cam lamel. 5 dakika süreyle karanlıkta slaytlar standı, ve daha sonra şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları mühür edelim. 15-20 dakika kurumasını bekleyin. Slaytlar floresan kaybı olmadan birkaç yıl boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar 4.1. Plantar yumruk bölümleri Plantar yumruk doku bölümleri veya 10X, 40X veya 63X amacı ile konfokal mikroskop altında, Epifloresans mikroskop altında görüntülendi olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" /> Şekil 1, epidermal-dermal kavşakta ve kıkırdak ve kas Kollajen IV antikor (yeşil), bazal membran ile boyama AD gösterisi . Sayısız CGRP (AB, kırmızı) ve NF200-pozitif lifler (CD, kırmızı), plantar bölgede fare deri (oklar) boyunca dağıtılır. (; kırmızı F) esas (ok uçları yeşil) CGRP-pozitif küçük çaplı lifler sınırlı boyama TRPV1 ise β3-tubulin, bir pan-nöronal belirteç (E, kırmızı). A ve C 10X objektif (-500 mikron çaplı bar) ile alınan Epifloresans görüntüler, B, D, E ve F 2 mikron artışlarla, 60X objektif (ölçek altında alınmış bir 11-görüntü z-yığını üretilen konfokal görüntü karışımları bar - 50 mikron). 4.2. Ekstremite kemik bölümleri Ekstremite kemik doku bölümleri de Epifloresans mikroskop altında, ya da bir konfokal mikroskop altında görüntülenir.10X, 40X veya 63X amacı ile e. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" /> , Anti-NF200 (CD, kırmızı; oklar), anti-β3-tubulin (E; kırmızı) ve anti-TRPV1 (F; kırmızı) co-lekeli; Şekil 2 anti-CGRP (oklar AB, kırmızı) ile immün anti-CGRP antikor (yeşil oklar). Bu görüntüler, süngerimsi kafa bölgede fare femur kemik matriks boyunca dağıtılan duyusal sinir lifleri alt tipleri göstermektedir. A ve C 10X objektif (-500 mikron çaplı bar) ile alınan Epifloresans görüntüler, B, D, E ve F 2 mikron artışlarla, 60X objektif (ölçek altında alınmış bir 11-görüntü z-yığını üretilen konfokal görüntü karışımları bar - 50 mikron).

<ol>
	<li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixative+Composition+Alters+Distributions+of+Immunoreactivity+for+Glutaminase+and+Two+Markers+of+Nociceptive+Neurons,+Nav+1.8+and+TRPV1,+in+the+Rat+Dorsal+Root+Ganglion.">Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion.</a> Journal of Histochemistry &#38; Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).</li><li>Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+different+decalcifying+agents+on+EGF+and+EGFR+immunostaining.">Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining.</a> Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).</li><li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology.">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7, 155-159 (1986).</li><li>Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+sprouting+and+changes+in+nociceptive+sensory+innervation+in+the+glabrous+skin+of+the+rat+hind+paw+following+partial+peripheral+nerve+injury.">Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury.</a> The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).</li><li>Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+loss+corresponds+to+the+development+of+Taxol-induced+hyperalgesia+and+can+be+prevented+by+treatment+with+minocycline.">Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline.</a> Pain. 152, 308-313 (2011).</li><li>Bloom, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer-Induced+Bone+Remodeling,+Skeletal+Pain,+and+Sprouting+of+Sensory+Nerve+Fibers.">Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers.</a> The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).</li><li>Constantin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Tumor+Necrosis+Factor+&#945;+(TNF&#945;)+Requires+TNF+Receptor+Type+2+to+Generate+Heat+Hyperalgesia+in+a+Mouse+Cancer+Model.">Endogenous Tumor Necrosis Factor &#945; (TNF&#945;) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model.</a> J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).</li><li>Jankowski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+Cutaneous+Nociceptors+after+Nerve+Transection+and+Regeneration:+Possible+Role+of+Target-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling.">Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).</li><li>Jimenez-Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+Sprouting+of+Adult+Nociceptors+in+Chronic+Prostate+Cancer-Induced+Bone+Pain.">Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain.</a> J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).</li><li>Persson, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium-calcium+exchanger+and+multiple+sodium+channel+isoforms+in+intra-epidermal+nerve+terminals.">Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals.</a> Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).</li><li>Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+Enterotoxin+B+Causes+Proliferation+of+Sensory+C-Fibers+and+Subsequent+Enhancement+of+Neurogenic+Inflammation+in+Rat+Skin.">Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin.</a> Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).</li><li>Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+loss+of+peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+an+STZ-induced+mouse+model+of+insensate+diabetic+neuropathy.">Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy.</a> Pain. 140, 35-47 (2008).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Burada fare, cilt ve immün ve periferik duyusal sinir lifleri algılama kemik doku kesitlerinde hazırlanması için yöntemler ayrıntılarıyla belirttik. Plantar punch biyopsi üretilen bölümleri hem tüysüz ve saçlı deri içeren protokol, her cilt tipine kullanılabilir anlamına gelir. Bu teknikler aynı zamanda diğer hücre türleri (örneğin lökosit, vasküler endotelin, düz kas diğerlerinin yanı sıra) bu dokuların leke istihdam edilebilirler. Bu yöntemler en iyi ultrastrüktürel korunması arası...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog No. </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> 3mm Harris Micro-Punch </td><td> Malzeme </td><td> Ted Pella </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> Perfüzyon pompası </td><td> Malzeme </td><td> VWR Uluslararası </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Reaktif </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Pikrik asit </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> Ekim gömülmesi bileşik </td><td> Reaktif </td><td> Doku-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cyto-Freeze kriyojenik aerosol sprey </td><td>Malzeme </td><td> Kontrol Şirketi </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi Serumu </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Kuluçka tepsi ve immün kapağı (Large) </td><td> Malzeme </td><td> RPI Corp. </td><td> 248.270 (tepsi) 248.270-A (kapak) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge hidrofobik bariyer kalem </td><td> Malzeme </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Camel Saç Fırçaları (# 1 kalınlığı) </td><td> Malzeme </td><td> Ted Pella </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Uzun Altın orta Montaj </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue preparation and immunostaining of mouse sensory nerve fibers innervating skin and limb bones

Algılama ve periferik duyusal sinir lifleri tarafından fiziksel, kimyasal ve termal duyusal uyaranlar birincil işleme, hayvanlarda ve insanlarda duyu algı anahtar. Bu periferik duyusal sinir lifleri, algılayabilir ve belirli duyusal uyaranlar başlatmak reseptörleri ve iyon kanal proteinlerinin bir bolluk ifade eder. Yöntem aynı zamanda bu liflerin belirli bir iyon kanalı proteinlerin fonksiyonel ifade tanımlamak için kullanılabilir cilt innerve periferik duyusal sinir lifleri, elektriksel özellikleri karakterize etmek için kullanılabilir. Ancak, benzer elektrofizyolojik yöntemler mevcut değildir (ve de geliştirmek için zor), periferik duyusal sinir lifleri, kemik gibi en zorlu dokuların da dahil olmak üzere diğer visseral organları innerve reseptörleri ve iyon kanal proteinlerinin fonksiyonel ifade algılama. Ayrıca, bu gibi elektrofizyolojik yöntemler olmayan Uyarılabilir protein ifade belirlemek için kullanılanperiferik duyusal sinir lifleri var. Bu nedenle, duyusal sinir fivers periferik / visseral doku örnekleri immün Bu sinir lifleri ilgi spesifik proteinlerin ekspresyonunu belirlemek için en iyi şekilde sağlar. Şimdiye kadar, duyusal nöronlarda protein ekspresyonu çalışmaların çoğu bilgi, belirli proteinlerin hücre vücudun belirli türleri ya da duyusal nöronların alt kümelerini ifade sınırlı duyu ganglionlar, prosedürleri immün kullanılmaktadır. Burada, periferik duyusal sinir lifleri immün periferik / visseral doku örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı yöntemleri / protokoller raporu. Biz özellikle deri veya plantar punch biyopsi ve kemik (femur), periferik duyusal sinir lifleri immün farelerden elde edilen bölümleri hazırlanması için ayrıntılı yöntemleri. Bu yöntemler sadece periferik duyusal nöronlar protein ekspresyonu kalitatif tayin önemli değildir, aynı zamanda bir kantitatif yöntem sağlamakduyusal liflerin belirli türleri veya altkümelerini protein ekspresyon düzeylerinde değişiklikler tespit yanı sıra, çeşitli patolojik durumları sırasında duyusal liflerin sayısı ve yoğunluğu, morfolojik ve / veya anatomik değişiklikler belirlemek için. Ayrıca, bu yöntemler sadece duyusal sinir liflerinin boyanması sınırlı değildir, aynı zamanda deri, kemik ve diğer visseral doku herhangi bir tür sinir liflerinin boyanması için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones at JoVE.com

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

tissue-preparation-immunostaining-mouse-sensory-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.0K Görüntüleme.  The University of Iowa. Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nörobilim

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...