iş Britanya Tıp Araştırma Konseyi projesi hibe GSB için G0601253 ve SG &#39;ve GSB bir SULSA Bioskape hibe ile finanse edildi

Bu yöntemler, 2 Fare insanca servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı RW ve diğ. Banks rapor araştırma, kullanılmıştır. İngiltere&#39;de, bu bir Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) listelenen yasal onaylı Program 1 yöntemi Yasası, 1986 ve Avrupa Direktifi 2010/63 / EU. Bu, federal yasalar tüm prosedürleri onayladı Hayvan Refahı tarafından Aberdeen Üniversitesi ve Etik Değerlendirme Kurulu lokal olarak uygulanır. Etiketleme 1. hazırlanması Kulaklar <ol><li> Böyle Liley (1956) 5 olarak, standart bir serum fizyolojik hazırlayın ve% 90 O 2 /% 5 CO 2 (carbogen) ile doyurabilecek. (12) NaHCO 3, KCI (4), KH 2 PO 4 (1), NaCI (138.8), MgCI2 (1), CaCl2 (2) ve glukoz (11): Liley en tuz (mm). NOT: Bu yazının geri kalanı boyunca, &#39;tuzlu&#39; tam karbojen ile doymuş tuzlu sevk edecektir. dissectio sırasında20 dk - n, hazırlık her 15 kapsayan tuzlu su yenileyin. </li><li> Insanca kafatası zarar vermeden bir yetişkin fare euthanize. NOT: C57 / Bl6J ve MF1 fareleri kullanmış ancak herhangi bir fare suşu kullanılabilir. en önemli yönü, büyük yetişkin (&gt; 25 g) kullanmak değildir. Büyük farelerde Etiketleme, daha az güvenilir sık ​​sık köklerinin küçük ve dağınık gruplar sınırlı ediliyor. </li><li> (50 mm genellikle uygundur) sadece yoğun saç çizgisinin üzerinde, ~ 25 cm makas ile tabanına yakın dış kulakları (pinnae) çıkartın ve bir silikon kauçuk kaplı kültür / petri tuzlu su içinde daldırın. </li><li> aşağı pinna anterior (içbükey) tarafını yerleştirin ve ince böcek iğneli düzenli aralıklarla silikon marjlarını pin (~ 6 - kulağın başına 8, ~ 0.2 mm çaplı pim). 20 dakika, ya da sürekli perfüze banyo kullanmak - saline her 15 yenileyin. </li><li> Dikkatle başlangıçta kepçesi kesim tabanından her yerinden erişen, künt diseksiyon ile ön deriden arka cildi soyarakKalın merkezi kıkırdak ve sistematik ince, kıkırdak serbest dış marjları yönelik çalışma. <ol><li> Bunu yapmak için, hiçbir bir çift arka deri kesim kenarının merkezini tutun. 3 forseps. çeneleri kapalı Sonra, hiçbir başka bir dizi noktaları yerleştirin. Deri ve altta yatan kıkırdak arasındaki boşlukta 3 forseps. </li><li> Yavaşça arka cildi geri soyma katmanları ayırmak için ise dikkatle yapışıklıklar gevşetin, gerekli minimum güç kullanarak, yan-yan boşluğu içinde kapalı forseps noktaları çalışır. </li></ol></li><li> Posterior cilt kaldırıldı ile, bir pozisyonda ön cildi. (Yukarıda, 1.5) başı olarak ön derinin yanında, yukarı arka cilt, cilt tarafı sabitleyin. </li><li> Sonra, dikkatle ve tamamen 1.6 ile aynı künt diseksiyon tekniği ile ön deri cilt katmanları arasında sıkışmış olan kulak kepçesi kıkırdağı kaldırın. forseps ile delinme delik yapmaktan kaçının. </li><li> Daha sonra, fya da her ikisi kulak kepçesi cilt preparatları nazikçe kabuğu, koparmak ve saç folikülü üsleri kapsar polistiren köpük, benzeyen, bağ dokusunun ince bir tabaka uzak ovalayın. NOT: En iyi takas Alınması biraz pratik alabilir; çok güçlü bir şekilde kazıma köklerinin dibinde olan yapay sinir ağları kaldırır ise yetersiz doku alınması, boya çözümü için ve görüntüleme için hem de erişim engeller. </li><li> tuzlu su yenileyin. </li></ol> 2. mızrak şeklinde Terminali Etiketleme NOT: Aşağıdaki protokol stiril piridinyum boya için optimize edilmiştir. Diğer kimyasal olarak benzer, stiril piridinyum boyalar, belki de konsantrasyon ve kuluçkalama süresi bazı ayarlamadan sonra, çalışmalıdır. boya çözümleri tutarken eldiven ve bir laboratuvar ceket giyin. Ya doğrudan üreticiden 10 mM stok boya çözeltisi satın almak ya da glikoz olmadan tuzlu su içinde boya tozunun çözülmesiyle stok hazırlamak. Kısım (10 ul genellikle uygundur, ama büyük SCA için bu ayarlamaLe deneyler) ve mağaza -80 ° C, -20 ° C&#39;de 6 aya kadar ya da yaklaşık 1 yıl boyunca dondurulmuştur. Toz, en az 2 yıl süreyle saklar. Tekrarlanan dondurma / boya çözümleri çözülme döngüleri önlemek; Bu hızla boya denatüre. Bir kez 4 ° C&#39;de mağaza, çözüldü ve 1 hafta içinde kullanın. <ol><li> su yüzeyinin altında - 5 mm bir platform ~ 3, 30 ° C bir su banyosu önceden ısıtın. </li><li> Taze 10 uM stiril piridinyum boya çözeltisi (10 mi tuzlu su taze çözüldü, 10 mM stiril piridinyum boya 10 ul) hazırlanması ve su banyosu içinde dengeye. </li><li> (Tipik hacmi ~ 2 ml) serum fizyolojik 2 mm - Pin silikon kauçuk her hazırlık 1 batık 35 mm kültür yemekleri kaplı. hayvan kullanımını en aza indirmek için, - (15 cm uzunluğunda 10) küçük bir makas ile temel için tepe noktasından yarıya ise her kulak kepçesi cilt hazırlığı iki hazırlıklarını verecektir. </li><li> 30 ° C su banyosu içine daldırılmış bir platform üzerinde tuz kaplı kepçesi preparatları içeren 35 mm&#39;lik kaplara yerleştirin. sağlamaksu derinliği yeterli ısınma için yeterli ama açık çanak tuzlu bulaşmaz. </li><li> Pim ince (0,5-1 mm dış çapı) sürekli hazırlıkları gaza her yemeğin silikon üssü haline O 2 / CO 2 akan boru. Ayrıca su banyosu içine çamaşır / bulaşık tazelemesi için boya içermeyen tuzlu 100 ml yerleştirin. carbogen doygunluğu korumak ve su kirlenmesini önlemek için sıkıca tıpalı-şişesi kullanın. </li><li> daha sonra şişe tıpalı 100 ml kepçesi hazırlıkları üzerinde tuz yerine, 30 dakika boyunca 30 ° C &#39;de her dengelenmesi. 30 dakika daha inkübe edilir. NOT: Bu yedek tuzlu buharlaşma ve gaz hattı köpüren kaynaklanan herhangi bir toplu hacim kayıpları telafi eder. </li><li> Daha sonra, hızlı ve dikkatli bir şekilde bir boya çözeltisi ile seyreltme etkisi aşağıdaki eklenecek en aza indirmek için kağıt mendil ile hazırlanması üzerine, kalan herhangi bir sıvı kaldı leke, 100 ml&#39;lik bir atık behere boya salin boşalt. (Dokunmamaya özen gösterin <em&gt; yani hasar) doğrudan maruz kalan derin dermal yüzeyler. </li><li> daha sonra 30 ° C&#39;de 40 dakika süre ile 10 uM stiril piridinyum boya 3 ml prosedürün geri kalan kısmında R / t geri - 2 kulak kepçesi preparatları inkübe edin. </li><li> R / T çözümlerini kullanarak, üç aşamada olmayan içselleştirilmiş boya çıkarın. Not: Bu adımlarda en iyi görüntüleme için göz koyu adaptasyonu başlamak için en az ortam ışığı (karartma perde, kırmızı / turuncu düşük yoğunluklu aydınlatma) yapılmaktadır. <ol><li> Bir atık behere yemeklerinden etiketleme çözümü uzak dökün ve hızlı bir şekilde peş peşe boya içermeyen tuzlu üç değişiklikleri durulayın. Bu preparatlar ve açıkta kalan zarlardan departitions bir boya bakiye stiril piridinyum boyası çözeltisi yapışmasını kaldırır. </li><li> Yüzey membranları, yani en kalan boya departition bir 30 dakika daha boya salin nihai değişim inkübe terminaller tarafından içselleştirilir olmayan boya. </li><li> Kalıcı boya sıkışmış t kaldırsülfonatlı B-siklodekstrin türevi ile kenetleme maruz membran dış sayfada o (Advasep-7, 1 mM, 5 dakika - Tablo 1 e bakınız). Böylece, geri kalan tüm boya dokular içinde olacaktır. </li></ol></li><li> görüntüleme için, taze boya salin yerleştirin ve iyice kağıt mendil ile çanak dışında kurutun. NOT: terminaller artık görüntüleme için hazır. Mızrak şeklinde sonlar yavaşça tekrar endocytosed stiril piridinyum boya bırakmadan, bu nedenle, canlı ve farkında olmak önemlidir. Bu R / T, daha yavaş olacak olsa da, görüntüleme sırasında / &#39;önce gecikmeleri en aza indirmek için önemlidir. Deney birden düzenlemelerine göre hazırlanmıştır gerektiriyorsa, ilk bunları 30 ° C &#39;de etiketlenmemiş korumak. Onlar birkaç saat boyunca canlı olacaktır. İlk görüntüleme sırasında - Sonra aralıklarla sırayla etiket, ikinci hazırlık etiketleme ile (2.8.3 2.7 adımlar). </li></ol> Lanceolate Endings Etiketli 3. Görüntüleme. NOT: Gözlemciolmalıdır Aşağıdaki görüntüleme aşamaları için koyu adapte. Bu tanıyor artan görme keskinliği düşük uyarım ışık seviyesi görüntüleme için folikülleri bulmak için gerektiği anlamına gelir. Bu fototoksisite en aza indirilmesi yerine photobleaching rahatsızlık azaltmak için çok önemlidir. Tam yoğunluk aydınlatma tarafından oluşturulan serbest radikaller hızla (60 saniye içinde) sinir terminalleri (GS Bewick, S. Fadul ve WJ Betz, yayınlanmamış gözlemler) yaşayan öldürebilir. <ol><li> görüntüleme önce, bir diseksiyon stereomicroscope altında hazırlanmasını kontrol etmek ve dikkatli bir yüzey pislikleri temizleyin. Bu görüntülerin kirlenmesine neden olan oto-floresan engeller. <ol><li> Standart bir floresein filtre seti ile dik bir Epifloresans mikroskop sahnede çanak monte edin (480 - 488 nm uyarma, 500 - stiril piridinyum boya için 520 nm emisyon). </li></ol></li><li> rahatça terminali bulmak için sadece yeterli kadar nötral yoğunluk filtreleri ile uyarma ışık yoğunluğunu azaltmaks. </li><li> düşük gözlemleyerek etiketli folikülleri bulun - sonra, giderek daha yüksek (10x ve 20x suya daldırma objektif) büyütme hedefleri (3.5x kuru hedefi 4x). </li><li> düşük güç ve yüksek büyütme için 20x suya daldırma hedefleri için 10x kuru hedefi ile etiketlenmiş hançer terminallerinin görüntüleri yakalayabilir. ışık şiddeti ve maruz kalma süresini en aza indirmek (0.5 bir kamera entegrasyonu süresi - 1 sn önerilir). </li><li> Standart bir dijital kamera görüntü yakalama ve özel yazılım kullanarak bilgisayarın sabit diskinde görüntüleri kaydetmek. Not: Tipik bir örnek, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Resim ~ her hazırlık 20 hançer sonlar. Bu marj görüntüleme sırayla her folikül boyunca kulak kepçesi deri ve işin dibinde kesim kenarından marjı sağdaki başlayın. Biraz aynı folikül iki kez görüntü vermemeye dikkat ederek, alanlar kesme kenarına paralel örtüşen arasında çalışmak ve tabii ki zarar görmüş herhangi. NOT:Yeniden genelde hepsini önemli spontan de boyama oluşmadan önce görüntüye çok hançer terminalleri bulunmaktadır. Böylece, sistematik aşağıdaki protokol kullanılarak nüfus örnekleme öneririz. </li><li> marjinal şeridi tamamladıktan sonra, kulak kepçesi tabanına doğru bir alan genişliği taşımak ve ters yönde işlemi tekrarlayın. </li><li> Görüntü tüm terminaller açıkça çok daha eğik optik düzleme ve standart halka şeklindeki analizi ROI içinde tamamen uyacak şekilde olası yönelik zaman zaman olanlar hariç, karşılaşılan (Bölüm 4&#39;e bakınız). onlar besbelli hasarlı veya arka plan yoğunluğu lokalize doku hasarını gösteren, özellikle yüksek olmadıkça, çevredeki terminallere göre alışılmadık parlak veya karanlık lanceolates dışlamayın. </li><li> cilt alanının% 10&#39;dan fazla / terminaller / kullanılamaz bozuksa hazırlık atın. Not: lanceolates kez destain gibi, tam bir görüntüleme yıkama sonunda 20 dakika içinde her bir preparat. </li><li> benf yoğunluk karşılaştırmaları zaman eşleşen hazırlıklar tarafından geçerli olmasını sağlamak, birden fazla hazırlık kullanarak. Bunu yapmak için, de-leke kez karşılaştırılabilir sağlamak için, 30 dakika ~ her hazırlık boyama zamanlamaları ofset. </li><li> 5 ya da 10 dakika aralıklarla de-leke (ekzositoz), görüntü aynı terminal izlemek için. uygulama ile, herhangi bir hazırlık her bir zaman noktasında 3 ayrı terminallerine kadar görüntü mümkündür. </li></ol> Lanceolate Endings Etiketli 4. Analiz. Not: Aşağıdaki prosedür, terminal yoğunluğu analiz etmek için hızlı bir yöntemdir. <ol><li> Faiz (ROI) dairesel bir bölge yapmak folikülün tabanına (Şekil 2) saç şaftının ucuna merkezli. analiz edilecek herhangi bir folikül saç şaft otomatik floresan önlemek için yeterince büyük halka şeklindeki ROI iç çevresi Set ama yine de tüm terminal floresan kapsamaktadır. dış çevresinin en büyük termin içine kadar büyük olduğundan emin olunal olasılıkla o ana optik / folikül eksenine yakın odaklı karşılaşılması. </li><li> Hedef anülüse alanında bir arka plan ROI yaklaşık olarak eşit olun (kare veya daire, genelde ~ 400 mikron 2) analiz edilen terminalin çevresinde yerel boyama yoğunluğunu belirlemek için. Not: Bu iki ROI boyutları analizi başında belirlenen herhangi bir deney içinde tüm preparasyonlar arasında sonraki tüm foliküller / mızrak şeklinde terminalleri analiz etmek için kullanılır. Yani, başlangıçta özenle kendi parametrelerini ayarlamak önemlidir. </li><li> terminalleri, folikül arasında değil düşük yoğunlukta cilt altında yatan yağ bezleri yerel arka plan temsil etmek folikül yakın plan ROI yerleştirin, ancak herhangi bir terminal bölgeleri dahil değil dikkatli olun. </li><li> &#39;Ölçü&#39; ya da bir elektronik tabloya yazılım ve veri aktarımı &#39;analiz ROI&#39; fonksiyonunu kullanarak iki ROI ortalama yoğunluğunu kaydedin.</li><li> E-tabloda, her folikülü için net bir yoğunluk vermek için halkasında olandan ortalama yerel arka plan yoğunluğu çıkarın. lokalize arka plan için bu ayar ölçüde arası folikül değişkenliği azaltır. </li></ol>

<ol>
	<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li><li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles.">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+microstructure+of+receptors+on+sinus+hair.">On the microstructure of receptors on sinus hair.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).</li><li>Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+expression+of+small+conductance+calcium-activated+potassium+channels+(SK1-3)+in+sensory+endings+of+muscle+spindles+and+lanceolate+endings+of+hair+follicles+in+the+rat.">A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat.</a> PLoS One. 9, e107073 (2014).</li><li>Liley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+spontaneous+activity+at+the+neuromuscular+junction+of+the+rat.">An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat.</a> J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).</li><li>Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+hair+follicles+are+innervated+by+one+afferent+axon?+A+confocal+microscopic+analysis+of+palisade+endings+in+the+auricular+skin+of+thy1-YFP+transgenic+mouse.">How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+movements+of+fluorescently+labeled+synaptic+vesicles+in+frog+motor+nerve+terminals+during+nerve+stimulation.">Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation.</a> Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+transmitter+release+and+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).</li><li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles:+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending.">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li><li>Drew, L., Wood, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli.">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3, (2007).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li><li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents.">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bewick ve Betz ilk N- piridinyum sinaptik vezikül membran yerel geri dönüşüm izlemek için stiril piridinyum boyalar 7-10 dibromür ilgili (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) geliştirdi. Boya alımı ve bu nedenle artan flüoresans nedenle sinaptik vezikül membran içselleştirme (endositoz) yansıtır. Daha sonra, bu içselleştirilmiş boya ileri elektriksel aktivite ile yeniden serbest bırakılabilir, boya kaybını gösteren kese zarı dışsallaştırılmasını (ekzositoz) izler. sinaps, bu nörotransmitter salgılanması için bir proxy. Aynı zamanda, biz de bu boyalar birincil mechanosensory sinir uçlarını 7 etiket bulundu. Daha yakın zamanlarda 11, Bewick, Bankalar ve arkadaşları daha sonra bu olgun, farklılaşmış mechanosensory terminalleri ex vivo benzer bir süreç yansıttığını gösterdi. Burada yine, boyalar glutamat serbest bırakmak için yapısal geri dönüşüm 50 nm çapında &#39;sinaptik benzeri&#39; veziküller (SLV) etiket.mechanosensory terminallerde, onların sinaptik meslektaşları aksine, bu geri dönüşüm öncelikle kendiliğinden gerçekleşir. Ayrıca, mekanik, yerine sadece elektriksel stimülasyon tarafından modüle edilir. Kültüründe ve koklea saç hücreleri, özellikle de genel stiril piridinyum boyada stiril boyalar duyusal nöronlar için mechanosensory kanal bloke edilmesi ve geri dönüşü olmayan iç membranlar 12 etiketleme mechanosensory kanalları boyunca geçmeye gösterilmiştir. Ancak, kas iğ 11 2, veya la sonlara hançer sonlara burada yerinde farklılaşmış mechanosensory terminalleri, karşılaştırılabilir stiril boya konsantrasyonlarında ve mekanik 13, 14 uyarılmış değil saç hücreleri, etiketleme membran endositoz gereğidir. Mechanosensory sinir terminalleri, örneğin, etiketleme döner ve 2, 11, 1 Burada kullanılan konsantrasyonlarda mechanosensory yanıtları bloke etmezBu sonlar kanal nüfuz bazı boya içselleştirilmesi tamamen göz ardı edilemez iken 5., Latrotoxin ile yakın toplam destain olgun terminalleri etiketleme büyük çoğunluğu geri dönüşüm vezikül membranı ile içselleştirme yoluyla olduğunu gösterir. Dolayısıyla biz, boyaların alımı ve salınımı üzerindeki ilaç etkilerini inceleyerek, en son, mechanosensory afferent terminallerde SLV geri dönüşüm farmakoloji 2 aktivitesi bağımlılığını 11 incelemek için bu tekniği kullanılır ve var. En pratik tekniklerle olduğu gibi, tekrarlanabilirlik tekrarı ve pratik gerektirir. güvenilirliğini sağlamak için bazı temel noktaları şimdi ele alınacaktır. genç hayvanlarda mızrak şeklinde etiketleme daha güvenilir - biz kullanılan en küçük hayvan 15 g vücut ağırlığı oldu. Bu durumda neden tam olarak belli değil, ama genç bağ dokusu diseksiyon daha az mekanik travma ve le gerektirir çünkü olabilirinnervasyon tabaka üzerinde uzanan doku çıkarırken aves az bir tortu kalmıştır. Genel olarak, doku hazırlanması sadece yaşlı farelerde daha sonra ayrı cilt katmanları soyulma olmanın teknik açıdan en zorlu pratik yönü ile oldukça basittir. Bunlarda, diseksiyon başladığı yerde deri katmanları üssünde güçlü bir arada yapışır, ama burada bile katmanları ayırma marjları karşı çok daha kolay olur. genellikle ön cildi olduğu gibi Neyse ki, ya da belki de bu nedenle, bu ince marjinal deri bölgeleri genellikle, en tatmin edici etiketleme verir. Bu nedenle, özellikle kenarlarında çok ince cilt açgözlü kaçının. Hasar riskini en aza indirmek, doğrudan kapalı forseps ile iterek yerine tutarak dolaylı hazırlıkları işlemek veya olası temel kavramak sadece sert dokuların etiketlenmesine eğer. Bu ana beni olduğu gibi hemen folikülleri örten &#39;levha polistiren&#39; katmanı kaldırarak eksiksiz olmasıgörüntüleme ve ilaç erişimine chanical tıkanıklığı. Ancak, hemen altında yatan bu zararlar gibi yapılar (yani uzak şeritler) sinir ağları ve terminalleri ile fiziksel temas en aza indirmek için esastır. baskın floresan yağ bezlerinde sarı / beyaz ise, saç şaft üsleri ve sarı / turuncu hançer uçlarının birkaç hilal belirgin otomatik floresan, bu sinir pleksus tabakası ve ilgili hançer terminalleri açıklığı sırasında kaldırılmıştır gösterir. Bu eski (&gt; 30 g) fareler ile ana sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. boyama işlemleri boyunca, her 30 ° C &#39;de ve de oksijenli sağlar. etiketli terminaller hala hayatta olduğunu unutmayın. Sonuç olarak, boya devam eden spontan (kurucu) ekzositik sürümü tarafından salgılanan edilecektir. Bu R / T&#39;de daha yavaş olacaktır, ancak boya kaybını en aza indirmek için, şelasyon çözüm ve görüntüleme kaldırılması arasındaki gecikmeyi en aza indirmek için iyi bir uygulamadır. Ayrıca için gruplar arası karşılaştırma amaçlı Syoğunluk tudies, tüm grupların görüntüleme sağlamak esastır zaman uyumlu olduğunu. görüntüleme önce bir boya kenetleme maddesinin kullanılması, büyük ölçüde görüntü kontrastını geliştirir. Yani, nispeten pahalı iken, şelasyon adım iyi görüntü kalitesini sağlamaktan oldukça önemlidir. kullanımlar arasında 4 ° C&#39;de depolandığında, 3 gün üst üste - şelasyon kullanımı bile 2 çözüme birden çok kez yeniden kullanarak minimize edilebilir ve. onun boya haciz doygunluğunu yaklaşıyor gösteren belirgin pembe gider kez şelasyon çözüm atın. görüntüleme sırasında, yoğunluk ve uyarma ışık pozlama süresi hem de kümülatif sonucudur bu canlı terminallere fototoksik hasar potansiyelinin farkında olmak. Bu husus görüntü kalitesi birincil endişe tek timepoint görüntüler için daha az önemlidir. Bununla birlikte, en az uyarım ışık maruz kalmasını azaltmak için kinetik çalışmalarda tekrar görüntüleme sırasında çok önemlidir. Bu boyalar geliştirirkenEtiket sinaps, biz sinir terminallerine dramatik ve onarılamaz hasara neden olur tam güç uyarma aydınlatmada&gt; 1 dakika uyarma bulundu. İlk akabinde, büyük ölçüde genişletebilir 15 dakika aralığında bir süre boyunca tam olarak daraltmak. Biz sistematik maruz kalma süresi ve yoğunluğu göreceli katkıları test etmedi, ama bu gözlemler temel ilke, hem en aza indirmek olmalıdır düşündürmektedir. Yani, uyarma ışık şiddeti ve süresi iyi görüntü alma ile orantılı minimum ve uygun kontrol görüntüleri zaman ders çalışmalarında alınması tavsiye edilir. Her zaman noktasında, veri tekrarlanan görüntüleme koşulları altında fototoksisite etkilenmez olmadığını test etmek için önceden görüntülenmemiş terminalin ek görüntü almak. Bu naif terminallerde etiketleme davranış köklerinin defalarca görüntülü benzerlik sağlamaktır. Bir dizi faktör net yoğunluk d grup içi değişkenliği azaltabilirata. uygunsuz boyama hatta küçük alanlarda büyük ölçüde arası folikül veri değişkenliği etkileyebilir olarak ROI doğru yerleştirilmesi, özellikle arka plan ROI, önemlidir. Net yoğunluğu değişkenliği de her saç folikülü uçlarının palisade çevrilidir nasıl tamamen etkilenir. Kuşatma derecesi ilgili bir parametre, örneğin karşılaştır Şekil 2&#39;de görülen hemen hemen tamamen dairesel bir şekil Şekil 1B hilal şeklinde markalama dağılımı. Daha karmaşık analizi, belki de otomatik yazılım algılama ve eşikleme kullanılarak gereklidir. Hatta en doğru şekilde analiz folikül grupları için yoğunluk dağılımları normal nüfus medyan ziyade araçlarının arasında tedavi karşılaştırmalar için parametrik olmayan istatistik kullanımını gerektiren, (bakınız Şekil 3) dağıtılan olmadığını unutmayınız. Böyle bir yüzdesi o kadar yoğunlukları ifade olarak Normalleştirme teknikleri,Ya da bir kontrol grubuna f karşı kontrol birçok preparatlar kadar daha değişkenliği azaltmak için uygulanabilir yaptı. dikkate alınması gereken nihai teknik öğe farmakolojik test için deneysel tasarım. Farmakolojik araştırmalar sırasında, boya uygulama öncesi 30 dakika boyunca ilaç çözeltisi içinde hazırlanmasını önceden inkübe edin. Daha sonra, boya çözeltisi içinde ilaç konsantrasyonunu korumak. ilaç, bir araç, tuzlu su ve aracın içinde eritildi, eğer kontrol olarak, ya tuzlu su kullanın veya. Bu makale, bu yeni kulak kepçesi hazırlık küçük bir hazırlık ile deride mechanosensory sonlar yüksek kaliteli görüntüler sunar gösterilmiştir. Biz de vezikül geri dönüşüm iki kritik yönlerini farmakoloji incelemek için kullanılabilir göstermektedir. Biz bir glutamat reseptör agonisti boya içselleştirilmesi (endositoz bir belirteci) artırabilir ve ikinci, bu boya latrotoxin (ekzositoz bir uyarıcı) ile tekrar kayıp olduğunu ilk gösteriyor. Bu preparat önemiiyon ve teknik terminal fonksiyonu, yapısı ve onların arası ilişkileri optik izlenmesi için eşsiz fırsatlar verecek, görüntüleme deneyleri için yerinde cilt mechanosenory terminalleri yaşayan mükemmel erişim sunuyor olmasıdır. Bu ikinci amaçla, biz de birleşik optik / elektrofizyolojik çalışmalar (detaylar için kardeş vallahi makalesine bakın) kullanılmak üzere daha da geliştirdik.

Genellikle deri veya diğer çevre dokularda derinliklerine gömülü olarak mechanosensory sinir uçları, yerinde erişmek için, genellikle küçük diffüz dağıtılan ve zordur. Görselleştirerek, bu nedenle genellikle, yeşil veya sarı floresan proteini (GFP / YFP) 1 ile floresan etiketler genetik ekspresyonu fare hatları elde etmek için bir uzun immunolabeling / boyama süresi veya gecikme ve gider ardından Kesit gerektirir. Burada uygun bir doku ve çalışma için kıl folikülü afferentleri çok sayıda erişmek için hızlı ve basit bir yöntem göstermek ve hızlı bir şekilde terminali fonksiyon 2 optik izlenmesi için etiketli nasıl. Uygulama ile, görüntüleme diseksiyonu bütün teknik olarak en az 2 saat içinde tamamlanabilir. duyusal akson hançer terminalleri her biri, memelilerde saç köklerinin saç folikülünün epiteli etrafında palisades oluştururlar innerveglial / Schwann hücresi arasında sıkışmış terminali 2-4 işler. Terminallerin amacı, çevreleyen kılların mekanik deplasman tespit etmektir. Bunlar hızlı ve yavaş uyum uçları bir karışımıdır, ancak ağırlıklı olarak saç hareketine yanıt olarak faaliyet öbekler üretir. Tipik haliyle, ateş hatta sürekli yer değiştirme varlığında, çok hızlı bir şekilde hareket sona erer durur. Optik yöntemlerle mızrak şeklinde terminalleri çalışmak için bu fare kulak kepçesi modeli bu uçlarının yapısını ve fonksiyonunu çalışmak için birçok avantajlı özelliğe sahiptir. kulak kepçesi cilt baskın olarak iki tabakası arasında, kıkırdak dokusunun sadece küçük bir miktarı ile, arka arkaya yapıştırılır. Cilt nedeniyle vücudun diğer bölgelerine zayıf yapıştırıcı bağ dokusu nazaran az miktarda çok ince ve kolay disseke. Kolayca ayrılan deri katmanları, bu nedenle, köklerinin ve terminallere iyi erişim sağlar. innervasyonkolay erişilebilir ve tanımlanabilir. saç folikülleri daha seyrek köklerinin tek tek veya küçük gruplar görüntüleme kolaylaştırılması, diğer cilt bölgelerinde daha dağıtılır. İnce yatan dermal tabaka o kadar başka bir işleme tabi floresan mikroskobu ile görüntüleme için idealdir, boyalar ve farmakolojik ilaçlara iyi erişilebilirlik verir. fiksasyon ve daha fazla histolojik işlem sonrasında, bir sabitlenebilir boya analog kullanıyorsanız etiketli terminalleri görüntüleme, canlı terminalleri olabilir ya da ya. Bu emme (endositoz) ve stiril piridinyum boya (FM1-43 serbest bırakılması (ekzositozu) ile kanıtlandığı geri kazanım mızrak şeklinde uçları meydana gelir, zarı, göstermek için bu hazırlık kullandık; A ^ - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) piridinyum dibromür). Boya değil, ancak önemli ölçüde yatırım Schwann hücresi 2 süreçleri etiket yok gibi görünüyor. Ayrıca bu boya alımı / serbest olduğunu göstermiştir ve dolayısıyla r zareCycling, bir atipik (fosfolipaz D-bağlı) metabotropik glutamat reseptörü aracılığıyla glutamaterjik modülasyon bağlıdır. Basit uyarıcı ve analiz protokollerinin sonuçları gösterilmektedir ve ortak potansiyel analiz sorunlar da vurgulanır.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td></tr><tr><td>No. 3 Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&amp;amp; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image Analysis Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Image capture and analysis software.</td></tr></tbody></table>

optical monitoring of living nerve terminal labeling in hair follicle lanceolate endings of the ex vivo mouse ear skin

Bir yeni bir diseksiyon ve kayıt tekniği optik izleme boyama ve fare kulak kepçesi derisinde saç köklerinin çevresinde mızrak şeklinde terminalleri de boyaması için tarif edilmektedir. Hazırlık güvenilir yoğun vezikül geri dönüşüm çalışmalarında kullanılan stiril piridinyum boyaların alımını ve serbest çalışmaya sinir terminallerinin yaşayan çok sayıda etiketli birimlerinin geniş bölgeleri verimli, basit ve nispeten hızlı. etiketleme öncesi hazırlıkları subdividing tek bir kişi aynı kulakta kontrol karşılaştırmalar vs testi sağlar. Yararlı ipuçları hazırlanması, etiketleme ve görüntüleme parametrelerinin kalitesini artırmak için verilmiştir. Bu yeni sistem farmakolojik tahlil ve alımı ve her ikisi de vahşi tip mızrak şeklinde terminallerinde vital boyaların ve genetik olarak tadil edilmiş hayvanların serbest mekanik olarak indüklenmiş için uygundur. etiketleme yoğunluğuna düzenleyici etkilerin örnekler verilmiştir.

Bu kulak kepçesi hazırlanmasında saç köklerinin kolayca hazırlık incecik doğasını ve bu mechanosensory terminallerine tanıyor erişilebilirlik göreli kolaylığı gösteren, floresan (Şekil 1A) olmadan transillüminasyon altında görülür. Her yağ bezinin karanlık hilalini delici belirgin saç şaft tabanı verebiliriz. Epifloresans altında, her saç folikülü çevreleyen etiketli hançer terminalleri açıkça görülmektedir ve genellikle sağlam spontan stiril boya alımını (Şekil 1B) göstermektedirler. Bu dayatılan hareketi olmadan oluşur. Kuşatma ölçüde değişken 6 olmasına rağmen hançer terminalleri, saç gövdesine kuşatmak görülmektedir. etiketleme Çok noktalı (lekeler) yerine beklenebilir doğrusal düzenlemedir. noktalı desen terminalleri terminalinin uzunluğu boyunca bir optik düzleme gözlenmektedir yansıtır. Thitarafından hazırlanan sadece bir mikroskop kademesine ve yine bu preparatın basitlik görüntülemektedir situ görüntülenmiştir, etiketleme sonra görünüm için başka bir işlem gördü. Bu yeni hazırlama Şekil 3&#39;te gösterilmektedir uygundur Örnek deneyleri. Endositoz ve eksositoz oturma terminalleri, hem de hafifletilmesinin iki çalışma için kullanılabilir. Böyle 2+ Mg olarak ligandlar veya katyonlarla Ca 2 + kanalları bloke ederken Böylece, endositoz için, glutamat reseptör agonistleri, etiketleme yoğunluğunu artırabilir, Ni 2+ veya Cd 2+ da 2 azaltır. Seçenek olarak ise, bu preparat, aynı zamanda Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi, Ekzositoz kinetiğini incelemek için kullanılabilir. İlk olarak, etiketlenmiş bir terminali kendiliğinden de leke görülmüştür. Bununla birlikte, bu destain latrotoxin, ekzositozu uyarıcı hızlandırılır. Daha deDeney sonuçları kuyrukları, RW ve diğ. 2 banka görülebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig1.jpg" /> Şekil 1. Sağlam Stiril Boya Etiketleme Fare Pinna kaydedildi. Saç folikülleri areolar / yağ dokuları örten temizlenir alanlarda nasıl göründüğünü açıkça gösteren parlak bir alan aydınlatma bir etiketsiz pinna hazırlık (A) kısmı. karanlık, genellikle bilobe, hilal şekilleri merkezi saç gövdesine çevreleyen yağ bezleri vardır. Biraz daha yüksek bir büyütmede (B) Benzer bir alanı ve stiril boya ile işaretlenmiş mızrak şeklinde uçlarını gösteren epifluoresan ile görüntülenmiştir. Ölçek çubuklar -. 40 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &quot;1&quot;&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig2.jpg" /> Stiril Boya Etiketleme Şiddeti Şekil 2. analizi. Saç şaft (bu görüntüde görünmez) merkezli (A) stiril boya ile saç folikülü etiketleme tipik dairesel desen. (B) ana analiz &#39;ilgi bölgesi&#39; (YG) folikülü çevreleyen lanceolate sinir uçlarının palisade pozisyonu üzerine bindirilmiş bir standart anulus ile tanımlanır. Bu ROI etiketleme yoğunluğu oldukça hazırlıkları arasında ve tüm tedaviler arasında mukayese edilebilir sağlamak için tek bir deney için şekil ve bölgede sabit tutulur. Her ROI net yoğunluğu bitişik kare veya yuvarlak arka plan bölge (~ 400 mikron 2) yoğunluğunu çıkarılarak hesaplanır. Yine, bu köşeli arka bölgesi, herhangi bir deney boyunca şekil ve alanı sabit tutulur.target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53855/53855fig3.jpg" /> Saç Folikül Afferent Lanceloate Endings Şekil 3. Etiketleme Yoğunluğu Normalde Dağıtılmış değildir ve endo ve ekzositoz Hem incelemek için kullanılır olabilir. Stiril boya yoğunluğu ölçümleri tipik verileri yukarıda tarif edilen analiz yöntemi kullanarak kendiliğinden etiketli hançer terminallerinde. Kontrol koşulları altında (A) Etiketleme yoğunluğu (54 folikülleri, 4 kulaklar) ve 1 mM glutamat (42 folikülleri, 4 kulak). Bireysel uçlarının yoğunluk değerleri küme nokta araziler olarak görüntülenir. Her nokta bir folikülün etrafında bir terminal palisade yoğunluğunu temsil eder. En düşük yoğunluklarda kümelenmiş ise bile kontrol koşulları altında birkaç veri noktaları (folikül), son derece yoğun olduğunu unutmayın. Belirli INTENS ilk noktaSığ merkezinde çizilir ve aynı yoğunlukta sonraki veri noktaları iki tarafında giderek daha yanal çizilir. Böylece lateral yayılma herhangi bir etiketleme yoğunluğu folikül frekansını temsil eder. yatay çizgiler ortalama ±% 25 çeyrekler aralığı temsil etmektedir. 1 mM glutamat ile Kuluçka% 50 (*** p &lt;0.001, Mann-Whitney) ~ tarafından medyan yoğunluğunu artırır, ancak etiketleme 200 tarafından geliştirilmiş olabilir - bazı terminallerde% 300. (B) glutamat aracılı geliştirilmiş boya alımı (endositoz) gösteren görüntüler. artan markalama yoğunluğu ile gösterildiği gibi glutamat (1 mM) saç folikülü hazırlama inkübasyon belirgin, stiril, boya alımını arttırır. Ölçek çubuğu 20 mikron. (C) Artırılması boya bırakma (ekzositoz). 0 dk etiketleme 60 dk daha açıkça parlak olarak işaretlendikten sonra, stiril boya kendiliğinden photobleaching kontrol etmek için hatta arka plan çıkarma sonra, tekrar serbest bırakılır. Bu sürüm büyük po olduğunulatrotoxin tarafından tentiated, kontrolsüz vezikül ekzositoz tetikleyen bir kara dul örümceği zehri kurucu. toksin 60 dakika sonra, terminal etiketleme neredeyse mümkün değildir. stiril boya etiketleme Bu reversibilite terminali floresan sinaptik benzeri veziküllerin yerel geri dönüşüm sırasında içselleştirilmesi nedeniyle hipotezini desteklemektedir. Ölçek çubuğu 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin at JoVE.com

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

optical-monitoring-living-nerve-terminal-labeling-hair-follicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

7.4K Görüntüleme.  University of Aberdeen. Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Video: Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Nörobilim

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Gelişim Biyolojisi

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of the understanding of their distributional and chemical characteristics comes from conventional histochemical and immunohistochemical staining on thin tissue sections. With the development of the tissue clearing technique, it has become possible to view the cutaneous nerve fibers on thicker tissue sections. The present protocol describes multiple fluorescent staining on tissue sections at a thickness of 300 &#181;m from the plantar and dorsal skin of rat hindfoot, the two typical hairy and glabrous skin sites. Here, the calcitonin gene-related peptide labels the sensory nerve fibers, while phalloidin and lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 label the blood and lymphatic vessels, respectively. Under a confocal microscope, the labeled sensory nerve fibers were followed completely at a longer distance, running in bundles in the deep cutaneous layer and freestyle in the superficial layer. These nerve fibers ran in parallel to or surrounded the blood vessels, and lymphatic vessels formed a three-dimensional (3D) network in the hairy and glabrous skin. The current protocol provides a more effective approach to studying skin innervation than the existing conventional methods from the methodology perspective.

The thickness of tissue sections limited the morphological study of the skin innervation. The present protocol describes a unique tissue clearing technique to visualize cutaneous nerve fibers in thick 300 &#181;m tissue sections under confocal microscopy.

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles

Source: Bewick, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53854">Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labeling in the hair follicles of a mouse pinna. It outlines the steps involved in the mechanical stimulation of hair follicle nerve terminals before and after exposure to a fluorescent membrane dye, electrophysiology recording of the generated action potentials, and visualization of the nerve terminal labeling in the hair follicles.

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Electrophysiological Recording ...

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz Görüntüleme Dağı

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz Görüntüleme Dağı