The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.

Floresan 1. İfade Kültür Hücrelerinin CME Bileşenleri Takip HEK293 hücreleri GPCR&#39;dir biyoloji ve endositozı incelemek için yaygın olarak kullanılan, ve bu nedenle bu protokolde model olarak kullanılan faydalı model hücrelerdir. Aşırı ifadesi ve düşük bir sitotoksisite olmadan homojen bir ifade sağlayan herhangi bir transfeksiyon protokolünü kullanır. <ol><li> Steril bir laminer akış kaputu tüm hücre kültürü taşıyınız. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile Dulbecco&#39;nun Düzeltilmiş Esansiyel Ortamı (DMEM) içinde, 1 ml, 12 oyuklu bir plakanın 4 kuyu doldurun. HEK293 hücrelerinin konfluent T25 şişesi kaynaktan 4 kaynağının her birine, sırasıyla 01:50, 01:25, 01:16, 01:10 seyreltin. <ol><li> Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak, istenilen büyüklükte bir çok-yuvalı plaka hücreleri tohum. Bir 12-yuvalı plaka içine, 2 x 10 4 hücrelerini - 0.4 Tohum. % 5 CO2 ve% 95 nem ile, steril bir 37 ° C, gece boyunca hücrelerin büyümesine. NOT: Bu büyüme r göz önüne alındığındaAteş koşulları ve hücre çizgileri bağlı olarak değişir, bu transfeksiyon için ideal bir ortak akışkanlığa ertesi gün ya da iki kez transfections gerçekleştirme olanağını sağlamak için çok sayıda kuyu tohum tercih olabilir. </li></ol></li><li> Ertesi sabah, bir kuyu ~ Transfeksiyonda% 70 konfluent (Şekil 1B bakınız) seçin. Hayır de bu safhasına ulaştığı takdirde, başka bir gün bekleyin. NOT:% 70 confluency HEK293 hücreleri için idealdir. Hücre ölümü ve toksisite daha seyrek sonuçları hücreleri transfecting. Zayıf ifade aşırı konfluent hücreler transfekte sonuçları. </li><li> Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi (transfeksiyon kiti) AT 60 ul tampon, L&#39;yi kodlayan plasmidin 400 ng GPCR&#39;ler ve / veya klatrin makine bileşenlerini ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine Arttırıcının 2.4 ul etiketlendi. 2 sn Vortex yeterli karışmasını sağlamak ve altındaki sıvıyı toplamak için 2 saniye boyunca 2.000 xg&#39;de mikrofüjde dönmeye. </li><li> EkleÜreticinin protokolünde tarif edildiği gibi 6 ul Effectene. Bir mikrofüjde 2 saniye boyunca 2.000 xg&#39;de 2 sn Vortex, ve spin altındaki sıvıyı toplamak için. Transfeksiyon kompleksi misellerin oluşumu için izin vermek için 20 dakika boyunca bekleyin. </li><li> Kuyudan medya aspire transfekte edilecek. Yavaşça miseller kırma etkisini azaltmak amacıyla, yavaş yavaş transfeksiyon tepkin madde karışımı,% 10 FBS bulunan DMEM, 0.8 ml ilave edilir ve pipetleme karıştırın ve. Taraftan çok yavaş kuyuya medya ve transfeksiyon karışımı ekleyin. Iyi bir mikropipet kullanarak mikrosantrifüj tüpüne kalan transfeksiyon karışımı ekleyin. Not: İsteğe bağlı olarak, hücreler nazik transfeksiyon ve alt geçici ekspresyonu ile sonuçlanan ilave besin vermek üzere transfekte de% 10 FBS&#39;li DMEM&#39;e ilave bir 0.5 ml ilave edilir. </li><li> 5 saat boyunca 37 ° C inkübatör hücreleri dönün. </li><li> Transfeksiyon karışımı ihtiva eden aspire ortam. % 10 FCS içeren DMEM 1 ml ile değiştirin. İzinHücreler gece boyunca büyümeye. </li><li> Ertesi gün, daha önce otoklav ile sterilize kaplanmamış lamelleri, hücreleri geçer. <ol><li> Her bir oyuğa, 1 mM EDTA ile fosfat tamponlu tuz (PBS) 0.5 ml ilave edilir. Seçenek olarak ise,% 0.05 tripsin-EDTA, 0.5 ml kullanılır. 1 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde bırakın. </li><li> 3 yuvarlak bir 6-yuvalı plakanın gözleri içerisine ayrı ayrı steril 25 mm kapak yerleştirin. Ortam, 2 ml Her bir oyuğa doldurun. Yavaşça lamel altındaki hücrelerin gelişimini önlemek için kuyunun dibine kadar lamel itin. </li><li> El kuyunun dibinden hücrelerini kaldırmak için kuyu çalkalayın. % 10 FCS içeren DMEM içinde tekrar süspansiyon 1 mi ekleyin. 3 lamelleri arasında eşit bir 12-yuvalı plakanın 1 kuyusundan kaldırdı hücreleri dağıtın. Alternatif olarak, 3 cam dipli yemekleri hücreleri plaka. </li></ol></li><li> Hücreler, görüntüleme önce en az 48 saat boyunca lamelleri büyümeye izin verin. Hücreler yayılmış ve düz olduğundan emin olun. </li></ol> 2.Görüntüleme ÇKP ve Kargo Dinamikleri kullanma TIRFM <ol><li> Imalatçının protokolüne göre, Alexa Fluor protein etiketleme kiti kullanılarak Alexa boya ile Birleşmiş M1 anti-Flag antikorları yer alır. Seçenek olarak ise, ön-birleştirilmiş antikorlar temin edilebilir. </li><li> (Görüntü 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 50 mM HEPES, pH 7.4 ve% 10 FBS ile% 10 FBS ya da Opti-MEM ile önceden ısıtılır Leibovitz ortamı, 1 ml 1.000 seyreltme: 1 de antikorlar ile önceden inkübe hücrelerin orta), hücre yüzeyi üzerinde FLAG-etiketli GPCR&#39;ler etiketlemek için. GFP gibi genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri, etiketleri olarak kullanılan if (ayrıntılar için bakınız tartışma) bu adımları atlayın. </li><li> Canlı hücre görüntüleme odasına lamel aktarın. Alternatif olarak, cam tabanlı tabaklar, aspirat antikor etiketleme ortam için önceden ısıtılmış görüntüleme ortamının 700 ul ilave edin. <ol><li> Bir çift forseps kullanın ve bir kanca içine 25 gauge iğne ucu bükün. </li><li> Dominant elin forseps bir çift tutun. Oth bükülmüş iğne tutuner. Aşağı doğru cam kanca eğrileri kadar iğne çevirin. Bu lamel üzerine kanca kadar yavaşça 6-plaka alt kısmında, aşağı iğne, kanca yanını sürükleyin. Bu hücreleri ayırmak gibi, lamel yüzeyini çizmeyin özen gösterin. Yavaşça kuyunun dibinden lamel yukarı kaldırın. Destek için kuyunun duvara lamel dengeleyin. </li><li> Lamel kenarına yakın tutun ve görüntüleme odasına lamel, hücre tarafı yukarı taşımak ve odasını monte forseps kullanın. Önceden ısıtılmış görüntüleme ortamının 700 ul (ya da uygun bir miktar) ilave edin. Çatlama veya kırılma önlemek için baskı yapmadan dikkatli lamelleri tutun. </li></ol></li><li> Mikroskop üzerine bölmeyi aktarın ve bir sahne ısıtıcı veya çevrelenmiş bir kuluçka makinesi kullanılarak, 37 ° C&#39;de hücre sıcaklığı tutmak. </li><li> Bir 100X veya 60X TIRF yağ daldırma hedefi (yukarıda 1.45 NA veya) kullanarak odak noktası haline hücreleri getirin. Geleneksel epifluoresan veya con görüntü hücreleraydınlatma (yani TIRFM) odak modları uygun yapılan ifade eden hücreleri belirlemek için. Hücreler yapma TIRF aydınlatma ince derinliği neredeyse görünmez out-of-odak zor odak düzlemi ve hücreleri bulmak için. NOT: Bazı sistemler kritik açı yukarıdaki lazerin geliş açısını taşıyarak, geleneksel epifluoresan görüntü için TIRFM için aynı lazer kullanır. Önemli bir güvenlik önlemi olarak, her zaman lazer ışınının açısının farkında olması ve her zaman gözlemciden uzak yönlendirmek. </li><li> Hücrede plazma zarının ana hatları kaybolur ve hücre merkez görünene kadar, bir ifade hücresinin alt yüzeyinden aşağı Odak. Bu, μ-opioid reseptörü (Şekil 2A) gibi bir plazma membran lokalize kargo protein ile belirgindir. </li><li> TIRF görüntüleme geçin. <ol><li> Geleneksel epifluoresan görüntüleme için aynı lazerler kullanıyorsanız, geliş açısını artırmakHücrenin iç out-of-odak floresan kadar lazer kaybolur ve hücre etrafında plazma zarı hiçbir anahat görülmektedir. (Şekil 2A ve 2B Şekil 2C karşılaştır) Not: TIRFM, odak düzlemi hareket odaklanma ve / veya sönük tamamen dışarı gitmek için görüntü neden olur ve genel floresan seviyeleri, aydınlatma, küçük derinlik nedeniyle azalır. Bu nedenle, bir alternatif yöntem TIRFM aydınlatma geçmek için, sonra plazma zarına odağını sonra floresan kaybederler kadar gelişlerini artırmak ve / geleneksel konfokal epifluoresan hücrenin merkezindeki ilk odak etmektir. </li><li> Bir kez TIRFM yılında, uyarma lazer hedefi üzerinden geri yansıtır ve objektif üzerinde görünür olmadığından emin olun. Lazer nokta görünür ise kontrol ederek bu onaylayın. NOT: Geleneksel epifloresans veya konfokal modlarında, lazer aydınlatma, amacı üzerinde görülebilirtavana gibi. </li><li> Net bir görüntü elde etmek için odak rafine. Endositik makine ana bileşenleri, örneğin klatrin gibi, puncta görünür olacaktır. Ince odağı ayarlayın, böylece punktumlarda mümkün olduğunca yuvarlak gibidir. NOT: filopodia farklı görünür kadar membran lokalize kargo için, ince odağı ayarlayın. </li><li> Bu aynalar ve TIRF açısı gibi tüm görüntüleme parametrelerini kaydetmek için bir toplama programı kullanın. Gerekli tüm dalga boyları için yapın. </li></ol></li><li> İstenen tüm endositik işaretlerini ifade eden hücreleri bulmak için lamel etrafında tarama: μ-opioid reseptörü ve Şekil 3A&#39;da gösterilen örnekte adaptör β-arrestin. Ifade eden fakat aşırı ifade etmeyen hücreleri seçin. Ayrıntılar için tartışma bakın. </li><li> Hücreleri belirlendikten sonra, 10 dakika boyunca her görüntü 3 saniye kazanır. Bu koşullar altında görüntülenmiş HEK293 hücrelerinde bir CCP ortalama ömrü aroA olduğu için bu, bir CCP ömrünü yakalamak için yeterlidirund 40 sn 10-11. Bu ÇKP&#39;nin gözlemlemek için yaklaşık 12-14 kare verir. Örneğin Sinema 1 bkz. Görüntü ek hücreleri tüm adımları tekrarlayın. </li></ol> Manuel Doğrulaması endositik Dynamics 3. Analizi CCP ömürlerinin manuel doğrulama ölçüde tespit edilebilir CCP sayısı ile sınırlı olmasına rağmen, yine de görüntü ve saptama eserler küresel değişimler tarafından engellenmeksizin algılama doğru bir yolu kalır. Ayrıntılar için tartışma bakın. <ol><li> ImageJ dosyasını açın. Görüntüler serpiştirmeli kanalları ile tiff dosyaları tek bir yığın olarak depolanır. Hyperstacks görüntüleri dönüştürün. Hyperstacks&gt; hyperstack Stack&gt; Görüntü git. (Görüntüleme β-arrestin ve μ-opioid reseptör, 2 girerseniz yani) edinilen kanal numarasını girin, (TIRFM bir tek düzlem olan) Z yığını için 1 girin ve filmin kare sayısı (yani 10 dk 1 çerçeve her 3 sn i de filmpop-up pencerede ler 200). </li><li> Hyperstack biçimi iki kaydırma çubukları ile bir pencere verir. Zaman içinde hareket etmek kanalları ve alttan taşımak için üst çubuğunu kullanın. Ömürleri tahlil edilecek proteinin kanalına gidin. </li><li> Tüm süreler görünmez önceden var CCP&#39;lerin dahil azaltmak için 10 veya film 15 kare taşı. Rastgele seçilen bir nokta etrafında bir İB kutusunu çizin. </li><li> Bir nokta görünür kare sayısını. Not: endositik olayların 10,11,16-19 üç morfolojik kategorilerinin örnekleri için Şekil 3B ve 3C. </li></ol> Amaç Tanıma tarafından endositik Dynamics 4. Analizi Amaç tanıma bir hücrede görüntülü CCP hemen hemen tüm ortaya çıkmasına imkan verir, ancak nedeniyle hatalı yapıların sahte tespiti için hata eğilimli olabilir. Avantaj ve e dezavantajlarını tartı Ayrıntılar için tartışma bakınACH yöntemi. Özel olarak oluşturulmuş bir algoritma dahil olmak üzere çeşitli programlar, objektif KDN&#39;ler tespit etmek için kullanılabilmektedir. Bu protokol Imaris, bir görüntü analizi yazılımı (Malzeme) kullanılarak CCP objektif tanıma açıklar. <ol><li> Başlamak için, görüntü analiz yazılımı ham görüntü dosyasını açın. Varsayılan olarak, birleştirilmiş bir renkli görüntü belirir. Bir kanalın parlaklığını ayarlamak için &quot;Ekran Ayarı&quot; penceresini kullanın. Görüntülenen rengini değiştirmek için bir kanal adını tıklayın. Onun görüntülenmesini önlemek için kanalın yanındaki kutunun işaretini kaldırın (Şekil 4A bakınız). </li><li> Turuncu noktalar ile ikonuna tıklayarak &quot;Noktalar&quot; oluşturun. Şekil 4B bakın. Hücrenin etrafında İlgi (ROI) bir bölge seçin. Bkz Şekil 4C. Yanlış parlak önde gelen kenarlarını ve plaketleri algılar alanları hariç tutmak için bir yatırım getirisi kullanın. Ayrı, farklı ekspresyon düzeyleri ile birden hücreleri analiz. </li><li> Yazarlara bir Spot çapını ölçünalgoritması için de ilk tahminler. &quot;Dilim&quot; moduna geçmek ve onun çapını ölçmek için bir nokta kutup uçlarında tıklayın. Şekil 4E bakın. Oluşumundan sonra ve kesiminie önce kendi istikrar yüksekliğinde bir ÇKP göstergesidir bakmak 4 veya 5 adet yuvarlak Lekeler için bunu yapın. Bir mikron yakın onda kadar ortalama bir çapı hesaplamak için bu ölçümlerin. </li><li> Noktalar algılar. &quot;Aşan&quot; moduna geri dönün. Tespiti için uygun kanalı seçin. Genellikle 0.3 veya 0.4 mikron ortalama ölçülmüş çapını girin. Leke ölçmek için mavi ileri oka tıklayın. Şekil 4E bakın. Spot çapı göz ardı edilirse, floresan sahte noktaları Lekeler olarak tespit edilecektir. Çapı çok büyükse, gerçek Noktalar göz ardı edilecektir. Ne zaman emin, biraz daha düşük tahmin ve daha sonra yanlış algılamaların filtre. </li><li> Kalite tarafından Noktalar Filtre. Geri olmadan mümkün olduğunca çok sayıda noktalar yakalamak için filtreyi ayarlayınzemin. Kalite filtre varsayılan 20 olarak seçilir. Şekil 4F bakın. <ol><li> Uygun bir eşik ayarlamak için bir kılavuz olarak &quot;Kalite&quot; eğrisini kullanın. Eğrisinin bu ilk dalış için sol fare tuşu ile filtrenin alt eşiğini taşıyın. Bu pozisyon genellikle sadece görünür Spotlar algılama inceltir gibi bu filtre için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Şekil 4F bakın. </li><li> Algılanan Noktalar küre veya merkez piksel gibi film görünür. &quot;Renkler&quot; sekmesini kullanarak, kolay bunları görmek yapmak için bir zıt renk lekelerin rengini ayarlayın. Her karede Noktalar yorumlayan Filmde ilerlemek. Amaç kendi yaşamların bütünlüğü için mümkün olduğunca çok Noktalar tespit etmektir. </li><li> Sönük Spotlar ortadan kaldırın veya elle onların yaşamların kurs boyunca iyi tespit değil gibi, daha sonra sürekli parça içine bağlamak. </li><li> Bir &quot;Yoğunluk&quot; fil ile parlak plaklar kaldırter, gerekirse. Yeni bir filtre eklemek için yeşil artı işaretine tıklayın. Şekil 4F bakın. Veya belirli bir floresan sinyalleri Noktaları filtrelemek için Yoğunluk filtre oluşturun. Eşiğini ayarlamak için (4,5 tartışılan Kalite Curve benzer) oluşturulan Yoğunluk eğrisi kullanın. Parlak Spotlar temsil eğrinin aşırı sol ucunu kaldırmak için sol fare düğmesini kullanın. NOT: Büyük plak yapıları hücrede parlak unsurları arasında genellikle, onlar kolayca bu filtre ile dışlanır. </li><li> CCPs Spots olarak algılanır ve parlak plaklar artık tespit sağlamak için film boyunca ilerleyin. Şekil 3D CCP&#39;lerin algılama (beyaz küre ile gösterilen) bir hücreyi kaliteli filtre ile optimize edilmiş ve plaklar kalitesi ile dışlandı gösterir filtre. </li><li> Kaliteli filtre ile parlak hücre kenarları azaltın. Parlak nesneler hala bir sonraki adımda, elle kaldırılması gerekebilir. Mavi ile devamok. </li><li> Düzenleme Spotlar ekranda anormal Noktalar çıkarın. Modunu &quot;Seç&quot; geçin. Yerinde tıklayın. Bu sarıya dönecektir. &quot;Sil&quot; tıklayın. Algoritması oluşturmaya devam etmek için mavi oka tıklayın. Şekil 4G bakın. </li></ol></li><li> Tedbir izler. &quot;Brown hareketi.&quot; ÇKP herhangi yönettiği hareketi, plazma zarından sadece minimal sürükleyen sergilemek olmamalı şarkıları ayarlayın. Bu algoritma bu hareket için en uygun. Şekil 4H bakın. <ol><li> 0.7 mikron gibi küçük bir değere Max Uzaklık ayarlayın. Şekil 4H bakın. NOT: Küçük bir mesafe ayarlama bitişik Spot bağlantısını en aza indirir ve hala ÇKP veya hücre hareketi ile bir hücre nokta sürekli izleme sağlar. </li><li> Bu arda eksik olan tek kare varsa devam etmek için bir parça verir 1. Max Gap Boyut ayarlayın. Parçaları hesaplamak için mavi oka tıklayın. Şekil 4H bakın. NOT: Gen fazla 3 nedenleri farklı pistlerde ap boyutları yanlış birbirine bağlantılı olması. </li><li> Inceleyen Anahtarı parça &quot;Dragon Tail.&quot; Ilerleyin algılama kalitesini gözlemleyerek film boyunca. Bitişik noktalar bağlanmıştır ise, 0,7 um altında En mesafe azalır. Noktalar çok kolaylıkla kırılmış yapılıyorsa, Max Gap Boyutu artırmak. Parçaları oluşturmak için mavi oka tıklayın. Bu filtre parçaları ekranına götürür. Şekil 4H bakın. </li></ol></li><li> Filtre Parçalar ve İhracat Verileri. Ek parlak plaklar kaldırmak için &quot;Şiddeti&quot; filtre kullanın. TIRF alanına girmek endozomları kaldırmak için bir &quot;Deplasman&quot; filtre kullanın. Uzun Noktalar hem de daha uzun deplasmanları olacak gibi, dikkatli olun. Protokolü tamamlamak için yeşil çift oku tıklatın. Şekil 4I bakın. <ol><li> Filtrelerle olamazdı Tracks yanlış pozitif algılamalarını kaldırmak için, kalem simgesiyle, Düzen Parçalar sekmesini kullanın. Durdurulan kontrol edininuities veya yanlış bağlantıları. Iki parça bağlamak için, sonra da Düzen Parçalar kutusuna &quot;Bağlan&quot; üzerine tıklayın, Ctrl-Sol-Click kullanarak onları seçin. Ayrı noktalar halinde parçalarını kesmek için, bir parça seçin ve &quot;Bağlantıyı kes&quot; çarptı. Ile birden Spotlar seçin Ctrl + Sol-tıklayın ve yeni bir Parça oluşturmak için &quot;Bağlan&quot; butonuna tıklayınız. Yöntem 4.5.7 anlatılan Düzenleme noktaları için aynıdır. Şekil 4J bakın. </li><li> Veri aktarmak için, istatistik sekmesine gidin. Seçilen istatistik ihracat tek disket ikonuna tıklayın. Tüm istatistikleri ihracat disket bir dizi gibi görünüyor simgesine tıklayın. &quot;Parça Süre&quot; istatistiği endositik parça uzunluğunu içerir. Şekil 4K bakın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li><li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery.">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li><li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis.">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li><li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+units+of+clathrin+coats.">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li><li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic.">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li><li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding.">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li><li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination,+Cortactin+Recruitment,+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells.">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li><li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence.">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li><li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor.">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li><li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics.">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li><li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics.">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li><li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li><li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits.">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li><li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation.">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li><li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits.">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li><li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits.">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li><li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis.">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li><li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis.">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li><li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells.">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li><li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification.">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques.">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li><li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway.">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li><li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion.">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li><li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin,+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics.">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li><li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint.">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li><li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+of+caveolae+during+mitosis.">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li><li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea:+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation.">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li><li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type.">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, gerçek zamanlı olarak canlı hücreler bireysel CCP düzeyinde klatrin aracılı endositoz (STE) görselleştirmek için TIRFM kullanımını tarif eder. CME birçok mekansal ve zamansal ayrı münferit olayların kümülatif etkinin aracılığı hızlı ve son derece dinamik bir olaydır. Bu içselleştirme biyokimyasal ölçümleri olarak şu anda kullanılan çoğu deneyleri, yüzey biyotinilasyonunu veya bağlayıcı ligandı, akış sitometri veya içselleştirilmiş proteinler, ya da proteinlerin elektr...

Klatrin aracılı endositoz (STE) gibi bir işlem vezikülleri içine 1-3 kargo toplamak ve plazma membranını işlemek için klatrin aracılı endositik makine birçok bileşenden iyi zamanlanmış girişte bağlıdır. CME endositozun 1 doğmakta sitelerinde bir araya gelip zar deforme ve kargo-adaptör proteinler tarafından başlatılır. Bu proteinler, klatrin kaplı çukur (CCP) 4 meydana getiren bir kafes benzeri bir yapı halinde birleşmektedir örtü proteini klatrin, işe. CCP tamamen esas olarak büyük GTPaz, Dynamin etki ile küresel şekil, membran kesimleri, içine monte edildiğinde, serbest klatrin kaplı vezikülleri (CCVS 5,6) oluşturur. Bu içselleştirme bileşenleri CME sanmı için yeniden kullanılmasına izin, klatrin kat hızlı sökme tetikler. CME katılan proteinlerin keşfi ve karakterizasyonu geleneksel Bioch köklü olmuşturemical, genetik ve mikroskopi teknikleri 4-6,8. Bu deneyler, bu endositik bileşenlerin rolleri ve etkileşim noktaları aydınlatmıştır. Ticareti makine temel bileşenleri tanımlamak için yararlı olmakla birlikte, bu deneyler, yüksek STE bileşenleri veya yük konsantrasyon dinamik davranışını yakalama sınırlıdır. CME tanımlanan adımda protein modüllerin setleri koreografisini meclisi tarafından tahrik edilir çünkü bu, kritik bir sınırlama olduğunu ve bireysel endositik olayların dinamikleri küçük değişiklikler endositoz ile ilgili geniş bir kümülatif sonuçlar doğurabilir beri. Bundan başka, son veriler, ayrı ayrı KDN bu sürecin fizyolojik düzenleme yüksek uzamsal ve zamansal olarak kısıtlı 9-14 düşündüren, bileşim içinde ve davranış bakımından farklılık olabileceğini göstermektedir. Bireysel endositik olayları görselleştirmek, bu nedenle, CME katılan bir çok gereksiz proteinler ve nasıl bu proteinler kontrol edilebilir b var neden anlamak esastıry fizyolojik sinyaller kargo içselleşmesini düzenler. Burada canlı hücrelerin içindeki bireysel CCP dinamiklerinin düzeyinde CME gözlemlemek için Toplam İç Yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) kullanımını tarif etmektedir. TIRFM cam lamel ve hücrelerin 15,16 sıvı ortam arasındaki kırılma indeksi arasındaki farka dayanır. Uyarım ışığı önemli açıdan daha hücrelere doğru yönlendirilir, bu dahili lamel yaklaşık 100 nm olarak uzanan bir aydınlatma alanını koruyan ince bir genliği azalan bir dalga oluşturulması, yansıtılır. Bu, bu dar alan içinde sadece floresan moleküller heyecanlı olmasını sağlar. Pratik olarak bu ya da plazma zarının yakın fluoresan moleküller uyarılmasını sağlar ve hücrenin iç kısımlarından floresans en aza indirir. Bu plazma zarı, co olayları görselleştirmek için önemli ölçüde daha yüksek sinyal-gürültü oranı ve z ekseni çözünürlüğü sağlarBu tür geleneksel epifluoresan veya konfokal floresan mikroskopisi gibi daha yaygın kullanılan modlara mpared. Biz de bir tanıtıcı ve pratik düzeyde tanımlamak, yaygın olarak kullanılan bir görüntü analizi platformunun kullanımı analiz ve basit morfolojik özellikleri ve bireysel kargo endositik olayların dinamiklerini ölçmek için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="909">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:207px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SH3024301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">EDTA Free Acid</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:157px;">0322-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:180px;">CellPURE by Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP2937-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Effectene&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:157px;">301425</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">25 millimeter coverglass</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-545-86&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Corning cell culture treated flasks, 25cm2</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10-126-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Cell culture 6-well plate</td>
			<td style="width:180px;">Greiner Bio-One, by VWR</td>
			<td>82050-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Monoclonal ANTI-FLAG M1</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F3040-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7384-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:180px;">NIH</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Imaris Image analysis software</td>
			<td style="width:180px;">BitPLane</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>For adjusting angle of incidence</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">iXon+ EMCCD camera and adapters</td>
			<td style="width:180px;">Andor</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing clathrin-mediated endocytosis of g protein-coupled receptors at single-event resolution via tirf microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Kullanarak canlı hücre TIRF Mikroskopi biz μ-opioid reseptörün (MOR) endositik dinamikleri kaydettik, G-protein kenetli reseptör (GPCR) ve endositik adaptör protein β-arrestin. Β-arrestin yapı geçici olarak Şekil 1 &#39;de belirtilen protokol kullanılarak, sabit bir şekilde ifade eden MOR hücre hattına transfekte edilmiştir ve 96 saat sonra görüntülenmiştir. Stabil hücre boyunda m ya da N-terminal bir pH-duyarlı GFP ile etiketlenir. Bu floresan protein yalnızca nötr dışı sıv...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

80.1K Görüntüleme.  Carnegie Mellon University. Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process. 

Video: Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Biyoloji

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

G Protein-Coupled reseptörleri Agonist Aktivitesi miktarının

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...