The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.

1.. Numune Hazırlama <ol><li> Lamel temizleme NOT: Bir davlumbaz altında çalışın. <ol><li> Bireysel lamelleri ayıran bir lamel tutucu içine cam lamelleri (24 mm çap) yerleştirmek için temiz cımbız kullanın. </li><li> Bir beher içine lamelleri ile tutucu koyun ve lamelleri kaplıdır kadar kloroform ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir banyo sonikatörü içinde buharlaştırma ve sonikasyon azaltmak için alüminyum folyo ile beher örtün. Beher dışına lamel tutucu alın ve lamelleri kurumaya bırakın. </li><li> Yerine kloroform içinde 5 M NaOH çözeltisi ile adımı 1.1.2 tekrarlayın. </li><li> Yeni bir behere lamel tutucu alın ve damıtılmış su ile üç kez yıkayın. % 100 etanol ile dolu bir cam hücre kültürü plakasında lamelleri temizlenmiş koyun. </li></ol></li><li> Kalibrasyon örneklerinin hazırlanması <ol><li> Uygun bir çözücü içinde floresan boya çözülür. </li><li> Arasında değişen floresan bir boya 01:10 seri seyreltme hazırlanması13:00 1 nM&#39;ye filtre (0.22 um) steril su. </li><li> % 100 etanol içinde saklanan temizlenmiş lamelleri ayırın ve filtre ile sterilize edilmiş su ile yıkayın. Ayrı bir temizlenmiş lamel floresan için seyreltme Noktası 20 ul. Lamelleri steril bir başlık altında kurumaya bırakın. Kullanıma kadar ışık ve tozdan lamelleri koruyun. Tek flüoresan moleküllerinin yoğunluğunu (adım 3) tahmin etmek için, bu örnekler kullanın. </li></ol></li><li> Transfection <ol><li> 1:01 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı / besleyici karışımı içinde kültür CHO hücreleri, F-12,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 37 ° C&#39;de 100 ug / ml streptomisin, in takviye (DMEM/F12) .% 5 CO2 Not: otoflüoresanı en aza indirmek için deney boyunca fenol kırmızısız ortamını kullanın. </li><li> ,% 100 etanol çözeltisi temizlenmiş lamelleri al steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın ve bir 6 yuvalı hücre kültürü pl her oyuğuna bir lamelyedik. </li><li> Trypsinize, sayısı ve 3 x 10 5 hücre / göz lamelleri içeren 6 oyuklu hücre kültürü plakasının içindeki bir yoğunlukta tohum CHO hücreleri. Hücrelerin yaklaşık elde etmek için 24 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2), bir kuluçka makinesi içinde büyümesine izin. Transfeksiyon için en uygun hücre yoğunluğu% 80 kaynaşma. </li><li> Her bir için, (örneğin,., 2-adrenerjik reseptörü β SNAP-etiketli) Arzu edilen plazmid DNA 2 ug seyreltilmiş ve 500 ul Optimem ortamı ihtiva eden iki ayrı tüplerde 6 ul Lipofektamin 2000. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Tek bir tüp içine adım 1.3.4 arasındaki çözüm birleştirin ve bir transfeksiyon karışım elde etmek için karıştırılır. 20 dakika boyunca, oda sıcaklığında, transfeksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> İnkübasyonun (1.3.5) &#39;sırasında, CHO hücreleri almak ve önceden ısıtılmış (37 ° C) iki kez PBS ile yıkayın. 1 ml /% 10 FBS ile desteklenmiş fenol kırmızısı içermeyen DMEM/F12 ortamında oyuk ama hiçbir antibiyotik ile PBS değiştirin. </li><li> Tüm transfekte eklemeKarışım, yavaşça iyon de her adım 1.3.5 damla damla dan (1 mi), ve tam karışmasını sağlamak için ileri ve geri plakayı sallayın. </li><li> % 5 CO2 içinde, 37 ° C&#39;de 2-4 saat süreyle inkübe edin ve bir sonraki adım için daha sonra hemen devam Not:. Transfeksiyon Bu koşullar için uygun olan tek reseptör yoğunlukları &lt;0.45 partikül / 2 um, elde etmek için optimize edilmiş molekül görüntüleme. Farklı hücreler, yapıları veya reaktifler kullanırken ayarlamaları gerekli olabilir. </li></ol></li><li> Protein etiketleme <ol><li> 1 uM&#39;lik nihai konsantrasyon elde etmek üzere,% 10 FBS ile takviye edilmiş 1 ml DMEM/F12 ortamı içinde fluorofor BG stok çözeltisinden 1 ul seyreltin. Inkübatör transfekte edilmiş hücrelerin almak ve önceden ısıtılmış (37 ° C) iki kez PBS ile yıkayın. 1 uM fluorofor BG çözeltisi, 1 ml PBS ile değiştirin ve bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C,% 5 CO2 &#39;de 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücreler üç yıkama% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM/F12 ortamı ile, bir kez, her seferinde 37 ° C de 5 dakika inkübasyon ile takip Cımbız ile (etiketli hücreler) bir lamel alın ve bir görüntüleme odasına yerleştirin. </li><li> 300 ul görüntüleme tamponu ile iki kere yıkayın. Taze görüntüleme tampon 300 ul ekleyin ve görüntüleme (Part 2) hemen geçin. </li></ol></li></ol> 2.. Image Acquisition NOT: toplam iç yansıma floresan bir yağ daldırma yüksek sayısal açıklık objektif (. Örneğin, 100x magnification/1.46 sayısal diyafram), uygun lazerler (örn., 405 nm, 488 nm, 561 nm ve 645 ile donatılmış (TIRF) mikroskop kullanın nm diyod lazerleri), bir elektron çarparak şarj akuplaj düzenli (EMCCD) kamera, bir kuluçka makinesi ve bir floresan moleküller görselleştirmek için bir sıcaklık kontrolü. <ol><li> İstenilen mikroskop parametreleri, yani ayarlayın., Lazer çizgi, TIRF açısı (bu parametre İçeri nüfuz kontrolfani alan tion derinliği), pozlama süresi, kare hızı ve film başına 10 görüntü sayısı. Sıcaklık sürükleniyor ve nem yoğunlaşmasını önlemek için her zaman ısıtıcı / inkübatör ve sıcaklık kontrol altında tutun. </li><li> Mikroskop 100X objektif daldırma bir damla yağ koyun. Mikroskop numune tutucu üzerine etiketli hücreleri ile görüntüleme odasına yerleştirin ve aydınlık aydınlatma kullanarak odak hücreleri getirmek. </li><li> TIRF aydınlatma geçin. Ama aynı zamanda da arzu edilen bir hücre için aramaya photobleaching en aza indirmek izin vermek için mümkün olduğu kadar düşük bir lazer gücü tutun. </li><li> İstediğiniz hücreyi seçin ve ince odak ayarı. Tek Flüoroforlann görselleştirme sağlayan bir seviyeye lazer gücünü ayarlayın. Görüntü dizisi kazanmak ve. Tiff gibi ham görüntü sırası dosyasını kaydedin. </li></ol> 3.. Kalibrasyon (Cam ve moleküllü / dimerik Reseptör Kontroller Tek Flüoroforlar) <ol><li> Her kalibrasyon sampl birleştirinGörüntüleme odası içinde 1.2 &#39;de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır e. Mikroskop her örnek koyun ve tek aşamalı bir NOT ağartma iyi ayrılmış kırınım sınırlı noktalar içeren örnek tercih:. Bu lekeler flüoresan boya tek moleküller temsil eder. </li><li> Adım 2 de tarif edildiği gibi TIRF görüntü dizilerini elde edin Önemli:. Aynı görüntüleme parametreleri kalibrasyon için olanlar dahil olmak üzere tüm deneyler için kullanılmalıdır. </li><li> 4.2 - algılama ve 4.1 ayrıntılı olarak izleme analizi yapın. 4.2.6 tarif edildiği gibi her bir parçacık yoğunluğunu ekstrakte edin. Bu verilerden, ortalama (μ) ve tek florofor yoğunluğunun standart sapması (σ) hesaplar. </li><li> İsteğe bağlı: tek moleküllü bir hücre yüzeyi reseptörüne (. Örneğin, CD86) ile transfekte edilmiş hücreler üzerinde aynı analizi, N-terminal olarak SNAP 10 arasında bir ya da iki kopya ile etiketlendi ve fluorofor BG türevi ile etiketlenir. FolloCam üzerinde tek bir florofor için yukarıda tarif edilen prosedüre w. Calebiro, D. ve diğerleri de tarif edildiği gibi etiketleme verimliliği tahmin. 10 </li></ol> 4.. Görüntü Analizi <ol><li> Görüntü dizisi hazırlama <ol><li> Görüntü kırpma bir görüntü işleme yazılımı (örneğin., ImageJ) kullanın. </li><li> Ayrı olarak tek kare kaydedin. Tiff görüntüleri yeni bir klasöre, her görüntünün kare sayısı üzerinde göstermektedir. </li><li> Bir hücrenin konturu boyunca ilgi (ROI) bir bölge çizim ve ImageJ ölçü aleti veya başka bir yazılıma benzer bir aracı kullanarak hücre yüzey alanını ölçün. Hücre yüzeyi alanı ile filmin başında parçacıkların toplam sayısına bölünmesiyle parçacık yoğunluğunu hesaplamak için bu değeri kullanın. </li></ol></li><li> Parçacık algılama ve izleme NOT: Matlab çalışma, bu tür u-track 13 gibi ticari olmayan yazılımı kullanınotomatik olarak algılar ve tek reseptör partikülleri izlemek için ortam. NOT: U-track algoritması çoklu hipotez izleme yaklaşıma dayanmaktadır. Bu yaklaşım, bir çerçeve içinde verilen bir parçacık, bir sonraki çerçeve içinde verilen bir parçacığa karşılık görünür, kaybolur ya da / diğer parçacıklardan / ile böler birleşir bireysel olasılıklar atanır maliyet matrisleri, bina çerçeveler arasında parçacıkları bağlar. Global olarak masrafları en aza indirir Çözelti, yani. En yüksek olasılık ile bir, son olarak seçilir. Bu aynı zamanda bir geçici yok parçacık, florofor yanıp sönen neden olduğu tipik fenomen izleme sağlar. U-track (2.1.0) en son sürümü bu analizlerin yürütülmesini kolaylaştırmak grafik kullanıcı arayüzü vardır. <ol><li> Film seçimi arayüzünü açmak için Matlab komut isteminden &quot;movieSelectorGUI&quot;. Bir oluşturmak için yönergeleri izleyinÖnceden kaydedilen görüntülerin ayrı itibaren yeni bir film veritabanı (4.1.2 bakınız). </li><li> Parçacık tespiti ve takibi için gerekli piksel boyutunu nm, saniye zaman aralığı, sayısal açıklık, kamera bit derinliği ve floroforun emisyon dalga boyu, sağlayın. Film veritabanına kaydetmek. </li><li> Film seçimi arayüzü, nesnelerin türü olarak &quot;tek-parçacıklar&quot; seçerek, analizi çalıştırın. Parçacık algılama ve izleme için kullanılan parametreler tanımlanabilir yeni bir pencere açılacaktır. Varsayılan parametreleri ile başlayın. . Algılama ve / veya izleme kalitesi İsteğe bağlı (örneğin, bazı parçacıklar tespit veya parça parçalanmış olan değildir) tatmin edici değilse, daha sonra, bu parametreleri ayarlamak: izleme ayarları altında, saklamak &quot;matris formatında İhracat izleme sonuçlarını&quot; kontrol &quot;trackedFeaturedInfo adlı tek bir matris (alanına koordinatlar ve tüm parçacıkların genlikleri&quot;). Bu parametrelerin ayrıntılı bilgi için, u-parça belgelerine bakın. </li><li> Algılama algoritması çalıştırın. Bu algoritma otomatik olarak her kırınım-sınırlı yerinde yerel yoğunluk maksimanın etrafında mikroskop nokta dağılım fonksiyonu eşit standart sapma ile iki boyutlu bir Gauss fonksiyonu takarak (yani., Tek reseptörler / reseptör kompleksleri) arka planı üzerinde yerini ve yoğunluğunu belirlemek . Daha sonra, izleme algoritması çalıştırın. A. Mat dosyası analizlerin sonuçlarını saklayın. </li><li> Parçaları görselleştirmek ve algılama ve izleme kalitesini kontrol etmek için u-parça paketin içerdiği &quot;movieViewer&quot; rutin, veya benzer özel olanları kullanın. </li><li> Her karede izlenen parçacıkların konumunu ve genliği (yani., Yoğunluk) görmek için. Mat dosyasını açın. Adım 4.2.4 üretilen veriler tracksFinal AR&#39;nin tracksCoordAmpCG alan içinde bulundurulurray ve / veya trackedFeaturedInfo içinde. Parçacıkların toplam sayısından 4.1.3 ölçülen hücre yüzey alanı ile bu değer ikiye bölen parçacık yoğunluğunu hesaplamak tespit edildi. </li><li> İsteğe bağlı: parçacık reseptör parçacıkların hareketini analiz etmek için (4.2.6 bakınız) zamanla koordinatları kullanın. Matlab ve benzer yazılımı kullanarak ortalama kare yer değiştirmeleri (MSD) ve difüzyon katsayıları (D) hesaplayın. Her parçacık ve her zaman aralığı (Δ t) için düşünülen, aşağıdaki formül kullanılarak ortalama kare yer değiştirmesini (MSD) hesaplamak: <img align="middle" alt="Denklem 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> Δ t dilimlerinde zaman aralığı olduğu yerde, N analiz adımların sayısını, x ve y, parçacığın x ve y indeksi ile gösterilen karede koordinatları bulunmaktadır. Doğrusal ilişkileri: belirli bir parçacığın hareket türünü değerlendirmek için zaman alanı üzerinde MSD kullanınserbest difüzyon (yani., Brown hareketi), olumlu bir eğrilik gösterir (yani., eğri bir parabol gibi görünüyor) yönettiği hareketi göstermektedir, negatif eğrilik sınırlı hareket 14 göstergesidir. Serbestçe difüzyon parçacık halinde, aşağıdaki denklemle elde edilen MSD verileri uydurularak her parçacığın difüzyon katsayısı (D) hesaplayınız: <img align="middle" alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Gaussian montaj yöntemi ile partikül boyutunun hesaplanması Not: kalibrasyon numuneleri (cam ve / veya floresan etiketli monomerik reseptörleri üzerinde bir flüorofor) yoğunluğu dağılımı bilindiği zaman, reseptör komplekslerinin boyutunu belirlemek için bir görüntü dizisinin başında tanecik yoğunluklarının dağılımı üzerinde karışık bir Gauss uyum gerçekleştirmek (yani., parçacık başına reseptörlerin sayısı) 10. Matlab veya s kullanarak bu analizleri yapmakimilar yazılım. <ol><li> Yoğunluğundaki ilk değişiklik (nedeniyle, ışıkla ağartma çoğu durumda bir düşüş) oluşmadan önce üst kısmın çerçeveye göre birinci çerçeveden parçacığın yoğunluğu ortalaması alınarak her bir parçacık yoğunluğunu hesaplar. </li><li> Aşağıdaki denkleme göre karma Gauss montaj yapın: <img align="middle" alt="Denklem 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> φ (i) parçacıkları i yoğunluğu olan frekans, n bileşen sayısını, n α bileşen n yüksekliğine katkıda bulunan bir parametre olduğu, μ ve σ ortalama ve referans bir florofor yoğunluğunun standart sapma . (Adım 3&#39;te tarif edildiği gibi hesaplanmıştır) Not: t belirlemebir F-testi ile değerlendirildiği gibi o kademeli bir bileşenin ilave edilmesine kadar n maksimum arttırarak her bir görüntü dizisi için bileşenler (n max) en yüksek sayısı artık, istatistiksel olarak daha iyi uygun üretir. </li><li> İsteğe bağlı: (. Örneğin, 400 çerçeve dizisinin son 60 kare) filmin son kare elde yoğunluk dağılımı üzerinde bir karma Gauss uyum gerçekleştirin. Bu parametreler için rafine tahminleri sağlamak bu uydurma sonra elde edilen değerler, ve tekrar adım 4.3.2 ile μ ve σ değiştirin. </li><li> Karışık Gauss uyum her bir bileşeninin, eğri (AUC) altındaki alanı hesaplanır. Farklı boyut tüm dağıtım EAA ile her bir bileşenin AUC değerine bölünmesiyle (örneğin, monomer, dimer, trimer, vb) reseptör parçacıkların görece bolluk hesaplayın. </li><li>İsteğe bağlı: farklı hücreler ve farklı partikül büyüklüğü dağılımı parçacık yoğunluğu 10 ile ilişkilidir araziler oluşturmak için (4.2.6 açıklandığı gibi hesaplanan) karşılık gelen tanecik yoğunluklarının ikinci kullanımlar verileri. </li></ol></li><li> Aşaması uygun bir yöntem ile partikül boyutunun hesaplanması NOT: reseptör komplekslerinin 10 boyutunu belirlemek için alternatif bir yöntem olarak bir adım oturan analizini kullanın. N florofor içeren, böylece parçacıklar kademeli ağartıcı n adımlarla bir yoğunluk profili üreten beklenmektedir - Bu analiz için temel olan anlık kaybolması tek bir florofor sonuç ışık kaynaklı yıkımı (ışıkla ağartma) olmasıdır. <ol><li> U-parça veya benzer algılama / izleme yazılımı (4.2.6 bakınız) tarafından oluşturulan. Mat dosyasından her parçacığın yoğunluğu profillerini ayıklayın. </li><li> Bu tür bir yer olarak, adım uydurma algoritması kullanarakref. 10, her bir parçacık için ağartma basamaklarının sayısını saymak için. </li><li> İsteğe bağlı (4.3 &#39;e bakınız), farklı boyutta reseptör parçacıkların görece bolluğu gösteren dağılımları oluşturmak ve daha önce karışık Gauss fitingin sonuçları için tarif edildiği gibi parçacık yoğunluğu ile ilişkili sonuçları kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization:+an+emerging+concept+for+G+protein-coupled+receptor+ontogeny+and+function.">Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).</li><li>Ferr&#233;, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+new+conceptual+framework+for+receptor+heteromers.">Building a new conceptual framework for receptor heteromers.</a> Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).</li><li>Milligan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+hetero-dimerization:+contribution+to+pharmacology+and+function.">protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function.</a> Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).</li><li>Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+in+GPCR+mobility+and+signaling.">Dimerization in GPCR mobility and signaling.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).</li><li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins.">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nat Methods. 4, 319-321 (2007).</li><li>Triller, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+synaptic+biology+derived+from+single-molecule+imaging.">New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging.</a> Neuron. 59, 359-374 (2008).</li><li>Hern, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+dissociation+of+M1+muscarinic+receptor+dimers+seen+by+total+internal+reflection+fluorescence+imaging+of+single+molecules.">Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).</li><li>Kasai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+characterization+of+GPCR+monomer-dimer+dynamic+equilibrium+by+single+molecule+imaging.">Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging.</a> J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells.">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chem Biol. 15, 128-136 (2008).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Açıklanan protokol, tek molekül düzeyinde mekansal, hareket ve hücre yüzeyi reseptör komplekslerinin boyut analizi sağlar. Floresan proteinlerin kullanımı ile karşılaştırıldığında, daha parlak ve daha ışığa karşı olan küçük organik florofor ile etiketleme, tek reseptör parçacıkların genişletilmiş görselleştirme işlemini ifa etmesi avantajına sahiptir. Son derece düşük ekspresyon düzeyi elde edildiği (&lt;0.45 reseptör parçacıkları / um 2), reseptörler ve diğer z...

Hücre yüzeyi üzerinde bulunan reseptörler hücre dışı ortamı algılar ve bu tür koku maddeleri, iyonlar küçük, nörotransmiterler ve büyük protein hormonları olarak uyaranlara, çeşitli yanıt. Hücresel zarların akışkan doğası, reseptörler ve diğer membran proteinleri hareketlerini sağlar. Bu protein kompleksleri ve bu gibi fonksiyonel birimleri içine monte ve hücre içine sinyalleri nakletmek için reseptörler tarafından kullanılan gibi geçici protein-protein etkileşimleri, oluşumu oluşumu için gereklidir. Örneğin, hücre yüzey reseptörlerinin 1 en büyük ailesini oluşturan G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler), sinyal transdüksiyon ince ayarlı düzenleme dahil olmak üzere görünür ve di-/oligomers oluşturmak üzere önerilmiştir önemli fizyolojik ve farmakolojik sonucu 2-5 olabilir. Tek molekül mikroskopi doğrudan yüksek spatiotemp ile görselleştirme büyük bir potansiyele sahipOral çözünürlük ilişkisi de dahil olmak üzere canlı hücrelerin yüzeyinde yer alan ayrı ayrı reseptörler dinamik davranışı dimerler ve yüksek dereceli moleküler kompleksleri oluşturmak için 6-10. Bu genellikle moleküllerin binlerce veya milyonlarca ortalama davranışını rapor standart biyokimyasal ve mikroskopi yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajlar sunmaktadır. Yeterince parlak ve ışığa floroforuyla Protein etiketleme tek-molekül mikroskopi için esastır. Bu protokol, kovalent olarak hücre yüzeyi reseptörlerine küçük ve parlak bir organik florofor takmak için son zamanlarda ortaya SNAP etiketi 11 yararlanır. SNAP dönüşümsüz flüoroforla konjuge benzilguanin (flüoroforla-BG) türevleri ile etiketlenmiş olabilir insan DNA onarım enzimi O 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, türetilen bir 20 kD protein etikettir. CLIP, SNAP türetilen bir başka mühendislik etiket yerine, florofor-c ile etiketlenebilironjugated benzylcytosine türevleri 12. Bu yazıda bildirilen protokol transfect ve etiket küçük organik floroforlar ile 11 reseptörlerini SNAP-etiketli ve canlı hücrelerin 10 yüzeyinde tek reseptörler veya reseptör kompleksleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi için nasıl kullanılacağı açıklanır. Bir hücre dışında SNAP-etiketli hücre yüzey proteininin 10&gt;% 90 verim, en etiketleme bildirilen protokol ile sonuçlanır. Reseptör komplekslerinin boyut ve hareketlilik analiz etmek için, hem de geçici reseptör-reseptör etkileşimlerinin yakalamak için tek molekül verilerin kullanımı ile ilgili daha fazla bilgi sağlanır. Tüm protokolünün şematik bir iş akışı, Şekil 1 &#39;de verilmiştir. Bir örnek olarak, Çin Hamsteri Yumurtalık SNAP-etiketli G-protein-bağlanmış reseptörler (GPCR&#39;ler) ile (CHO) hücrelerinin transfeksiyonu gibi bir florofor BG türevi ile etiketleme ve ardından iyi uygulama quantif olaraky ve monitör reseptör di-/oligomerization açıklanmıştır. Bu protokol, diğer hücre yüzey proteinleri ve floresan etiketler (örneğin,., CLIP), hem de diğer transfeksiyon ve etiketleme yöntemleri için uzatılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:259px;">Chloroform</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1585</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">NaOH</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: strong base and highly corrosive reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">32205</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:115px;">111640</td>
			<td style="width:261px;">24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.2 mm sterile filter</td>
			<td style="width:248px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:115px;">83.1826.001</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CHO cells</td>
			<td style="width:248px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:115px;">ATCC CCL-61</td>
			<td style="width:261px;">Chinese hamster ovary cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well cell culture plare</td>
			<td style="width:248px;">Nunc</td>
			<td style="width:115px;">140675</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:248px;">GIBCO, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11039-021</td>
			<td style="width:261px;">Phenol-red free medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Biochrom</td>
			<td style="width:115px;">S 0115</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin - streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P06-07 100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P10-23100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11668-019</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">31985-047</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorophore-conjugated benzylguanine&#160;</td>
			<td style="width:248px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:115px;">S9136S</td>
			<td style="width:261px;">SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMSO</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1584</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:259px;">Imaging buffer:</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; NaCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1371</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; KCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3582</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; CaCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A2303</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; MgCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3618</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; HEPES</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3724</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:248px;">Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">A-7816</td>
			<td style="width:261px;">Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF-M</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Model: DMI6000B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF objective</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">11 506 249&#160;</td>
			<td style="width:261px;">HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">EM-CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Photometrics Cascade 512B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:248px;">Pecon</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:248px;">NIH, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">u-track software</td>
			<td style="width:248px;">Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Matlab software</td>
			<td style="width:248px;">The MathWorks, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution spatiotemporal analysis of receptor dynamics by single-molecule fluorescence microscopy

Tek molekül mikroskopi bu yönünü (örneğin., Kinetik, farklı devletler ve toplumlarda, geçici etkileşimler birlikteliği), genellikle topluluk ölçümleri gizlidir, gibi ilgili özellikle, sinyal molekülleri davranışını analiz etmek için güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır standart biyokimyasal veya mikroskopi yöntemleri ile elde edilen. Bu nedenle, böyle bir reseptör-reseptör etkileşimleri gibi dinamik olaylar, yüksek uzaysal çözünürlüklü bir canlı hücrede gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Bu protokol küçük ve parlak bir organik florofor ve doğrudan canlı hücre yüzeyi üzerinde bir reseptörleri görselleştirmek için toplam iç yansıma flüoresans (TIRF) mikroskopisi ile etiketleme göre bir yöntem tarif edilir. Bu yaklaşım, bir tam, reseptörleri lokalize reseptör komplekslerinin boyutunu ölçmek ve bu geçici reseptör-reseptör etkileşimleri gibi dinamik olayları yakalamak için izin verir. Protokol pe nasıl ayrıntılı bir açıklamasını sağlarnumune hazırlama, görüntü elde etme ve görüntü analizi de dahil olmak üzere, tek bir molekül deney, rform. Bir örnek olarak, bu yöntemin uygulanması, iki G-proteinine kenetlenmiş reseptörlerin analiz etmek için, yani., 2-adrenerjik ve γ-aminobütirik asit tipi B (GABA B) reseptörü β, bildirilir. Protokol başka zar proteinleri ve farklı hücre modellerinde, transfeksiyon yöntemleri ve etiketleme stratejileri adapte edilebilir.

Açıklanan protokol, farklı zar proteinlerinin çeşitli uygulanabilir. Bir örnek olarak, β-2 adrenerjik ve GABA B reseptörleri ile elde edilen sonuçlar Örnek 10, rapor edilmiştir. Tek moleküllerin floresan sinyaller zayıf olduğu için, eşiğe minimizasyonu başarılı sonuçlar için ilk önemli adımdır. Bu nedenle, geniş bir temizlenmiş lamelleri (Şekil 2A) kullanımı yanı sıra örnek otoflüoresanı (örn.., Fenol kırmızısız ortamını...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy at JoVE.com

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Görüntüleme.  University of Würzburg, Germany. This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins. 

Video: High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Biyomühendislik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...