Bu eser Jackson Laboratory başlangıç ​​fonları tarafından desteklenmektedir.

1. Nöronal Kültür İklimlendirme için Fare Glia Kültür hazırlanması <ol><li> T75 şişeler kolajen çözeltisi (GKD 2 O Purecol arasında 1:03 seyreltme) ile kaplanır. Şişeleri dik ayarlanır ve bir doku kültürü kaputu gecede kurumaya bırakılır. </li><li> Diseksiyon tamponu (aCSF: 119 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 30 mM glukoz, 25 mM HEPES, kalsiyum olmadan pH 7.4) ve glia ortamı (DMEM% 10 FBS, 10 birim / ml penisilin, 10 ile desteklenmiş ug / ml streptomisin, ve Glutamax) ° C Kullanım için hazır olana kadar hazırlanmış ve 4 depolanır. </li><li> Glia kültür gününde, glia medya fare beyin teşrih önce 37 ° C su banyosu içinde en az 30 dakika için ısıtılır. Embriyonik veya yenidoğan farelerin hızla dekapitasyon tarafından ötenazi uygulanır. Serebral kortekste bir diseksiyon mikroskobu altında diseke edilir. </li><li> Dissected beyin dokuları 37 ° papain çözeltisi (100 mi, papain ve 2 ml disseksiyon tampon içinde 20 ul% 1 DNase I) &#39;de sindirilir ° C for 20 dk. </li><li> Papain sindirimi takiben beyin dokuları 10 ml önceden ısıtılmış glia ortamı ile çalkalanır. Taze glia ortamı (2 ml), sonra sindirilmiş beyin dokusu ilave edilir ve dokular bir ateş cilalı Pastör pipeti ile cam tritüre edilir. </li><li> Taze glia ortamı (8 ml) ayrışmış dokulara ilave edilir. A 70 mikron hücre-süzgeç ayrışmış doku süspansiyonu filtrelemek için kullanılır. Hücreler daha sonra T75 matara (genellikle 2-3 embriyolar yapabilirsiniz tohumun T75 balonuna) içine ekilmiş ve 37 ° C hücre kültürü inkübatör yerleştirilir. </li><li> Ertesi gün, T75 şişelerinden alınmış ortamı aspire edilir. Şişeler, 10 ml PBS ile durulanır. Taze glia ortamı (10-15 ml) daha sonra her bir balona ilave edilir. </li><li> 10-12 gün içinde, T75 şişeler glia confluent olmalıdır. Glial hücreler, PBS ile yıkanır, ve% 0.05 tripsin, 5 ml T75 her bir şişeye ilave edilir. </li><li> 5 dakika 37 ° C de tripsin inkübasyondan sonra, glial hücreler her T75 şişesi ayrılmış ve glial hücreler ikiye ayrılırFarklı kollajen kaplı T75 matara. </li><li> Kültür uçlar (Millipore PICM03050) 6-well plate, kolajen ile kaplanmadan, ve bir gece boyunca hava-kurutma yerleştirerek hazırlanır. Glia ortamı (2 ml her biri) her bir kültür elemanı altına yerleştirilir. </li><li> Konfluent T75 flasks Glia tripsinize ve (6 plaka başına bir T75 şişesi, 2 ml her ekleme) kültürü ekler üzerine numaralı seribaşı. Bunlar, glia kültür ekleri durum nöronal kültürler için kullanılır. </li></ol> 2. Nöronal Kültür <ol><li> Nöronal kültürü için cam lameller% 70 en az gecede HNO 3 iliklerine tarafından temizlenir. Lameller sonra GKD 2 O en az 3 kez suyla yıkandı, ve (&gt; 200 ° C) bir karışımı, bir Isotemp fırın içinde kurutulmuştur. </li><li> Temizlenmiş lamelleri 6-kuyu plakası, çukur başına bir lamel yerleştirilir. Lameller poli-L-Lizin çözeltisi (100 mM borik asit, 2 mi,% 0.1, pH = 8.5) 37 ° C inkübatör içinde gece boyunca kaplanmıştır. </li><li>poli-L-Lizin çözeltisi lamelleri kaldırılır ve lamelleri otoklavlanmış GKD 2 O ile 3 kez yıkanır Lameller sonra bir 37 içinde inkübe edilir (Neurobasal% 5 ısı ile inaktive edilmiş at serumu, 10 birim / ml penisilin, 10 ug / ml streptomisin ile takviye Glutamax kaplama ortam içinde gece boyunca ° C inkübatör; kaplama ortam ilave edilir% 2 B27 eki gününde) kullanılır. </li><li> B-27 ile bir sonraki gün, ortam kaplama çıkarılır ve taze kaplama ortam, 2 ml bir cam lamel olan her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> Hamile farelere (E15-18) CO 2 ile ötenazi, ve embriyonik fare dekapitasyon tarafından ötenazi uygulanır. Hipokampus ve striatum beyin dokusundan elde parçalara ayrıldı ve sırasıyla hipokampal nöronlar, orta ya da striatal nöronların dikenli kültür için buz gibi soğuk tampon disseksiyon, birlikte 15 ml konik bir tüp içine yerleştirilir. </li><li> Adımlar 1.4) ve 1.5) &#39;deki gibi parçalanmış, beyin dokuları, papain ile ayrılmış bulunmaktadır. </li><li> Fdisosiyasyon ollowing, her nöron süspansiyon hücrelerinin sayısını hemasitometre ile sayılır. Nöronlar, daha sonra bir 6-plaka başına 0.4 x da 10 6 hücre bir yoğunlukta her bir lamel üzerine ekildi ve bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde gece boyunca kültürlenmiştir (nöronlar DIV 0 dır). </li><li> Klima nöronal kültürler için glia kültür ekleri hazırlamak için, glia medya glia kültürü ekler çıkarılır ve taze ortam kaplama (insert altında ekleme ve 2 ml 2 ml) ilave edilir. </li><li> Ertesi gün (DIV 1), nöronlar ile lamelleri glia kültürü ekler, her iyi bir lamel altına yerleştirilir. </li><li> Bunlar transfeksiyon deneyleri ve görüntüleme için hazır olana kadar Nöronlar, taze önceden ısıtılmış beslenme ortamı (B-27) ile her 3-4 günde yarım hacim ile beslenir. </li></ol> 3. Transfeksiyon <ol><li> Nöronal transfeksiyon lipofektamin 2000 kullanılarak yapılır. Her nöron kültürü için (lamel başına bir kültürü), 2 ulLipofektamin 2000 ve DNA 1 ug kullanılır. Herhangi bir ek ile taze Neurobasal orta lipofektamin ve DNA sulandırmak için kullanılır. </li><li> DNA ve lipofektamin karıştırıldıktan sonra, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı. </li><li> Her ekleme içeriden her glia kültür elemanı alttan medyanın 1 ml ve 1 ml Kaydet ve konik tüp medya aktarın. 37 kaydedilen orta ve inkübe ° C. besleme medya aynı hacimde + B27 ekle Bu ortam, aşağıdaki transfeksiyon nöronal kültürü için kullanılmıştır. </li><li> 20 dk lipofektamin / DNA inkübasyon sonrasında, kültür glia uçlar 6 oyuklu plakalar arasında geçici kaldırılır. 200 ul lipofektamin / DNA karışım nöronları ile her bir lamel eklenir. Glia kültürü ekler sonra nöronlar üzerinde, her bir kuyucuğa döndürülür. Kültür uçların membranı altında kabarcıklarının üretilmesi kaçınılmalıdır. Nöronlar, 2-4 saat süre ile 37 ° C &#39;de lipofektamin / DNA karışımı ile inkübe edilir. </li><li> Inci sonrae 2-4 saat inkübasyon dönemi, glia ekler tekrar kaldırılır. Lipofektamin / DNA karışımı ile kültür ortamı her kuyuya kaldırılır. Adım 3.3) içinde kaydedilmiş medya nöronlar (2 ml kuyu başına) ilave edilir. Glia kültürü ekler her bir kuyucuğa iade edilir ve her bir ucunun glia ortam çıkarılır, ve adım 3.3), ortam, 2 ml her ekleme içine ilave edilir. </li><li> Nöronlar TIRF görüntüleme önce transfekte edilmiş cDNA ifade bu nöronlar üzerinde gerçekleştirilir izin vermek için ek 24-72 saat için kültürlenmiştir. </li></ol> 4. TIRF Görüntüleme <ol><li> Yapay serebrospinal akışkan (aCSF: 119 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 30 mM glukoz, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH = 7.4), canlı-görüntüleme deneyleri için kullanılacaktır. Bizim TIRF görüntüleme sistemi uyarılması için 100 mW Mavi lazer ile özel set-up ve Elektron çarpımı Şarj bir dedektör için Aygıt (EMCCD) kamera Coupled. </li><li> Görüntüleme deneyleri öncesinde aCSF 37 &amp; d uyarılırörneğin; en az 30 dakika süreyle C su banyosu. Canlı görüntüleme için ısıtma elemanı mikroskop sahne üzerine yerleştirilir ve ısıtma elemanı, lazer, kamera ve görüntü deneylerin başlamasından önce en azından 30 dakika için ısındı. </li><li> Transfekte nöronlar olan bir lamel canlı görüntüleme odasının içine monte edilir. Odasına monte edildikten sonra önceden ısıtılmış aCSF odasına yerleştirilir; bu aşamada mümkün olduğu kadar çabuk tamamlanması gerekmektedir. </li><li> Odanın mikroskop sahnede ısıtma elemanı yerleştirildikten sonra, transfekte nöronlar görsel epi-floresan görüntüleme modu altında tanımlanır. </li><li> Transfekte sağlıklı nöron (Şekil 1 ve 2 ye bakınız) tespit edildikten sonra plazma membranı üzerinde pHluorin-reseptör çok yüksek floresans seviyelerini zaman olduğu gibi, genellikle, plazma membranı üzerinde önceden mevcut olan pHluorin floresan ortadan kaldırmak için foto-ağartıcı 1 dakika gerçekleştirmek TIRF görüntüleme ilk başlatıldığında, hangi bireysel ins görselleştirme müdahaleertion olaylar. </li><li> Photobleach ardından EMCCD kamera elektron çoğaltıcı kazancı ayarını maksimum ayarlanır ve kayıt 10 Hz&#39;de 1 dakika süreyle yapılır. </li><li> Her kayıt 600 görüntüleri içerecektir. Bireysel ekleme olaylar ImageJ kullanarak kayıt oynatırken ile tanımlanır. Bireysel ekleme olaylar elle ImageJ kullanılarak analiz edilmektedir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Tutarlı nöronal kültürü başarılı canlı görüntüleme deneyleri için anahtardır. Şekil 1 fare hipokampal nöronlar 18 div DIV 11 bizim protokolü kullanılarak kültüre gösterir. Bu nöronlar kapsamlı süreçler gelişmiş ve ettiğinizi görüntülerden dendritik süreçleri dendritik dikenler, bu nöronların kültüründe sağlıklı olduğuna dair göstergeler ile yoğun kaplıdır açıktır. Bizim kültür protokolü de beyin nöron diğer tipleri de kullanılabilir. Örneğin, son zamanlarda kültür için bu protokolü kullanılırkültürlü fare striatal orta dikenli nöronlar 9 dopamin D2 reseptör (DRD2) ekleme incelemek üzere bir çalışma striatal orta dikenli nöronlar. Şekil 2 fare striatal orta dikenli nöronlar DIV 8 bizim protokolü kullanılarak kültüre gösterir. Biz de başarıyla nöron bu tip superecliptic pHluorin-etiketli DRD2s arasında TIRF görüntüleme gerçekleştirdik. Şekil 3 ifadesini gösterir pHluorin-etiketli bu nöron içinde pH DRD2 ekleme bir orta dikenli nöron ve görselleştirme DRD2 (pH-DRD2). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Arabirim kültür yöntemi kullanılarak Şekil 1. Fare hipokampal kültürü. DIV: In vitro gün, kültür gün DIV 0 olduğu kabul edilir. Görüntüleri bakıldığında, açıktır ki DIV 11 ve DIV 15 arasındaki kültür bu tip olgun hipokampal nöronlar. DIV 11 ve 13 yaşındayken, nöronal dendritler filipodia ve olgunlaşmamış dikenlerle kaplıdır. DIV 15 ve At18, nöronal dendritler, büyük dikenler daha olgun nöronların bir göstergesi kaplıdır. Sol panel: Düşük büyütme farklı yaşlarda fare hipokampal nöronlar görüntüleri. Sağ panel: yüksek büyütmeli görüntü (sol panel nöronal dendritler üzerinde yakınlaştırma) farklı yaşlarda dendritik dikenler nöronal dendritik süreçleri. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Arabirimi kültürü yöntemi kullanılarak Şekil 2. Fare striatal orta dikenli nöron kültürü. Görüntülerdeki Nöronlar DIV 8 altındadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Şekil 3,. Süper ekliptik pHluorin-etiketli dopamin D2 reseptörü (pH-DRD2) ile transfekte edilmiş bir fare striatal orta dikenli nöron. Soldaki görüntü bir time-lapse kayıt maksimum intensite projeksiyon (600 fotoğraf, görüntü başına 100 msn) &#39;dir. Beyaz ok uçları pH-D bireysel vesiküler ekleme belirtmekRD2. Bu görüntü xy boyut ekleme bilgilerini korur, ama zaman bilgilerini kaybeder. Sağdaki Resim xyt yığını y-ekseni etrafında 90 derece döndürülür ve her x ekseni hattında maksimum piksel tek bir y ekseni piksel yansıtılıyor olduğu, yt maksimum intensite projeksiyon gösterir. Bu görüntü yt ekseni boyunca ekleme bilgilerini korur, ama x-ekseni bilgileri kaybeder.

<ol>
	<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li><li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA.">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li><li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK.">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li><li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+(GluR2)+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization.">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li><li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites.">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li><li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N,+phosphorylation.">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li><li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor.">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li><li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion.">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane.">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li><li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li><li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li><li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses.">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience.">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li><li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity.">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors.">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bilinmeyen nedenlerden ötürü, fare nöronları zaman sıçan nöronlar daha kültürünün daha zordur. Bizim tecrübelerimize göre, nöronlar ve glia karışık kültürü birincil kültürlü fare nöronları için iyi çalışır. Nöronal somata ve TIRF mikroskopi ulaşamayacağımız dendritik süreçleri diyorum, glia hücreleri üstüne büyürler kültürü nöronlar ve bunların süreçleri bu tür Ancak, böyle bir karma kültür, TIRF görüntüleme deneyler için uygun değildir. Bu nedenle, lamel az gli...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktifi&gt; İsim</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog Numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Saflaştırılmış sığır kollajen çözüm (Purecol)</td&gt;<td&gt; Gelişmiş Biyo</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penisilin streptomisin (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodyum piruvat</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM Yüksek Glikoz</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fetal bovin serumu (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papain</td&gt;<td&gt; Worthington Biyokimyasal Corp</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdSığır pankreas&gt; deoksiribonükleaz I (DNaz I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbecco Fosfat (DPBS) Tamponlu Salin</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;% 0.05 tripsin</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-L-lisin hidrobromür</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borik asit</td&gt;<td&gt; Fisher-Bilimsel</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal Orta</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 Serum-Free Ek</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isı inaktif at serumu</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofektamin 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher-Bilimsel</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kültür Ekle</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons

Plazma membranı (PM) ve hücre içi bölmeleri arasındaki reseptör ticareti düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle deneysel bir yaklaşım gerektirir. Dahası, böyle bir yaklaşım, aynı zamanda hücre içi bölmelerde olanlardan ÖS lokalize reseptörler ayırt etmek yeteneğine sahip olmalıdır. Her bir vesikül reseptörlerinin sadece küçük bir bölümü taşıyan beri En önemlisi, tek bir vesikül reseptörleri tespit olağanüstü saptama hassasiyet gerektirir. Ve hücrelerin kimyasal sabitleme gerektirir immunolabeled yüzey reseptörleri, floresan mikroskop incelemesi ve bu nedenle yeterli zamansal çözünürlük 1-6 yoksun; reseptör ticareti incelemek için standart yaklaşımlar gerekli mekansal ve zamansal çözünürlükleri de yoksun biyokimyasal algılama, ardından yüzey biyotinilasyon içerir. Bu sınırlamaları aşmak için, biz ve diğerleri geliştirdi ve yeni bir stra istihdam var7-17 mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle PM içine reseptörlerinin dinamik ekleme görselleştirme sağlayan tegy olduğunu. Yaklaşım reseptörlerinin N-terminal hücre dışı etki alanına bir pH-duyarlı GFP, superecliptic pHluorin 18, bir etiketleme içerir. Superecliptic pHluorin asidik pH nötr pH ve floresan olmayan (pH &lt;6.0) Flüoresan olmanın kendine has bir özelliği vardır. Bu nedenle, etiketli reseptör olmayan floresan zaman hücre içi veziküller ticareti ya da endozomal bölmelere bir asidik lümen içinde ve bunlar PM dış yüzeyi üzerinde, hücre dışı nötr pH ortamına maruz yalnızca kolaylıkla görselleştirilebilir hale gelir. Bizim stratejimiz dolayısıyla bize intraselüler kaçakçılığı veziküller içinde olanlardan PM yüzey reseptörleri ayırt etmenizi sağlar. Yeterli uzamsal ve zamansal çözünürlükleri, hem de reseptör dinamik çalışma ticareti için gerekli olan duyarlılık elde etmek için, kullanılan yansıtmak iç toplamBizi optik görüntüleme (~ 170 nm) iyi uzaysal çözünürlüğü elde etmek için etkin iyon floresan mikroskobu (TIRFM), video-oranı mikroskobu (30 kare / sn) ve duyarlılık zamansal çözünürlük tek GFP floresan tespit etmek molekülü. Görüntüleme By TIRFM altında reseptörleri, biz doğrudan bireysel reseptör ekleme olayların kültürü nöronlarında PM içine görselleştirmek başardık pHluorin etiketli. Bu görüntüleme yaklaşımı potansiyel superecliptic pHluorin ile etiketlenmiş edilebilir bir hücre dışı alanı ile herhangi bir zar proteini için uygulanabilir, ve farklı zar proteinleri (reseptörler, iyon kanalları, vs) yerleştirilmesi için yöneten kilit mekanizmasının detaylı bir teşrih izin verecektir PM.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Görüntüleme.  The Jackson Laboratory. Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.

Video: Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...